抗骨桥蛋白抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种抗骨桥蛋白抗体及其应用，所述抗骨桥蛋白抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GFSLSTSGE、YWDDD、RGFDGSGYYSYFEH，所述轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为：TRSSGSIASNYVQ、EDNQRPS、HSYDSSFHWV。本发明还公开了所述抗骨桥蛋白抗体在制备检测卵巢癌细胞和肺癌细胞的试剂中的应用。本发明抗骨桥蛋白抗体特异性高，制备过程相对简单，成本低廉。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体，尤其涉及一种抗骨桥蛋白抗体。

背景技术

骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种分泌型磷酸化糖蛋白，在多种 腔上皮，如消化道黏膜中有少量表达，可参与细胞的信号转导，促进细胞 黏附和迁移。Senger等于1979年首次在恶性转化的上皮细胞株中发现， 称之为转化相关性磷酸蛋白。1986年，Franzen等从骨组织中分离出一种 磷蛋白，其特性与Senger等发现的磷蛋白相似，正式将其命名为骨桥蛋白。

骨桥蛋白也是一种非常重要的致炎症细胞因子，由巨噬细胞、树突状 细胞、角质化细胞与上皮细胞产生。它属于4-α-螺旋束细胞因子家族。骨 桥蛋白能够活化多种免疫细胞、刺激它们增殖并延长其寿命。近年来对骨 桥蛋白与肿瘤的关系的研究发现，骨桥蛋白的过度表达与人类多种肿瘤， 如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、食管癌、肝癌等肿瘤细胞生长、 增殖和侵袭、转移密切相关。

卵巢癌是妇科常见三大恶性肿瘤之一，其病死率位列妇科三大恶性肿 瘤之首。因早期时缺乏典型症状，无创检查不易发现其早期病变，故多数 病例发现时已属晚期。卵巢癌Ⅲ期及Ⅳ期患者的5年生存率不到20%，而 Ⅰ期患者的5年生存率可90%。临床上普遍采用的糖类抗原CA125。然而， 仅50%左右早期至I期和II期的卵巢癌病患血清中能检测到CA125的高 表达（Coticchia等，“Ovarian cancer biomarkers:Current options and future  promise.”《J Natl Compr Cancer Network》2008年第6卷8期）。

骨桥蛋白不仅在卵巢癌及卵巢交界性恶性肿瘤组织中的表达高于在 良性肿瘤和正常卵巢上皮组织，而且晚期卵巢癌组织中的表达也明显高于 早期癌，在有癌转移的淋巴结中同样高表达。OPN的血清学检查不仅可以 用于区别健康人群和卵巢癌患者，还可用于区分卵巢癌和卵巢良性肿瘤。 OPN与其他肿瘤标志物联合检测时可以提高卵巢癌的检出率（Dutta等， “Biomarkers for ovarian cancer detection and therapy.”《Cancer Biol& Therapy》2010年第9卷9期）。

马哲和张虹（“骨桥蛋白在卵巢癌组织中的表达及意义。”《现代诊断 与治疗》2011年第22卷3期）采用免疫组化法检测35例上皮性卵巢癌组 织、17例交界性卵巢肿瘤、15例卵巢良性肿瘤组织及6例正常卵巢组织 标本中OPN的表达，分析其与临床病理特征的关系及相关性。结果发现 OPN在上皮性卵巢癌、交界性卵巢肿瘤、卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中 阳性表达率分别为69%、65%、26%及0%。因此，OPN在卵巢癌组织中 显著高表达；其表达和术前血CA125水平相关，足卵巢癌早期诊断、病 情监测及评价预后的生物标志物之一。

骨桥蛋白在肺癌病患血清中也有高表达，血清OPN检测在肺癌患者 临床诊疗中同样有应用价值。董淑敏等（“肺癌患者外周血骨桥蛋白检测 的临床意义”《现代中西医结合杂志》2008年24期）选择不同临床TNM 分期的肺癌患者120例作为肺癌组，同期肺炎性假瘤患者23例作为疾病 对照组，49例门诊体检正常者作为健康对照组，应用酶联免疫吸附法 （ELISA）进行血清骨桥蛋白水平检测。同时对其中67例临床治疗有效 的肺癌患者行治疗前后（放化疗或手术前后）该肿瘤标志物血清水平比较。 结果血清骨桥蛋白水平在Ⅰ～Ⅱ期患者中为（73.7±32.9）μg/L，在Ⅲ期患 者中为（144.6±44.7）μg/L，在Ⅳ期患者中则可达（395.8±105.2）μg/L。 说明骨桥蛋白血清水平是一个较好的评价肺癌进展程度的血清学指标，且 有助于临床对肺癌临床疗效的评判。

