1,5-脱水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂

摘要

本发明涉及1,5-脱水山梨醇免疫检测领域，具体涉及一种1,5-脱水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂。本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体。本发明的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，特异性高，与1,5-脱水山梨醇的结合力强，敏感度远高于现有的抗1,5-脱水山梨醇抗体。本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原及抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体用于制备1,5-脱水山梨醇检测试剂，可以方便、准确地确定样品中的1,5-脱水山梨醇含量。

说明书

技术领域

本发明涉及1,5-脱水山梨醇免疫检测领域，具体涉及一种1,5-脱 水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂。

背景技术

1,5-脱水山梨醇（1,5-anhydro glucitol，1,5-AG），其结构式如式 （III）所示：

1,5-脱水山梨醇(1,5-anhydro glucitol，1,5-AG)又称为1,5-脱水葡 萄糖醇，是一种具有吡喃环结构的六碳单糖。1,5-AG的结构与葡萄 糖十分相似，两者区别仅在于葡萄糖C-1位置上的羟基被氢所取代。 1,5-AG主要存在于人体血液、脑脊液及各组织器官中，血清中1,5-AG 浓度一般为12-40mg/L，其代谢较稳定。当患有糖尿病时血清1,5-AG 浓度会显著降低，其机理是：糖尿病患者大量葡萄糖由尿中排出竞争 性的抑制了1,5-AG经肾小管的重吸收，使1,5-AG大量经尿排出，导 致血液中1,5-AG浓度下降，且下降程度与糖尿病的严重程度显著相 关。研究表明：血液中1,5-AG与葡萄糖(GLU)、糖化血红蛋白 (HbAlc)、果糖胺(FMN)都呈显著的负相关，其水平可反映近一周内 的血糖和尿糖情况，是糖尿病诊断与治疗的灵敏指标，日本于上世纪 九十年代初就把1,5-AG作为糖尿病诊断和疗效检测的重要指标。此 外，1,5-AG还有其它多种临床应用价值，例如，1,5-AG能反映餐后 高血糖峰值，可作为非糖尿病人群监测餐后高血糖相关的心血管危险 发生率的指标；血浆或尿中的1,5-AG浓度还能很好的反映慢性肾功 能衰竭病人的肾小管重吸收功能，因为1,5-AG重吸收系统比葡萄糖 重吸收系统更容易受损。

检测1,5-脱水山梨醇的方法有很多，如高效液相色谱法、微柱层 析法、化学发光法等，各有其优缺点。其中高效液相色谱法操作比较 复杂，且试剂需现用现配，不能长期保存，因此不适合大批量临床检 测使用；微柱层析法、化学发光法均需昂贵的专用仪器，操作繁琐， 也不适合用于临床常规检验。目前适用于自动化分析仪的1,5-AG测定 方法主要是酶法，包括ADP-HK-NADPH方法和GK-PROD方法。但是， 现有的酶法测定试剂盒成本较高、价格昂贵，且大多为干粉试剂，稳 定性、灵敏度、特异性等方面均不能满足临床检验的要求。

直接用1,5-脱水山梨醇免疫动物无法获得抗1,5-脱水山梨醇特异 性抗体。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的1,5-脱水 山梨醇检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种免疫原性强的1,5-脱水山梨醇 免疫原。

本发明的另一个目的在于提供使用本发明1,5-脱水山梨醇免疫 原制备得到的特异性强的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体。

本发明的另一个目的在于提供一种1,5-脱水山梨醇衍生物。

本发明的再一个目的在于提供一种1,5-脱水山梨醇免疫原的制 备方法。

本发明的又一个目的在于提供一种1,5-脱水山梨醇免疫原及抗 1,5-脱水山梨醇特异性抗体在制备1,5-脱水山梨醇检测试剂中的应 用。

本发明所采取的技术方案是：

1,5-脱水山梨醇免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：

式中，R为连接基团-(CH₂)_n-COO-，n是1至20之间的整数，载体 为具有免疫原性的蛋白质或多肽。

前述的1,5-脱水山梨醇免疫原，R为-(CH₂)₄-COO-。

一种抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，由所述的1,5-脱水山梨醇免 疫原免疫动物后生产得到。

