微粒体ω6油酸去饱和酶

摘要

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地是麻风树微粒体ω6油酸去饱和酶。本发明还涉及麻风树植物或其他油料作物植物，其具有单饱和和多不饱和脂肪比率不同的种子。特别地，本发明涉及麻风树植物或其他油料作物植物，其中所述植物显示升高的油酸水平。

说明书

相关申请交叉引用

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发明背景

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地是麻风树微粒体ω6油酸去 饱和酶。本发明还涉及麻风树植物或其他油料作物植物，其具有单饱和和 多不饱和脂肪比率不同的种子。特别地，本发明涉及麻风树植物或其他油 料作物植物，其中所述植物显示升高的油酸水平。

本文中用以说明本发明背景的出版物和其他材料，以及特别地，提供 关于实践的额外细节的实例以引用的方式纳入。为方便起见在下面文本中 按作者和日期引用，并在所附文献目录中按作者字母顺序列出。

植物油有许多种不同的应用。需要生物合成或天然植物来源的新的植 物油组合物和获得油组合物的改进的方法。根据所预期的油的用途，需要 多种不同的脂肪酸组合物。植物，特别是在种子中合成大量油类的种类， 是用于食用和工业用途的油类的重要来源(Lu等人；Durrett等人，2008)。

植物油的一个主要用途是用于食品。植物油大多由五种常见脂肪酸组 成，即棕榈酸(16：0)、硬脂酸(18：0)、油酸(18：1)、亚油酸(18：2)和亚麻酸 (18：3)(Durrett等人，2008)。油酸是在多种植物油中发现的ω-9单不饱和18 碳脂肪酸，其被认为是食物来源中对于人和动物更健康的油类和脂肪的来 源。饮食中摄入油酸含量高的油类已经被证明能下调慢性人类疾病如胆固 醇、动脉硬化和心血管疾病的总体水平。确切地说，已经显示油酸能够升 高被称为“好胆固醇”的高密度脂蛋白(HDL)的水平，同时降低也被称为“坏” 胆固醇的低密度脂蛋白(LDL)。因此，需要开发包含更健康脂肪酸形式的新 的并且廉价的食物来源。

油类的一个新兴用途是以生物柴油形式用作可再生生物能源的原料。 生物柴油主要来自植物油，其应用的需求已经随着替代燃料的政府补贴和 授权而飙升。每种类型脂肪酸的不同组成决定了源自脂肪酸混合物的生物 柴油的燃料特性。相比常规柴油，脂肪酸谱有一些不利因素，应通过传统 育种或基因工程来优化这些不利因素以优化生物柴油的燃料特性。多项研 究表明在点火质量、NO_X排放和燃料稳定性方面，具有高水平油酸甲酯的 生物柴油具有优秀的特性。例如，尽管不饱和倾向于降低生物柴油的十六 烷值，油酸甲酯的该值高于最小的生物柴油标准。此外，估计每分子平均 有1.5个双键的生物柴油燃料将排放与常规柴油相比等量的NO_X，因此高 油酸燃料不会导致较高的NO_X排放。最后，考虑到多不饱和脂肪酸对生物 柴油自氧化起主要作用，油酸含量高而多不饱和脂肪酸含量降低将改进燃 料的稳定性(Durrett等人，2008)。

使用导致脂肪酸去饱和酶2(FAD2)单基因下调的转基因策略，已经开 发了具有高水平的油酸以及低水平的饱和和多不饱和脂肪酸的大豆品系。 与预期一致，从这些高油酸大豆合成的生物柴油在低温流动特性和NO_X排 放方面显示了更好的燃料特性(Tat等人，2007；Graef等人，2009)。

在过去数年间，许多国家已经开始将生物燃料研究列为国家优先事项 并且执行化石燃料和生物燃料的强制混合。然而，由于燃料作物和食物作 物间对耕地的竞争，对生物燃料不断增加的需求正在对食物生产施加更大 的压力。缓解该竞争的一个途径是使用边际土地进行生物能源生产(Carroll 和Somerville，2008)。

属于大戟科的小木本植物麻风树(Jatropha curcas)，是主要生长在热带 和亚热带地区的非食物作物。该植物具有一些使其适用于生物柴油生产的 特性，如其生长迅速，易于繁殖，孕育期短(short gestation period)，种子成 本低，油含量高，适应性广以及耐旱(Jones N，1991；Fairless，2007)。此外， 麻风树每公顷可以生产的燃料超过大豆的四倍，超过玉米的十倍 (http：／／en.wikipedia.org／wiki／Jatropha_oil)。特别重要的是麻风树能在退化土 壤上健旺生长(Fairless，2007)。因为可以大规模种植在不适合食物作物的边 际土地上这使其成为有吸引力的生物柴油原料作物。

植物通过被称为脂肪酸合酶(FAS)途径的通用代谢途径来合成脂肪酸。 β-酮脂酰-ACP(酰基载体蛋白基)合酶是植物细胞FAS中重要的限速酶并以 多种形式存在。β-酮脂酰-ACP合酶I催化链延伸至棕榈酰-ACP(C16：0)，而 β-酮脂酰-ACP合酶II催化链延伸至硬脂酰-ACP(C18：0)。β-酮脂酰-ACP合 酶IV是β-酮脂酰-ACP合酶II的变体，其也可以催化链延伸至18：0-ACP。 在大豆中，FAS的主要产物是16：0-ACP和18：0-ACP。18：0-ACP去饱和以 形成18：1-ACP是由位于质体的可溶性δ-9去饱和酶(也被称为“硬脂酰-ACP 去饱和酶”)催化。

质体FAS和δ-9去饱和酶的产物，16：0-ACP、18：0-ACP和18：1-ACP 由特定的硫酯酶水解。基于序列同源性和底物偏好性，植物硫酯酶可以被 分类为两个基因家族。第一家族FATA包括长链酰基-ACP硫酯酶，其具有 主要对18：1-ACP的活性。第二家族FATB的酶通常利用16：0-ACP(棕榈酰 -ACP)、18：0-ACP(硬脂酰-ACP)和18：1-ACP(油酰-ACP)。这样的硫酯酶对植 物从头生物合成脂肪酸期间链长度的确定具有重要作用，因此这些酶可用 于提供脂肪酰组成的各种修饰，特别是在存在于种子储备油中各种脂肪酰 基团的相对比例方面。

FATA和FATB反应的产物游离脂肪酸离开质体并被转化为其各自的酰 基-CoA酯。酰基-CoAs是位于内质网(ER)上的脂质生物合成途径(肯尼迪途 径)的底物。该途径负责膜脂形成以及构成种子油的三酰基甘油的生物合成。 在ER中有额外的膜结合型去饱和酶，其可以进一步将18：1去饱和为多不 饱和脂肪酸。