发明内容

本发明提供了一种特异性高的抗骨桥蛋白抗体。

一种抗骨桥蛋白抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变 区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为： GFSLSTSGE、YWDDD、RGFDGSGYYSYFEH，所述轻链可变区的三个高 变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为：TRSSGSIASNYVQ、 EDNQRPS、HSYDSSFHWV。

在抗体分子可变区上，三个高变区的氨基酸序列存在很大的变异性， 而高变区之间的区域氨基酸序列则变化较小。这三个高变区在空间结构上 可与抗原决定簇形成精密的互补，因此又被称为互补决定区（CDR），不 同重链轻链的CDR决定了抗体对抗原的特异性。

优选的，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述抗体为单链抗体。

本发明还提供了编码所述抗骨桥蛋白抗体的基因，其中，重链可变区 编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，轻链可变区编码基因的核苷 酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了含有所述的编码基因的重组载体。

本发明还提供了所述抗骨桥蛋白抗体在制备检测卵巢癌细胞和肺癌 细胞的试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明抗骨桥蛋白抗体特异性高，能够有效的检测卵巢癌细胞和肺癌 细胞，且制备过程相对简单，成本低廉。

附图说明

图1为本发明抗骨桥蛋白单链抗体的结构示意图；

图2为实施例6诱导表达产物纯化前后的凝胶电泳图；

其中，1为产物纯化前，2为产物纯化后；

图3为实施例7本发明抗体浓度与OD₄₅₀关系曲线图；

图4为实施例8本发明抗体检测肿瘤细胞株（卵巢癌和肺癌细胞株） 骨桥蛋白（OPN）表达的结果。OPN是包被纯化后的骨桥蛋白（1μg/ml）。

具体实施方式

本发明采用专利申请01813639.7公开的方法构建人单链抗体文库，并 在人单链抗体文库中筛选OPN抗体，具体实施过程如下：

实施例1逆转录和扩增得到人抗体重链和轻链DNA

以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的poly A+RNA（购 自Clontech）为模板，并使用从Clontech购得的逆向转录酶试剂盒，以oligo （dT）和随机引物（random primers）为引物，根据Clontech试剂盒所提 供的方法指南，将poly A+RNA逆向转录成cDNA。以上述cDNA为模板， 使用一系列识别人抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因的引 物，应用PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链的可变区。一系列识别 人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下：

第一组：人抗体重链可变区（VH）基因的5’-端引物

VH1b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTG  CAG GAG TC(C/G)G

VH2b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTA CAG CTG  CAG CAG TCA

VH3b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTA  CAG CAG TGG G

VH4b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GAG GTG CAG CTG  (G/T)TG GAG(A/T)C(C/T)

VH5b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTC CAG  CT(G/T)GT(A/G)CAG TCT GG

VH6b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG(A/G)TC ACC  TTG AAG GAG TCT G

VH7b:5’-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTG  GTG(C/G)A(A/G)TCT GG

第二组：人抗体重链可变区（VH）基因的3’-端引物

VH1f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GAC  (A/G)GT GAC CAG GGT G

VH2f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GAC  GGT GAC CAG GGT T

VH3f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA AGA GAC GGT  GAC CAT TGT

VH4f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GAC  GGT GAC CGT GGT CC

VH5f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC GGT TGG GGC  GGA TGC ACT CC

VH6f:5’-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC(C/G)GA TGG GCC  CTT GGT GGA(A/G)GC

第三组：人抗体λ-轻链可变区（Vλ）基因的5’-端引物

VL1b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT GT(C/G) (C/G/T)TG ACG CAG CCG CC

VL2b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT G(A/T)G  CTG AC(A/T)CAG CCA C

VL3b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT GAG CTG  A(C/T)(A/G)CAG C(C/T)A CC

VL4b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CCT GTG  CTG ACT CA(A/G)(C/T)C

VL5b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG(A/G/T)CT  GTG GTG AC(C/T)CAG GAG CC

VL6b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CC(A/T) G(G/T)G CTG ACT CAG CC(A/C)CC

VL7b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TCT GAG  CTG A(C/G)T CAG GA(C/G)CC