前述的一种抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，所述的抗体为完整的 抗体分子，或者为，保留与1,5-脱水山梨醇特异性结合的能力的抗体 片段或抗体衍生物。

一种1,5-脱水山梨醇衍生物，其结构式如式（II）所示：

上述R为连接基团-(CH₂)_n-COO-，n为1至20之间的整数。

1,5-脱水山梨醇免疫原的制备方法，由载体和所述的1,5-脱水山 梨醇衍生物连接而成，取n=4时，其特征在于：1,5-脱水山梨醇衍生 物的制备步骤如下：

n=4时，1,5-脱水山梨醇衍生物的制备在合成化合物4时选用了1- 溴戊酸乙酯为合成原料，故所得的最终产物1,5-脱水山梨醇衍生物的 链接基团R为-(CH₂)₄-COO-，选用其它1-溴戊酸乙酯类似物进行实验 时，除n取值不同外，合成方法完全一致。

前述的1,5-脱水山梨醇免疫原的制备方法，载体与1,5-脱水山梨 醇衍生物的连接步骤为：

（1）将载体蛋白200mg溶解于50ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲 液中；

（2）将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的1,5- 脱水山梨醇衍生物、3.5ml二甲基酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml10mM， pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、 50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应 30min；

（3）将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅 拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到1,5- 脱水山梨醇免疫原。

1,5-脱水山梨醇免疫原及抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体在制备 1,5-脱水山梨醇检测试剂中的应用。

本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高 效价的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体。免疫原性高与所合成的1,5-脱 水山梨醇衍生物分子结构及所选载体种类有关，现有技术中1,5-脱水 山梨醇免疫原的免疫原性较弱，所产抗体的特异性、与1,5-脱水山梨 醇的结合力，敏感度都不如本发明。

本发明的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，特异性高，与1,5-脱水 山梨醇的结合力强，敏感度远高于现有的抗1,5-脱水山梨醇抗体。

本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原及抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体 用于制备1,5-脱水山梨醇检测试剂，可以方便、准确地确定样品中的 1,5-脱水山梨醇含量。

附图说明

图1是1,5-脱水山梨醇ELISA检测反应曲线；

图2是1,5-脱水山梨醇均相酶免疫反应曲线。

具体实施方式

本发明所采取的技术方案是：

1,5-脱水山梨醇免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：

式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。优选的，载体为具有 免疫原性的蛋白质。免疫原性载体一般是蛋白质或多肽；虽然其他足 够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体，但通常情况下选用蛋白 质作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白（KLH） 和甲状腺球蛋白。本发明中的载体优选为血清蛋白。

R优选为-(CH₂)_n-COO-，n是1至20之间的整数，特别的，R 为-(CH₂)₄-COO-。

一种抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，由上述1,5-脱水山梨醇免疫 原免疫动物后生产得到。

本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体分子，也包括保留 完整抗体特异性结合能力的抗体片断或者衍生物。本发明的抗体可以 是为多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。

本发明的抗体可以通过现有技术制备得到。获得多克隆抗体的典 型方法是使用单一的免疫原，在加或者不加佐剂后，在动物的一个或 者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠 或马。持续免疫一直进行，直至抗体效价达到最高。动物定时采血得 到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。单克隆抗体可通过体细胞杂 交技术来制作。

一种1,5-脱水山梨醇检测试剂，含有上述抗1,5-脱水山梨醇特异 性抗体、1,5-脱水山梨醇酶标偶联物和酶的底物。

1,5-脱水山梨醇检测试剂盒，含有上述抗1,5-脱水山梨醇特异性 抗体以及检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体和1,5-脱水山梨醇复合物 的指示试剂。

指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。 优选的，指示试剂由1,5-脱水山梨醇酶标偶联物和酶的底物所组成。

优选的，上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶 联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。