在大豆植物中生成中到高油酸水平的多种技术是已知的。例如，美国 专利公开号2007／0214516公开了获得油酸水平适度增加的大豆植物的方 法。

发明内容

本发明涉及基因、编码序列、其他序列、构建体和载体，其可以被用 于提供一种方法，以从麻风树种子油中约40％的油酸初始水平产生和选择 含约80％油酸的高油酸品系。本文中描述的基因、编码序列、其他序列、 构建体和载体显示了将增强的油质量性状有效整合入麻风树优良品种而无 需传统麻风树育种中所用的昂贵的杂交和评估的能力。

麻风树基因组具有两个微粒体ω6油酸去饱和酶，被称为JcFAD2-1和 JcFAD2-2。鉴定到两个cDNA，其编码383个氨基酸(SEQ ID NO：2)和387 个氨基酸(SEQ ID NO：5)的蛋白质，两种蛋白质彼此相同性为74％，与拟南 芥FAD2相同性分别为77.3％和72.1％。与FAD2酶家族有较高序列相同性 的cDNA被称为JcFAD2-1，另一种被命名为JcFAD2-2。FAD2-1和FAD2-2 发现于ER中，在此处其可以进一步将油酸去饱和为多不饱和脂肪酸。δ-12 去饱和酶催化向油酸(18：1)中插入双键以形成亚油酸(18：2)，这导致油酸水平 随之降低。δ-15去饱和酶(FADS)催化向亚油酸(18：2)中插入双键，形成亚麻 酸(18：3)。

为产生无选择标记的转基因麻风树，测试了Zuo J等人在拟南芥中最先 开发的(Zuo等人2001)化学诱导的Cre-loxP介导的位点特异性重组系统。使 JcFAD2-1沉默，以制备高油酸和无标记转基因麻风树。采用像上面类似的 转化步骤，以得到潮霉素抗性的再生芽(参见WO2010／071608，其以引用方 式整体纳入本文)。一旦有可见的芽出现，我们将小芽转至无潮霉素的无标 记诱导培养基中。诱导两周之后，这些生长良好的芽随后被转入无潮霉素 的再生培养基II中。剩余步骤与上面正常的转化步骤相同。

为增加油酸水平并降低意外的环境适应风险，使用种子特异启动子， 以在麻风树中产生特异性高油酸的种子。选择大豆(Glycine max)种子储藏蛋 白7S种子特异型启动子以驱动hpRNA表达，下调JcFAD2-1RNA。发现两 个品系的T1代胚乳中含77.4％和74.7％油酸。在这些品系中亚油酸水平降 低至小于总脂肪酸的5％。

附图简述

图1A和1B显示了麻风树中脂肪酸去饱和酶的氨基酸组成(分别为SEQ  ID NO：2和SEQ ID NO：5)。

图2A和2B显示了来自植物的脂肪酸去饱和酶氨基酸序列的比较(图 2A)和多种基因表达模式间的比较(图2B)。序列如下：AtFAD2：SEQ ID  NO：7；RcFAD2：SEQ ID NO：8；RcFAH12：SEQ ID NO：9；JcFAD2：SEQ ID  NO：2；JcFAD2-2：SEQ ID NO：5；VfFAD2：SEQ ID NO：10和VfFAX：SEQ  ID NO：11。

图3A-3C显示了转化培养基中β-雌二醇介导的Cre-Lox无标记系统。 图3A：高油酸的沉默盒和β-雌二醇诱导的DNA切除的示意图。尺寸条 ＝1kb。图3B：初始转基因芽#1-1和#1—2的基因分型分析。图3C：初始转 基因芽#1—1和#1-2的GC分析。

图4A和4B显示了X7-JcFAD2-1RNAi(A)和X8-JcFAD2—1RNAi(B)的 基因分型。图4A：上面的DNA胶显示了X7-JcFAD2-1RNAi品系1-26用 潮霉素抗性基因引物对(hpt)进行基因分型的一个结果。下面的DNA胶显示 了品系1—26用无标记引物对(P1+P4)的部分结果。注：*表示一株植物中同 时具有无标记和标记的嵌合体的一个实例品系。**表示完全无标记的一个 实例品系。图4B：上面的DNA胶显示了X8-JcFAD2—1RNAi品系25-49用 潮霉素抗性基因引物对(hpt)进行基因分型的一个结果。下面的DNA胶显示 了品系25-49用无标记引物对(P7S+P4)的部分结果。注：*表示一株植物中 同时具有无标记和标记的嵌合体的一个实例品系(X8#34)。

图5A-5C显示X7-JcFAD2-1RNAi品系的分子和油类组成分析。图5A： #79和#170品系的T1胚乳中的RNA分析。图5B：#79和#170的T1叶中 的RNA分析。图5C：显示X7-JcFAD2—1RNAi品系中适度脂肪酸组成变化 的GC分析，以35S：GFP的T1种子作为对照。

图6A-6F显示具有大豆7S种子特异型启动子的较高油酸转基因品系。 图6A：#34和#291品系的T1胚乳中的分析。图6B：#34和#291品系的T1 子叶中的RNA分析。图6C：#34和#291品系的T1真叶中的RNA分析。 图6D：#34和#291品系的胚乳中的油类含量分析。图6E：显示X8-JcFAD2—1 RNAi品系中脂肪酸组成变化的GC分析，以35S：GFP的T1种子作为对照。 图6F：显示在T1真叶中无明显脂肪酸谱变化的GC分析。

图7A-7C显示了对来自X8-FAD2—1RNAi品系的初始和T1植物的 Southern印迹分析。图7A：显示了含JcFAD2—1的EcoRV酶切片段。图7B： 全基因组DNA以XhoI消化并以大豆7S启动子为探针检测。*表示含标记 的阳性基因组条带。**表示无标记的阳性基因组条带。图7C：在左图中， 全基因组DNA以EcoRV和XbaI消化并以FAD2—1开放阅读框(ORF)为探针 检测，而在右图中，剥离同一膜上的探针并以hpt ORF为探针检测。

发明详述

除非另有定义，本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属 领域技术人员通常所理解的相同的含义。

本文中所用的“等位基因”是指一个基因座位的一种或多种可选形式中 的任何一种，所有这些等位基因与一个特点或特征相关。在二倍体细胞或 生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的对应座位。

