抗人骨桥蛋白单克隆抗体制备及其特异性研究

摘要

骨桥蛋白(osteopontin,OPN),是一种在多种组织和细胞广泛表达的磷酸化糖蛋白。OPN具有多种生物学功能,特别是OPN与自身免疫,肿瘤的生长和转移有密切的关系。
　　 目的:制备人骨桥蛋白(osteopontin,OPN)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其生物学功能.
　　 方法:利用RT-PCR技术克隆人骨桥蛋白(hOPN)基因.构建OPN原核表达质粒,转化BL21菌株,IPTG诱导表达rhOPN.利用纯化的rhOPN蛋白为免疫原,免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得抗人OPN蛋白mAb杂交瘤细胞株,以ELISA、Western blot对抗体特异性进行鉴定.通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别抗原位点进行分析.通过细胞侵袭试验检测抗人OPN单克隆抗体的功能.
　　 结果:获得2株抗人OPN单克隆抗体,分别命名为8F1和2B5,亚型测定皆为IgG1,且这2株抗体皆能很好地抑制细胞迁移.
　　 结论:本研究成功获得了2株抗人骨桥蛋白的特异性单克隆抗体,且这2株抗体皆能很好地抑制细胞迁移。为进一步研究OPN蛋白在自身免疫病和肿瘤中的功能提供了重要的工具.

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

第一章 OPN蛋白表达与纯化

1.1 材料设备

1.1.1 细胞株菌株

1.1.2 实验动物

1.1.3 载体

1.1.4 工具酶

1.1.5 试剂盒

1.1.6 主要试剂

1.1.7 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 人OPN基因的克隆、蛋白的表达纯化

1.2.2 OPN蛋白的原核表达

1.3 结果

1.3.1 人OPN基因的克隆

1.4 讨论

1.4.1 人OPN的克隆、表达和纯化

1.5 结论

第二章 鼠抗人OPN单克隆抗体的制备

2.1 材料设备

2.1.1 细胞株和实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 鼠抗SEB单克隆抗体的制备

2.2.2 anti-OPN mAb的纯化及目的蛋白的鉴定

2.3 结果

2.3.1 鼠抗OPN单克隆抗体的制备及鉴定

2.4 讨论

2.5 结论

第三章 抗OPN抗体特异性和功能分析

3.1 材料设备

3.1.1 主要试剂和耗材

3.1.2 主要仪器设备

3.2 方法

3.2.1 Western Blot试剂准备

3.2.2 WESTTERN BLOT分析检测蛋白表达

3.2.3 单抗的抗原结合表位分析

3.2.4 抗人OPN单克隆抗体抑制肿瘤细胞迁移实验

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 结论

全文结论

参考文献

综述 骨桥蛋白在免疫调节和肿瘤中的研究进展

致谢

攻读学位期间的研究成果