VL8b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT  G(C/T)(C/T)CTG A(C/T)T CAG CCT

VL9b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT AAT TTT ATG CTG  ACT CAG CCC C

第四组：人抗体λ-轻链可变区（Vλ）基因的3’-端引物

VL1f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TAG GAC GGT (C/G)A(C/G)CTT GGT CC

VL2f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA GAG GAC GGT CAG  CTG GGT GC

第五组：人抗体k-轻链可变区（Vk）基因的5’-端引物

VK1b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAC ATC C(A/G) G(A/G/T)TG ACC CAG TCT CC

VK2b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ATT GT(A/G) (A/T)TG AC(A/G)CAG TCT CC

VK3b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAT ATT GTG (A/C)TG AC(C/G/T)CAG(A/T)CT CC

VK4b:5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ACG ACA  CTC ACG CAG TCT C

第六组：人抗体k-轻链可变区（Vk）基因的3’-端引物

VK1f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT TTC CAC  CTT GGT CC

VK2f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT CTC  CA(C/G)CTT GGT CC

VK3f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT ATC CAC  TTT GGT CC

VK4f:5’-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT AAT CTC CAG  TCG TGT CC

PCR法扩增人抗体中的重链可变区（VH）时应用上述第一组引物与 第二组引物的组合，即有42个PCR反应。类似地，扩增人抗体中的λ- 轻链可变区（Vλ）时应用上述第三组引物与第四组引物的组合，即有18 个PCR反应。扩增人抗体中的k轻链可变区（Vk）时应用上述第五组引 物与第六组引物的组合，即有16个PCR反应。

第1组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2（Hua SB,Luo Y,Qiu M, Chan E,Zhou H,Zhu L.(1998)Gene.215:143-152.）（Hua SB,Qiu M,Chan  E,Zhu L,Luo Y.(1997)Plasmid.38:91-96.）多克隆位点上游的同源序列（下 划线部分）；第4组和第6组引物中包含有与酵母双杂交载体pACT2多克 隆位点下游的同源序列（下划线部分）；而第2组、第3组和第5组引物 中包含有连接肽（linker）的序列（下划线部分）。连接肽用于连接抗体的 重链和轻链的可变区。

PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链可变区的反应条件如下：

1.0单位Taq聚合酶（Takara公司生产）

将上述各组分混合均匀后置于PCR仪（Applied BioSystems公司）中 进行反应。PCR反应的参数为解链94℃，1分钟；退火50℃，1分钟； 延伸72℃，2.5分钟，循环30次。

实施例2连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列

以实施例1中PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板，以引物7 为上游引物，引物8为下游引物，采用PCR法进行扩增，反应条件同上。 引物7序列为载体pACT2多克隆位点的上游同源序列，引物8序列为连 接肽反链序列。

引物7（pACT2上游同源序列）

5’-ACC CCA CCA AAC CCA AAA AAA GAG ATC TGT ATG GCT  TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC

引物8（连接肽序列反链）

5’-ACT GCC TCC ACC ACC GCT GCC ACC TCC GCC AGA TCC  TCC GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC

以实施例1中PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板，以引物9 和引物10分别为下游引物和上游引物，采用PCR法进行扩增，反应条件 同上。引物9为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列，引物10为连接 肽顺链序列。

引物9（pACT2下游同源序列）

5’-GAG ATG GTG CAC GAT GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGC  GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA

引物10（连接肽序列顺链）

5’-GGC GGT GGT GGA TCA GGC GGC GGA GGA TCT GGC GGA  GGT GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT

实施例3将人抗体重链和轻链DNA通过连接肽序列连接成单链抗体

将实施例2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列 和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合。以该 混合DNA为模板，以引物7和引物9分别为上游引物和下游引物，进行 PCR扩增，反应条件同实施例1。得到包括人抗体重链DNA序列、轻链 DNA序列、载体pACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单 链抗体（scFv）DNA，如图1所示。

实施例4构建人单链抗体（scFv）基因文库

上述实施例3所述的单链抗体（scFv）DNA两侧接有酵母双杂交载 体pACT2（原Clontech公司生产）多克隆位点两侧的同源序列。将上述 实施例3所述的单链抗体（scFv）DNA与经限制性内切酶（BamHI和 EcoRI）处理后的酵母双杂交载体pACT2按照原Clontech公司提供的方法 （Yeast Protocol Handbook，PT3024-1）将其共同转化进入酵母菌株Y187 （基因型ura3-52，his3-200，ade2-101，lys2-801,trp1-901，leu2-3， 112，，gal80，URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ）内，经细胞内同 源重组后将单链抗体（scFv）DNA整合到pACT2载体上，从而得到酵母 双杂交单链抗体（scFv）文库。单链抗体（scFv）DNA片段与pACT2载 体上的Gal4激活区域（Activation Domain，AD）融合在一起。