本文中所用的“FAD2”是指一个基因或其所编码的蛋白质，该蛋白质能 催化在从羧基末端数第12位置处向脂肪酰基插入双键。FAD2蛋白也被称 为“δ-12去饱和酶”或“ω-6去饱和酶”。术语“FAD2—1”用于指如图1A中的 序列(SEQ ID NO：2)、SEQ ID NO：1中的ORF序列或者全基因组序列SEQ ID  NO：3中所示编码序列所定义的FAD2基因或蛋白，其在多种组织中天然表 达，包括种子偏好模型。术语“FAD2-2”用于指如图1B(SEQ ID NO：5)、SEQ  ID NO：4中ORF序列或者全基因组序列SEQ ID NO：6中所示编码序列所定 义的FAD2基因或蛋白质，其是(a)与FAD2-1基因或蛋白质不同的基因并且 (b)是种子特异性表达的。

本文中所用的“基因”是指核酸序列，其包括与基因产物的表达关联的5’ 启动子区域、任何内含子和外显子区域以及与基因产物的表达关联的3’或 5’非翻译区域。

本文中所用的“基因型”是指细胞或有机体的基因组成。

本文中所用的“表型”是指细胞或有机体的可检测特征，这些特征是基因 表达的体现。

“脂肪酸”是通常具有长的不分枝脂肪族碳链的羧酸。名称(18；2)，(18：1)， (18：3)等分别指脂肪酸链中的碳原子数和其中的双键数。例如油酸(18：1)含 18个碳原子和1个双键。

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地是麻风树微粒体ω6油酸去 饱和酶。本发明还涉及麻风树植物或其他油料作物植物，其具有单饱和和 多不饱和脂肪比率不同的种子。特别地，本发明涉及麻风树植物或其他油 料作物植物，其中所述植物显示升高的油酸水平。

因此，在第一方面中，本发明提供了编码JcFAD2-1蛋白的分离的核酸， 该蛋白包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，该核 酸包含SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。在另一个实施方式中，该核酸 包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列。在进一步的实施方式中，核酸进 一步包含与编码序列可操作连接的植物可操作启动子。在一个实施方式中， 启动子为种子特异型启动子。在另一个实施方式中，种子特异型启动子源 自油料作物。

在第二方面，本发明提供了编码JcFAD2-2蛋白的分离的核酸，该蛋白 包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，该核酸包含 SEQ ID NO：4中所示的核苷酸序列。在另一个实施方式中，该核酸包含SEQ  ID NO：6中所示的核苷酸序列。在进一步的实施方式中，核酸进一步包含与 编码序列可操作连接的植物可操作启动子。在一个实施方式中，启动子为 种子特异型启动子。在另一个实施方式中，种子特异型启动子源自油料作 物。

在第三方面中，本发明提供了包含本文中所述分离的核酸的构建体或 载体。在一个实施方式中，构建体或载体是表达构建体或载体。在另一个 实施方式中，构建体或载体进一步包含选择性标记。在进一步的实施方式 中，构建体或载体包含Cre-lox无标记重组系统。

在第四方面中，本发明提供了包含本文中所述核酸或载体的转基因植 物。在一个实施方式中，转基因植物可以是任何植物种类，在另一个实施 方式中，转基因植物可以是油料作物。在进一步的实施方式中，转基因植 物可以是麻风树植物。

在第五方面中，本发明提供使用RNA干扰(RNAi)，包括microRNA和 发夹RNA，而使JcFAD2—1和／或JcFAD2-2基因下调。在一个实施方式中， 提供了下调JcFAD2—1基因的核酸。在另一个实施方式中，提供了下调 JcFAD2-2基因的核酸。在进一步的实施方式中，提供了下调JcFAD2-1基 因的核酸，并且提供了下调JcFAD2-2基因的核酸。在一个实施方式中，核 酸进一步包含与编码序列可操作连接的植物可操作启动子。在一个实施方 式中，启动子为种子特异型启动子。在另一个实施方式中，种子特异型启 动子源自油料作物。根据该方面，本发明还提供了包含本文中所述分离的 核酸的载体。在一个实施方式中，载体是表达载体。在另一个实施方式中， 载体进一步包含选择性标记。在进一步的实施方式中，载体包含Cre-lox无 标记重组系统。根据该方面，本发明进一步提供了包含本文中所述核酸或 载体的转基因植物。在一个实施方式中，转基因植物可以是任何植物种类。 在另一个实施方式中，转基因植物可以是油料作物。在另外的实施方式中， 转基因植物可以是蓖麻植物。在进一步的实施方式中，转基因植物可以是 麻风树植物。在一个实施方式中，转基因麻风树植物的种子具有大于50％， 优选大于60％，更优选大于70％，最优选大于75％的油酸含量。在另一个 实施方式中，转基因麻风树植物的种子具有小于5％的亚油酸含量。

根据该第五方面，选择核酸以抑制植物组织中天然DNA的表达来得到 期望表型。在这种情况下，完成这样的抑制是，例如，通过转化植物细胞 以使其包含与反义核苷酸序列、发夹、RNA干扰分子、双链RNA、microRNA 或其他核酸分子相连的启动子，以使分子的组织偏好性表达干扰天然DNA 序列的mRNA翻译或者以其他方式抑制植物细胞中天然DNA序列的表达。 对RNAi技术或microRNA技术的进一步描述参见例如美国专利号 5,034,323、6,326,527、6,452,067、6,573,099、6,753,139和6,777,588。还可 参见国际专利公开WO97／01952、WO98／36083、WO98／53083、WO 99／32619和WO01／75164以及美国专利公开2003／0175965、2003／0175783、 2003／0180945、2004／0214330、2005／0244858、2005／0277610、2006／0130176、 2007／0265220、2008／0313773、2009／0094711、2009／0215860、2009／0308041、 2010／0058498和2011／0091975。本文中描述了RNAi分子的一个实例。然 而，本发明不限于该单独的实例。技术人员可以使用本领域公知的技术来 制备另外的RNAi分子或microRNA分子，这些技术包括选择和测试可用于 下调JcFAD2-1和／或JcFAD2-2基因的RNAi分子或microRNA分子的技术。

构建体通常包括与本文中所述核酸(编码JcFAD2蛋白的核酸或编码下 调JcFAD2基因的RNAi分子的核酸)的5’侧和／或3’侧可操作连接的调控区。 含所有这些元件的盒在本文中也被称为表达盒。表达盒可以在表达盒构建 体中额外包含5’前导序列。调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区) 和／或编码信号锚的多核苷酸可以是天然的／与宿主细胞或彼此类似。启动子 和组织特异性启动子对于制备用于转化麻风树以及转化其他油料作物的构 建体特别有用。可选地，调控区和／或编码信号锚的多核苷酸可以与宿主细 胞或彼此异源。参见美国专利号7,205,453和美国专利申请公开号 2006／0218670、2006／0248616和20090100536以及其中引用的参考文献。表 达盒可以在表达盒构建体中额外包含5’前导序列。这样的前导序列可以用 来增强翻译。翻译前导序列是本领域已知的，包括在国际公开号WO 2008／094127以及其中引用的参考文献中描述的那些。

在本发明的实践中可以使用多种启动子。可以基于期望的结果来选择 启动子。即，核酸可以与组成型、组织偏好型或其他启动子联合，以在目 标宿主细胞中表达。这样的组成型启动子包括例如Rsyn7核心启动子(WO 99／48338和美国专利号6,072,050)、核心CaMV35S启动子(Odell等人， 1985)、水稻肌动蛋白(McElroy等人，1990)、泛素(Christensen和Quail，1989； Christensen等人，1992)、pEMU(Last等人，1991)、MAS(Velten等人，1984)、 ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如美国专 利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、 5,268,463和5,608,142中公开的那些。

其他的启动子包括诱导型启动子，特别是来自病原体诱导型启动子。 这样的启动子包括来自病原相关蛋白(PR蛋白)的那些启动子，其在病原体 感染后被诱导，如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。其 他启动子包括在位于或接近病原体感染位点处表达的那些启动子。在进一 步的实施方式中，启动子可以是损伤诱导型启动子。在其他实施方式中， 可以使用化学调控型启动子，以通过应用外源化学调节剂来调节植物中基 因的表达。启动子可以是化学诱导型启动子，其中化学品的应用诱导基因 表达；或者是化学阻遏型启动子，其中化学品的应用阻遏基因表达。此外， 可以使用组织偏好型启动子，以将目标多核苷酸的增强表达靶向在特定植 物组织内。在美国专利号6,506,962、6,575,814、6,972,349和7,301,069以 及美国专利申请公开号2007／0061917和2007／0143880中描述了这些启动 子。

通常，表达盒可以额外包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选 择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。植物选择性标记基因常常将编 码抗生素抗性，其中适合的基因包括至少一组编码抗生素壮观霉素抗性的 基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、编码卡那霉素或遗传 霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转 移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。可选地，植物选择性标记 基因将编码除草剂抗性，如对磺酰脲型除草剂、草铵膦、草甘膦、铵、溴 苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性，包括编码对用以抑制谷 氨酰胺合酶的除草剂如膦丝菌素或basta的抗性的基因(如bar基因)。参见 国际公开号WO02／36782、美国专利号7,205,453和美国专利申请公开号 2006／0218670、2006／0248616、2007／0143880和2009／0100536，以及其中引 用的参考文献。还可参见Jefferson等人(1991)；De Wet等人(1987)；Gofif 等人(1990)；Kain等人(1995)和Chiu等人(1996)。该选择性标记基因的列 表并不意味着限制。可以使用任何选择性标记基因。选择性标记基因也处 于待转化植物种类中可操作的启动子控制之下。这样的启动子包括国际专 利公开号WO2008／094127以及其中引用的参考文献中描述的那些。

可选地，表达盒可以额外包含如本文中所描述的Cre—lox无标记重组系 统。这样的系统可用于产生无选择标记的转基因麻风树植物或其他油料作 物植物。

在制备表达盒时，可以操作多种DNA片段，以提供处于正确方向的 DNA序列，并且视情况而定，该序列处于正确阅读框中。为此，可以使用 接头(adapter)或连接子(linker)以将DNA片段结合，或者可以包括其他的操 作以提供方便的限制性位点，去除多余的DNA，去除限制性位点等。出于 此目的，可以使用体外突变、引物修复、限制性、退火、再取代，例如转 换和置换。

将核酸克隆入表达载体中以后，可以使用常规转化方法将其导入植物 细胞中。术语“植物细胞”意为包含源于植物，包括未分化组织如愈伤组织和 悬浮培养物，以及植物种子、花粉或植物胚的任何细胞。适合转化的植物 组织包括叶组织、根组织、分生组织、原生质体、下胚轴、子叶、盾片、 芽尖、根、幼胚、花粉和花药。“转化”是指通过外部应用来自不同基因型的 另一种细胞的重组DNA，使其吸收并整合入如对象细胞基因组中，从而对 细胞基因组进行直接修饰。以这种方式可以获得经遗传修饰的植物、植物 细胞、植物组织、种子等。

可以使用含本发明启动子的DNA构建体来转化任何植物，特别是油棕 榈植物。可以通过多种常规技术将构建体导入所需植物宿主的基因组中。 转化多种高等植物种类的技术是公知的并且在技术和科学文献中进行了描 述。如技术人员所公知，转化方法可以根据待转化植物或植物细胞的类型， 即单子叶或双子叶植物而变化。例如，可以使用如植物细胞原生质体的电 穿孔和显微注射技术将DNA构建体直接导入植物细胞基因组DNA中，或 者可以使用冲击方法如DNA颗粒轰击将DNA构建体直接导入植物组织中。 可选地，DNA构建体可以与适合的T-DNA侧翼区结合并被导入常规的根 癌农杆菌宿主载体中。根癌农杆菌宿主的毒力功能将在细胞被细菌感染时 指导构建体和相邻标记插入植物细胞DNA中。因此，可以使用提供有效转 化／转染的任何方法。参见例如美国专利号7,241,937、7,273,966和7,291,765 以及美国专利申请公开号2007／0231905和2008／0010704，以及其中引用的 参考文献。还可参见国际公开申请号WO2005／103271和WO2008／094127， 以及其中引用的参考文献。已经被用于转化油棕榈的技术包括基因枪介导 的转化和农杆菌介导的转化。参见例如Masli等人，(2009)；Omidvar等人， (2008)；Parveez等人，(2008)；Abdullah等人，(2005)；Parveez等人，(2000)； Chowdhury等人，(1997)；美国专利申请公开号2009／0038032。此外，麻风 树的转化也已经在国际公开号2010／071608中进行了描述。

可以对通过任何上述转化技术得到的经转化植物细胞进行培养，以再 生具有转化基因型和期望表型的完整植物，如转基因植物。“转基因植物” 是已经向其中导入了外源DNA的植物。“转基因植物”包含继续拥有外源 DNA的其所有后代、杂种及杂交种，无论是有性或无性繁殖的。再生技术 典型地依赖于已经与期望核苷酸序列一起导入的杀菌剂和／或除草剂标记， 还依赖于在组织培养生长培养基中使用某些植物激素。参见例如国际公开 申请号WO2008／094127以及其中引用的参考文献。