为检查这个人单链抗体（scFv）文库的质量，随机挑出了21个克隆。 对插入片段测序分析表明所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体 （scFv）DNA片段（数据未显示），而且所有单链抗体（scFv）DNA序列 都是独特的。

上述经同源重组而得到酵母双杂交单链抗体（scFv）基因文库中抗体 DNA拷贝数大约有1×10⁸个，可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。

实施例5筛选抗体

使用人骨桥蛋白（OPN）作为抗原对酵母双杂交单链抗体scFv文库 进行筛选。将编码人OPN的DNA克隆进入载体pGBKT7（原Clontech 公司）构建出pGBK-OPN。pGBK-OPN编码Gal4DNA结合区域（Binding  Domain，即BD）并融合人OPN在其C端。

在编码人OPN的DNA序列得到验证后，pGBK-OPN质粒DNA转化 进酵母菌株AH109（基因型MATa，ura3-52，his3-200，ade2-101，trp1-901， leu2-3，112，，gal80，LYS2::GAL1_UAS-GAL1_TATA-HIS3， GAL2_UAS-GAL2_TATA-ADE2，URA3::MEL1_UAS-MEL1_TATA-lacZ）（Clontech公 司）。带有pGBK-OPN质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培养基 （SD/-W）上生长。

将等量的含有pGBK-OPN的MATa型酵母细胞（AH109菌株）与包 含单链抗体scFv文库的MAT型酵母细胞Y187菌株进行共同培养时，此 二型细胞即可交配结合。载有scFv文库的pACT2载体含有LEU2基因， pGBK-OPN包含TRP1基因。包含两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮 氨酸和丝氨酸的酵母合成培养基（SD/-LW）。存在scFv/OPN相互作用的 细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2和HIS3，从而使得酵母 细胞可以生长在缺乏腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的培养基 （SD/-AHLW）上，并在该平板培养基上形成菌落。

我们在上述筛选培养基（SD/-AHLW）上总共挑选出16个菌落。然 后，对这些菌落进行进一步的分析。

首先，按Clontech公司的方法使用半乳糖苷酶检测法检测lacZ表达。 存在scFv/OPN相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告 基因lacZ，从而能测得酵母细胞内表达的半乳糖苷酶。检测酵母细胞半乳 糖苷酶的方法如下:

（1）上述酵母在筛选培养基（SD/-AHLW）平板上生长。

（2）将酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上。

（3）将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中，使细胞破裂。

（4）将滤纸从液氮中取出，并置于30℃的烘箱内。重复步骤3和4 二次。

（5）将滤纸铺于适量的X-gal溶液中，并置于37℃的温箱内约15 分钟。若带有菌落处显示蓝色，表明为半乳糖苷酶阳性。

X-gal溶液配方如下：

检测结果：上述挑选出的16个菌落中有9个是半乳糖苷酶阳性的，表 明在这些菌落的细胞内另一报告基因lacZ也被激活了。

其次，对上述9个半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析，以确 定单链抗体scFv是特异性地与OPN部分结合，而不是与其它部分。将含有 scFv的pACT2质粒DNA从上述9个半乳糖苷酶阳性的酵母中提取出来。并 分别与pGBKT空载体DNA，或与含有编码融合Gal4-DNA结合区（BD）和 人核纤层蛋白C编码序列的质粒pGBKT-Lam（Clontech公司）的DNA，共 同转化到AH109酵母细胞内。转化后的酵母细胞先铺于SD/-LW平板培养 基上生长，然后转移到SD/-AHLW平板培养基上。并进一步使用半乳糖苷 酶分析。

经上述方法对scFv进行特异性分析后，得到一个对人OPN具有特异性 的单链抗体，对该抗体进行测序分析，结果显示：

该单链抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，DNA序列如SEQ  ID NO.3所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，DNA序列如SEQ ID  NO.4所示。

重链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO.1）如下：

QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGEAVAWIRQPPGKALE WLGIIYWDDDKRYSPSLKNRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYC AHRGFDGSGYYSYFEHWGQGTLVTVSS