前述转化技术通常被用于生产表达盒被稳定整合的转基因品种。在表 达盒稳定整合入转基因植物中之后，可以通过有性杂交将其转移到其他植 物中。在一个实施方式中，随后可以将转基因品种与另一个(非转化或经转 化的)品种杂交，以产生新的转基因品种。可选地，可以使用植物育种领域 公知的传统回交技术，将已经利用前述转化技术被引入特定棉花品系中的 遗传性状转移到另一个品系中。例如，可以使用回交方法来将设计的性状 从公共的非优良品种转移到优良品种中，或者从基因组中含外源基因的品 种转移到不含该基因的品种中。根据上下文，本文中所用的“杂交”可以指简 单的X Y杂交或者回交过程。根据待杂交的种类，可以使用若干标准育种 技术中的任意技术。

产生了这种类型的转基因植物后，可以依照常规步骤培育植物本身。 当然，可以从转基因植物回收转基因种子。随后可以使用常规方法将这些 转基因种子种植于土壤中并培育，以产生转基因植物。经培育的转基因植 物将以本文中所述的组织偏好型或组织特异性方式表达目标DNA。

除非另有说明，本发明的实践使用本领域技术范围内的化学、分子生 物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和 转基因生物学的常规技术。参见例如Maniatis等人，1982，Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)； Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold Spring Harbor  Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook和Russell，2001， Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring  Harbor，New York)；Ausubel等人，1992)，Current Protocols in Molecular  Biology(John Wiley&Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA  Cloning(IRL Press，Oxford)；Russell，1984，Molecular biology of plants：a  laboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring  Harbor，N.Y.)；Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes， (Academic Press，New York，1992)；Guthrie和Fink，Guide to Yeast Genetics  and Molecular Biology(Academic Press，New York，1991)；Harlow和Lane， 1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， New York)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames＆S.J.Higgins eds.1984)； Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized  Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To  Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic  Press，Inc.，N.Y.)；Methods In Enzymology，Vols.154and155(Wu等人，eds.)， Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker， eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimenttal Immunology， Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential  Immunology，6th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Fire  et al.，RNA Interference Technology：From Basic Science to Drug Development， Cambridge University Press，Cambridge，2005；Schepers，RNA Interference in  Practice，Wiley-VCH，2005；Engelke，RNA Interference(RNAi)：The Nuts& Bolts of siRNA Technology，DNA Press，2003；Gott，RNA Interference，Editing， and Modification：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)， Human Press，Totowa，NJ，2004；Sohail，Gene Silencing by RNA Interference： Technology and Application，CRC，2004。

实施例

参考下列实施例来描述本发明，实施例以阐述方式提供，而并非意在 以任何方式限制本发明。使用了本领域公知的标准技术或下面具体描述的 技术。

实施例1：材料和方法

用于转化的外植体材料：从麻风树(Jc-MD)植物收集种子，种子由Yan  Hong和Chenxin Yi博士挑选(Yi等人，2010)并用作起始材料。将从1／2 Murashige and Skoog盐培养基中萌发的5-7日龄苗的子叶切成小块(5 ×5mm)。

麻风树转化步骤：详细步骤请参见Mao等人(2009)。简单地说，以下 方法有4个步骤。1)共培育。子叶小块与带有目标表达框的农杆菌细胞在 20ml培养基II中25℃孵育10-20min。随后将外植体转移到共培育培养基中， 于22℃黑暗中放置2-3日。共培育之后，用无菌水冲洗外植体数次，随后 用300mgl^-1头孢噻肟清洗一次。子叶组织通过放置在无菌纸垫上吸干以去 除多余表面水分。将愈伤组织形成培养基平板上的外植体转移到黑暗中， 于25±1℃放置3周。在这种条件下，未转化的外植体通常将变成棕色。

2)芽再生。将具有新出现潮霉素抗性的愈伤组织的外植体转移到芽再 生培养基I上，于25℃用16h光照(100μmolm^-2S^-1)／8h黑暗循环放置3周。 在此期间，将从愈伤组织再生的任何芽(约40-50％)转移到芽再生培养基II 上。无再生芽的愈伤组织转移到芽再生培养基III上以进一步再生。

3)芽伸长。4周后，将再生芽转移到芽伸长培养基上，以伸长和芽增 殖。

4A)生根。将约2.5cm的伸长的芽定植于生根培养基中。通常生成根 将花费超过一个月。或

4B)可以使用嫁接来增加成活率。伸长的芽也可以被用作接穗以嫁接 到非转基因砧木上。选择健康并且活跃生长的麻风树植物作为砧木。将接 穗和砧木两者切至形成层区域，以使得连接之后来自两者的韧皮组织接触。 嫁接结合处以封口膜包裹并以胶带固定。使嫁接的麻风树保持在低光强度 和85％湿度下7日。

转基因质粒构建和材料：为生成JcFAD2-1表达下调的β-雌二醇化学调 控诱导型RNAi品系，使用正向引物 5′-ATCACTCGAGCCACCATTCACACTTGGTCAG-3′(SEQ ID NO：12)和反 向引物5′-GTATAAGCTTCATGAGTGTCTGTAATGTTATG-3′(SEQ ID  NO：13)对对应于JcFAD2-1cDNA编码区第85至946核苷酸的862bp的基 因特异性片段进行PCR扩增。如先前所述，将该片段以正义方向插入到 pSK-int载体的XhoI／HindIII位点中(Guo等人，2003)。随后将以正向引物 5′-CAATATCTAGACCATGGGTGCCGGTGGCAGAATG-3′(SEQ ID NO：14) 和反向引物5′-TATTGGATCCGGAAACTTGTTTTTGTACCAGAACAC-3′ (SEQ ID NO：15)引物扩增的相同片段以反义方向置于已经携带正义片段的 pSK-int的BamHI／XbaI位点中，以形成pSK-int-FAD2-1RNAi。最后，利用 侧翼XhoI／Xbal位点将由肌动蛋白II内含子穿插的包含正义和反义片段的整 个RNAi盒从pSK-int切下，并将其插入pX7-GFP载体的XhoI／Xbal位点中， 得到构建体pX7-FAD2-1RNAi，其序列示于SEQ ID NO：33中。

为生成JcFAD2-1表达下调的β-雌二醇化学调控诱导型和种子特异型 RNAi品系，以重叠PCR扩增大豆7S种子启动子并用于取代pX7-GFP的 G10-90组成型启动子，得到命名为PX8-GFP的种子特异型启动子无标记 载体。将pSK-int载体中上面整个FAD2-1RNAi盒插入PX8-GFP中以取代 GFP编码区，以形成pX8-FAD2-1RNAi载体，其序列示于SEQ ID NO：32 中。

选择转化株，并使用基因标记、个体种子胚乳的脂肪酸组成分析来确 定结果(来自pX7-FAD2-1RNAi的X7#79、X7#170；来自pX8-FAD2-1RNAi 的X8#34、X8#291)。植物在温室中自然光周期和温度条件(范围从25℃-35 ℃)下生长。

脂肪酸分析：对于叶脂质谱分析，以Ye等人(2009b)所描述的类似的方 法从100mg新鲜麻风树叶中提取总脂质。收集干燥的麻风树种子，并在去 除外种皮之后，以75％(v／v)乙醇对种子表面消毒60秒，随后将其浸泡在 10％(v／v)H₂O₂中1h，再以无菌水冲洗两次，最终浸泡在无菌水中于28℃黑 暗中过夜24hrs。小心地将种子的胚乳与胚分离。随后将干燥的胚乳部分研 磨成细粉，以己烷提取脂质三次。将上清转移到玻璃管中，并以干燥氮气 流于50℃蒸发掉己烷。对粗油进行称重，并将油含量记录为粗油与胚乳量 的比率。

以3N甲醇-HCl(SIGMA，USA)加400μL2,2,二甲氧基丙烷(SIGMA， USA)将约10mg油转甲基化。以GC分离得到的FAMEs，并使用GCAgilent 6890(Palo Alto，CA，USA)进行检测，GC以氦气作为载气并以DB-23柱进行 组分分离。GC分析方法于140℃保持50sec并以30℃min^-1升至240℃进行， 最终温度保持50sec。基于峰的保留时间与FAME参照混合物(SIGMA，USA) 的对比对其进行鉴定。基于三个生物学重复中峰面积占总脂肪酸的百分数 来计算分析中的脂肪酸组成的数值，并以平均值±标准差来表示。

RNA提取和分析：将100mg叶或胚乳组织在液氮中研磨，并以植物RNA 纯化试剂(Invitrogen，USA)进行提取。通过Nanodrop(Thermo，USA)测量 RNA浓度。使用M-MLV逆转录酶(Promega，USA)进行逆转录反应。实时 PCR以PowerGreen PCR Master(Applied Biosystems，USA)进行并 在ABI7900HT中运行。所有样品一式三份进行，并以RQ管理器在预设Ct 值处分析数据(Applied Biosystems，USA)。麻风树rbcL mRNA用作叶的内部 对照而麻风树α-微管蛋白mRNA用作种子样品的内部对照。分析中包括的 Ct值基于三个生物学重复，其中对于每个生物样品有三个技术性重复。基 于3个生物学重复计算标准差。实时PCR引物序列显示于表1中。

表1：实时PCR引物序列

引物 序列 SEQ ID NO： FAD2-1-R GGTTGAGGAAGGAGGTGGAAG 17 FAD2-1-F CCACCATTCACACTTGGTCAG 18 FAD2-2-F AGCAATCAAGCCTATATTGGGC 19 FAD2-2-R CCAGAGAACTCCTCGGTTGG 20 FAD6-F TGGTGCATCATACGGCTC 21 FAD6-R ATGTGAACATTGATATCATG 22 rbcl-R CTTCTCCAGCAACGGGCTC 23 rbcl-F GGAGTTCCGCCTGAGGAAG 24 a-tub-F GAGGCTGGATCTGGCAAACACGTT 25 a-tub-R TGTGTAATGACCTCTAGCAAAATTA 26 P7S TCAATCCATGATGAGCCCACA 27 P4 GTATAAGCTTCATGAGTGTCTGTAATGTTATG 28 P1 GCCGCCACGTGCCGCCACGTGCCGCC 29 hpt-R TACTTCTACACAGCCATCGGTCCA 30 hpt-F AAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCT 31

Southern印迹分析：用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法，与对照Jc-MD  DNA一起，从所指转基因品系的温室生长材料中分离总基因组DNA。基因 组DNA以限制性内切酶EcoRV和Xbal消化并在0.8％的琼脂糖凝胶中分离。 按照标准程序(Sambrook等人，1989)对凝胶进行处理并将其转移到尼龙 Hybond-N⁺膜(GE Biosciences，USA)上。膜与HPT和FAD2-1ORF探针杂交。 按照制造商的方法，使用Amersham Rediprimer II Random Prime Labelling  System(GE Biosciences，USA)，进行随机引物合成，以[α-32^P]-脱氧胞苷三磷 酸([α-³²P]-dCTP)标记探针。使用ULTRAHyb-Oligo杂交缓冲液(Ambion， USA)于42℃进行杂交过夜，并通过放射自显影检测信号。

实施例2：来自麻风树ω6油酸去饱和酶的分离和表征

生成高油酸麻风树的第一步是分离编码推定的微粒体ω6油酸去饱和 酶的基因。为此，从麻风树种子cDNA文库分离了与现存FAD2酶具有广 泛相似性的两个cDNA(Yin ZC等人，未公开的数据)。这两个cDNA编码 383和387个氨基酸的蛋白，两种蛋白彼此为74％相同并且分别与拟南芥 FAD2为77.3％和72.1％相同。与FAD2酶家族具有更高序列相同性的cDNA 被命名为JcFAD2—1，而另一个被命名为JcFAD2-2。在三个保守组氨酸富集 盒中的其酶活性中心处，JcFAD2—1具有与AtFAD2相同的氨基酸序列(图 2A)，而JcFAD2-2在活性位点组氨酸富集盒3中关键残基丙氨酸处有变化 (JcFAD2-2中为苏氨酸，图2A)。由于疏水核心环境对其活性来说是关键的， 以极性的苏氨酸取代微疏水的丙氨酸的变化可能潜在地改变FAD2-2的底 物特异性和酶活性。

为研究FAD2-1和FAD2-2的基因表达模式，在所有种子发育阶段(受精 后3周、5周、7周和8周，对应于麻风树种子发育阶段的早、中、晚和成 熟阶段)提取RNA，并以之进行含每个cDNA特异引物的逆转录酶(RT)-PCR 反应。如图2B所示，FAD2-1基因在种子和营养组织中表达，而FAD2-2在 种子中高表达而在叶中检测不到。在大戟科中，麻风树中这两个FAD2基因 的表达模式与蓖麻(Ricinus communis)中的FAD2和FAH12、油桐(Aleurites  fordii)中的FAD2和FAX非常相似。上面所有数据显示JcFAD2-2的功能更 像一种不常见的酶，而非如FADX和FAH12的那些去饱和酶。因此，我们 选择FAD2—1作为下调靶标，以产生高油酸组成。