下划线部分依次为重链可变区中的三个高变区CDRH1、CDRH2和 CDRH3的氨基酸序列。

轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID NO.2）如下：

NFMLTQPHSVSESPGKAVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTV IYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLRTEDKADYYCHSYDSSFHWVFGGGTKLTV

下划线部分依次为轻链可变区中的三个高变区CDRL1、CDRL2和 CDRL3的氨基酸序列。

实施例6抗体表达与纯化

将抗人OPN的单链抗体scFv的DNA克隆到蛋白质表达载体中 pET27b（+）（Life Technologies公司）而得到pET27b-OPN。克隆后的 pET27b-OPN，在scFv的N端是pelB序列（可将表达后的scFv蛋白质分 泌到表达细菌E.coli的周质腔periplasmic space中），而C端含有一段编 码HSV标记物和一个6x His标记物（可用于蛋白质的纯化）的序列。将 pET27b-OPN转化入蛋白质表达细菌E.coli菌株BL21DE3（Novagen公 司）。并按照该公司提供的方法用IPTG（浓度0.5mM）诱导表达和分离 抗人OPN的单链抗体scFv蛋白质。

因为scFv蛋白质的C端含有一个6x His标记物，可以应用Qiagen公 司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱（Qiagen公司）来纯化scFv蛋白质。 纯化前后蛋白质用SDS-PAGE凝胶电泳的分析，结果如图2所示。

实施例7酶标免疫法（ELISA）测试抗OPN的scFv特性

重组人骨桥蛋白（OPN）的蛋白质购自中国义翘神州生物技术有限公 司。用于酶标免疫法（ELISA）的96-孔板（MaxiSorp板）购自Nunc公 司。方法如下：

（1）上述96-孔板首先用OPN包被，在2-8℃过夜。

（2）包被后的96-孔板再用SuperBlock（购自Pierce公司）作封闭 处理。

（3）纯化了的抗OPN单链抗体在0.02%BSA中作系列稀释后加入已 包被有OPN的96-孔中，与OPN结合。

（4）将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了5000倍的鼠抗HSV 标记物的抗体（购自Life Technologies公司）用来检测结合了的单链抗体 （注：在scFv的C端含有一个HSV标记物）。

（5）将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了10000倍的山羊抗 鼠IgG抗体并偶联有HRP（辣根过氧化物酶）的偶联物（购自Sigma公 司）。

（6）将96-孔板最终清洗后，应用购自Sigma公司的HRP底物TMB 试剂作显色处理。

（7）最后，反应用0.5M的硫酸终止，并检测450nm的吸收光谱。

结果如图3所示，结果说明抗人OPN单链抗体能有效地结合人骨桥 蛋白。

实施例8用抗OPN抗体测试OPN在肿瘤细胞的表达

用纯化后的抗OPN抗体测定OPN在肿瘤细胞株的表达。实验步骤如 下：

（1）在24孔细胞培养板上用无血清培养基（Gibco公司）中首先培 养人卵巢癌细胞株OVCAR3、OV1063、SKOV3，人肺癌细胞株A549、 H1299，和阴性对照细胞株COS-1。每孔加入5x10⁵细胞数。

（2）在37℃的CO₂培养箱内培养48小时。

（3）从细胞培养上清液取100微升，加入96-孔板（MaxiSorp板， Nunc公司）包被，在2-8℃过夜。重组人骨桥蛋白（OPN）的蛋白质购 自中国义翘神州生物技术有限公司。

（4）包被后的96-孔板再用SuperBlock（购自Pierce公司）作封闭 处理。

（5）纯化了的抗OPN单链抗体在0.02%BSA中作系列稀释后加入已 包被有细胞培养上清液的96-孔中。

（6）将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了5000倍的鼠抗HSV 标记物的抗体（购自Life Technologies公司）用来检测结合了的单链抗体 （注：在scFv的C端含有一个HSV标记物）。

（7）将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了10000倍的山羊抗 鼠IgG抗体并偶联有HRP（辣根过氧化物酶）的偶联物（购自Sigma公 司）。

（8）将96-孔板最终清洗后，应用购自Sigma公司的HRP底物TMB 试剂作显色处理。

（9）最后，反应用0.5M的硫酸终止，并检测450nm的吸收光谱。

结果如图4所示，结果说明抗人OPN抗体能有效检测卵巢癌细胞和 肺癌细胞分泌的骨桥蛋白。