实施例3：麻风树中β-雌二醇诱导的Cre-lox无标记重组系统

对遗传修饰作物的不断增加的生物安全性考虑必然将阻碍其商业化， 并且已经导致对应用可以生产无选择性(如抗生素抗性)标记的转基因植物 的技术的更大需求。

为产生无选择性标记的麻风树，我们测试了Zuo J等人(2001)在拟南芥 中最先开发的化学诱导的Cre-loxP介导的位点特异性重组系统。我们选择 沉默JcFAD2-1代替使用GFP作为报告基因，以获得高油酸和无标记的转基 因麻风树。

使用与上面所描述类似的转化过程获得潮霉素抗性再生芽。有可见的 芽出现后，我们将小芽转至无潮霉素的无标记诱导培养基中。诱导两周之 后，这些生长良好的芽随后被转入无潮霉素的再生培养基II中。剩余的步 骤与上述转化步骤相同。

当化学诱导的Cre-lox介导的重组和DNA切除发生时，RNAi结构接着 可以由pX7载体中最前面的G10-90直接驱动(参见图3A的示意图)。作为 JcFAD2—1下调的结果，将产生脂肪酸谱的变化。因此，我们随机从平板上 选择10个推定的无标记小芽以提取DNA用于基因分型分析。使用由对于 G10-90启动子特异的正向引物和对于FAD2-1特异的反向引物组成的一对 引物，PCR分析表明10个再生芽中的2个具有预期大小的小片段。同时， 在#1—1中有潮霉素抗性基因(hpt)的扩增条带，表示其为嵌合的。相反，在 #1-2中没有任何hpt基因的PCR扩增条带，表示其可能为纯无标记的转基 因麻风树。在拟南芥中，FAD2编码的去饱和酶负责18：1-ACP至18：2-ACP 的去饱和。我们推测诱导后FAD2—1表达的降低应当阻断18：1—ACP至 18：2-ACP脂肪酸的转化。我们进一步使用脂肪酸甲基酯(FAME)-气相层析 (GC)检查其叶中的脂肪酸谱。如所预料，相比由WT麻风树子叶再生的芽， #1—1中油酸含量更高，而#1-2中油酸水平高得多(图3C)，同时无标记品系 中的亚油酸水平显著降低。因此，我们已经显示β-雌二醇诱导的Cre-lox重 组系统可以用于生成无标记的转基因麻风树。我们通过稳定转化证实了麻 风树叶中JcFAD2—1控制油酸向亚油酸转化的功能。

实施例4：X7-FAD2—1RNAi品系的分子分析和油类组成

使用基于PCR的基因分型，我们鉴定出20个推定的纯无标记的 X7-FAD2-1RNAi品系(图4A)，并将其转移到温室中的大盆里用于对种子做 进一步遗传和化学分析。我们收集了这些推定的无标记事件的T1种子。从 我们在无激素培养基中进一步萌发T1植物中，小心地分离胚乳与胚。相比 35S：GFP胚乳中的36.7％，发现两个最好的品系#79和#170的油酸增加到 50％-60％(图4A)。同时亚油酸从对照中初始的41％降低到小于25％(图5C)。 但是油酸组成的改变是适度的，而不如在培养基中由TRV诱导的FAD2-1 RNAi麻风树叶中发现的那样显著(图3C和Ye等人，2009a)。我们推断由 于G10-90启动子活性强度低，在种子中沉默效果不那么好。我们的基于定 量PCR的RNA数据进一步显示，在这两个结果中仍然有20％的JcFAD2-1 RNA(图5A)。进一步的定量RT-PCR数据证明了这种JcFAD2-1RNA降低 作用是基因特异性的，因为这两个品系胚乳中对FAD2同源物FAD2-2的表 达没有影响。

我们进一步在1／2MS培养基中使T1胚萌发以生成T1植物，以检查 JcFAD2-1RNAi对其营养器官的作用。我们发现JcFAD2—1表达水平有类似 的大幅降低(图5B)。

实施例5：具有种子特异型启动子的较高油酸转基因品系

由于叶油酸含量在植物环境适应中起重要作用，更需要特别改变种子 油酸含量，而对其在营养器官中的含量影响最小。为此，我们以显示为种 子特异性表达的大豆(Glycine max)7S种子储藏蛋白启动子替换pX7-FAD2-1 RNAi载体中的G10-90启动子。具有大豆7S启动子的新载体被命名为 pX8-FAD2-1RNAi(图3A)。我们生成了被确认为无标记的20个X8-FAD2-1 RNAi品系。RNA分析显示在胚乳中，相比于35S：GFP对照，品系#34和 #291仅含0.7％和1.1％的FAD2-1转录物(图6A)。按T1子叶中低得多的 FAD2-1RNA积累所示，我们发现大豆7S启动子也在麻风树子叶中具有活 性(图6B)。然而在营养器官如叶中，FAD2-1转录水平没有显著变化。

品系#39与对照胚乳之间油含量没有明显区别(图6D)。GC分析数据进 一步证明了#34和#291的T1胚乳中油酸大大升高的表型，油酸积累为77.4％ 和74.7％(图6E)。在这些品系中，亚油酸水平降低到总脂肪酸的小于5％。 对照麻风树胚乳中总不饱和脂肪酸(油酸和亚油酸)经估算为约78-79％。在 品系#34和#291中，几乎所有的不饱和脂肪酸储存为油酸。此外，硬脂酸 水平也从7.7％略微下降至5.4-5.7％。pX8-FAD2-1RNAi品系和对照植物之 间C16脂肪酸组成没有显著差异。与基因表达水平没有变化一致，真叶脂 肪酸谱没有统计学差异(图6F)。该数据进一步确认了这些品系中的种子特 异性高油酸。

实施例6：对无标记品系X8#34的Southern印迹分析

我们对品系X8#34进行Southern印迹分析以确定转基因座位的复杂度。 在pX8-FAD2-1RNAi载体中仅有1个Xhol位点(图3A)。如我们所知，X8#34 T0植物是部分无标记的嵌合体(图4B)。如果在#34的麻风树基因组中仅有 T-DNA插入的1个拷贝，由于Cre-lox重组事件，将有大小差异约5.7kb的 两个条带。因此，以Xhol消化T0和T1植物的总基因组DNA并以大豆7S 启动子探查。图4A中的Southern印迹数据显示在#34T0植物中大小差异 约5-6kb并在T1植物(1-4)中分离的两个条带。这还表明#34-2和#34-4是单 拷贝且纯无标记的，而#34—1为嵌合体并且#34-3无标记。为分析#34-2和 #34-4是否是无标记且单拷贝的，我们进一步以EcoRV和XbaI处理这两株 T1植物的总基因组DNA，预期这会从如其基因组DNA序列所示的 JcFAD2-1基因组座位中释放5K条带。在X8#34和X8#291的所有4株植 物中发现了另外一条带(图4B)，但在Jc-MD WT对照植物中没有。我们对 膜进行剥离并将其与hpt ORF探针杂交，在任何转基因植物中都没有检测 到信号。这些结果证实了所有这些T1植物是无标记的。

除非本文中另有说明或者与上下文明显矛盾，术语“a”和“an”和“the”以 及描述本发明的上下文中类似指示物的使用，被视为涵盖了单数和复数。 除非另有注明，术语“包含”，“具有”，“包括”和“含”被视为开放式术语(即意 为“包括但不限于”)。除非本文中另有说明，本文中数值范围的列举仅仅意 在作为独立提及落在范围中的每个单独数值的速记方法，每个单独数值如 其在本文中被独立示出一样纳入说明书。除非本文中另有说明或者与上下 文明显矛盾，本文中描述的所有方法可以以任何适合的顺序进行。除非另 有要求，任一和所有实施例，或者本文中提供的示例性语言(例如“如”)的使 用仅仅意在更好地展示本发明，而不造成对本发明范围的限制。说明书中 的语言不应被视为表示本发明实践所必需的任何非要求元素。

本文中描述了本发明的实施方式，包括发明人已知的实施本发明的最 佳模式。阅读前面的描述后，那些实施方式的变化对于本领域普通技术人 员变得显而易见。发明人预期技术人员会视情况使用这样的变化，并且发 明人期望本发明以非本文中具体描述的其他方式实践。因此，本发明包括 适用法律所允许的、对所附权利要求中引用的主题的所有修改和等同形式。 此外，除非本文中另有说明或者另外与上下文明显矛盾，本发明涵盖其所 有可能性变化中上述要素的任意组合。

文献目录

Abdullah，R.et al.(2005).Immature embryo：A useful tool for oil palm(Elaeis guineensis Jacq.)genetic  transformation studies.Electronic Journal of Biotechnology[online]vol.8，no.1[April15，2005).

Available from：http colon／／www dot ejbiotechnology dot info／content／vol8／issue l／full／l／index.html.

Carroll，A.and Somerville，C.(2008)Cellulosic Bioufels.Annu.Rev.Plant Biol60：165-182.

Chiu，W.et al.(1996).Engineered GFP as a vital reporter in plants.Current Biology6：325-330.

Chowdhury，M.K.U.et al.(1997).Evaluation of five promoters for use in transformation of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)Plant Cell Reports16：277-281.

Christensen，A.H.and Quail，P. H，(1989).Sequence analysis and transcriptional regulation by heat shock  of polyubiquitin transcripts tfom maize.Plant Mol Biol12：619-632.

Christensen，A.H.et al.(1992).Maize polyubiquitin genes：structure，thermal perturbation of expression  and transcript splicing，and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.Plant Mol  Biol18：675—689.

De Wet，J.R.et al.(1987).Firefly luciferase gene：structure and expression in mammalian cells.Mol Cell  Biol7：725-737.

Durrett，T.P. et al.(2008).Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels.Plant J 54：593-607.

Fairless，D.(2007).Biofuel：the little shrub that could—maybe.Nature449：652—655.

Goff，S.A.et al.(1990).Transactivation of anthocyanin biosynthetic genes following transter of B  regulatory genes into maize tissues.EMBO J9：2517-2522.

Graef，G. et al.(2009).A high-oleic-acid and low-palmitic-acid soybean：agronomic performance and  evaluation as a feedstock for biodiesel.Plant Biotechnol J7：411-421.

Guo，H.S.et al.(2003).A chemical—regulated inducible RNAi system in plants.Plant J34：383—392.

Jefferson，R.A.et al.(1991).Plant Molecular Biology Manual，ed.Gelvin et al.，Kluwer Academic  Publishers，pp.1-33.

Jones N，M.J.(1991)Jatropha curcas-a multipurpose species for problematic sites：World Bank，Asia  Technical Dept.，Agriculture Division，Washington，USA.

Last，D.I.et al.(1991).pEmu：an improved promoter for gene expression in cereal cells.Theor Appl Genet 81：581-588.

Lu，C.et al.(2011).New frontiers in oilseed biotechnology：meeting the global demand for vegetable oils  for food，feed，biofuel，and industrial applications.Curr Opin Biotechnol22：252-259.

Mao，H.-Z.et al.(2010).Genetic transformation of Jatropha curcas.International Published Application No. WO2010／071608.

Masli，D.I.A.et al.(2009).Transformation of oil palm using Agrobacterium tumefaciens.J Oil Palm Res 21：643—652.

McElroy，D.et al.(1990).Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation.Plant Cell 2：163—171.

Odell，J.T.et al.(1985).Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic  virus35S promoter.Nature313：810—812.

Omidvar，V. et al.(2008).A transient assay to evaluate the expression of polyhydroxybutyrate genes  regulated by oil palm mesocarp-specific promoter.Plant Cell Rep27：1451-1459.

Parveez,G.K.A.et al.(2000).Transgenic oil palm：production and projection.Biochemical Society  Transactions28：969-972.

Parveez，G.K.A.(2008).Biolistic mediated production of transgenic oil palm.Methods Mol Biol 477：301-320.

Tat，M.E.et al.(2007)Exhaust emissions from an engine fueled with biodiesel from high-oleic soybeans.J  Am Oil Chem Soc84，865-869.

Velten，J.et al.(1984).Isolation of a dual plant promoter fragment from the Ti plasmid of Agrobacterium  tumefaciens.EMBO J3：2723—2730.

Ye，J.et al.(2009a).Rapid analysis of Jatropha curcas gene functions by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol J，7，964-976.

Ye，J.et al.(2009b).A critical domain of the Cucumber mosaic virus2b protein for RNA silencing  suppressor activity.FEBS Lett.，583，101-106.

Yi，C.et al.(2010).Does epigenetic polymorphism contribute to phenotypic variances in Jatropha curcas L.? BMC Plant Biol10：259.

Zuo，J.et al.(2001).Chemical-regulated，site-specific DNA excision in transgenic plants.Nat Biotechnol 19：157-161.