下面结合实施例，进一步说明本发明。

实施例一：1,5-脱水山梨醇衍生物的合成及其结构确认

以下实施例中使用的1,5-脱水山梨醇衍生物化学结构如式（IV） 所示：

该1,5-脱水山梨醇衍生物的合成路线如下：

具体的合成步骤如下：

化合物2的合成

1）称取3.2g（19.5mmol）化合物1（1,5-脱水山梨醇），溶解于 100mL二甲基甲酰胺（DMF）中，在氮气（N2）保护下加入12g（300 mmol）NaH（纯度60%w/t，溶于矿物油中），将此混合物冷却到0℃， 逐滴加入20mL(170mmol)溴化苄（BnBr），室温下搅拌16小时后， 缓慢加入100mL甲醇（MeOH），然后加入110mL纯化水，再用 HCl(4M)将此溶液的pH值调节至中性；

2）将上述溶液用二氯甲烷（CH₂Cl₂）萃取，使用水冲洗有机相， 加入MgSO₄干燥，过滤、浓缩，所得产物通过硅胶柱层析法（流动 相：PE/EtOAc=10:1）进行纯化，最后得到8g绿色油状的化合物2， 产率78%。

化合物3的合成

1）称取7.0g（13.4mmol）化合物2溶解于185mL干燥的甲苯 中，在氮气（N2）保护下逐滴加入140mL二异丁基氢化铝（DIBAL， 1M溶于甲苯中），将此混合物温度增加到50℃并搅拌2小时，将 溶液放置于冰上，加入185mL HCl（1M），并快速搅拌此混合物 30分钟；

2）将上述混合物用乙酸乙酯（EtOAc）稀释后，再用乙酸乙酯 （EtOAc）萃取水相，使用卤水冲洗结合的有机相，加入MgSO₄干 燥，过滤、浓缩，所得产物与甲基叔丁基醚/己烷（MTBE/hexane） 一起搅拌，最后得到4.2g白色非晶形固体化合物3，产率75%。

化合物4的合成

1）称取3.8g（8.9mmol）化合物3，溶解于20mL二甲基甲酰 胺（DMF）中，在氮气（N2）保护下加入1.78g（43.8mmol）NaH （纯度60%w/t，溶于矿物油中），将此混合物在室温下搅拌1小时， 在0℃下逐滴加入7.42g（35.5mmol）1-溴戊酸乙酯，然后再将此混 合物在室温下搅拌1小时；

2）将上述混合物用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使 用卤水冲洗有机相，加入MgSO₄干燥，过滤、浓缩，所得产物通过 硅胶柱层析法（流动相：PE/EtOAc=10:1）进行纯化，最后得到3.6g 无色油状的化合物4，产率75%。

化合物5的合成

1）称取2.6g（4.7mmol）化合物4加入40mL2N的NaOH水 溶液中，再加入5mL乙醇，制成混合物，将此混合物回流搅拌2小 时；

2）将上述反应混合物冷却至室温后用稀盐酸酸化，再用乙酸乙 酯（EtOAc）萃取，使用卤水冲洗有机层，加入MgSO₄干燥，过滤、 浓缩，最后得到2.3g化合物5，产率93%。

1,5-脱水山梨醇衍生物的合成

1）称取2.3g（4.3mmol）化合物5、1g钯/碳（Pd/C,10%）溶 解于50mL甲醇中制成混合物，将此混合物于50℃下搅拌过夜；

2）将上述混合物过滤，再将滤液浓缩得到1g1,5-脱水山梨醇衍生 物，产率88%，纯度>98%。

n=4时，1,5-脱水山梨醇衍生物的制备在合成化合物4时选用了1- 溴戊酸乙酯为合成原料，故所得的最终产物1,5-脱水山梨醇衍生物的 链接基团R为-(CH₂)₄-COO-，选用其它1-溴戊酸乙酯类似物进行实验 时，除n取值不同外，合成方法完全一致。

对上述所得纯化产物进行结构鉴定

1、利用Varian III plus300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱 扫描，采用TMS作为内标。结果如下：¹H NMR(300MHz,CD₃OD):δ 3.84-3.89(m,1H),3.57-3.72(m,1H),3.40-3.57(m,4H),3.22-3.34(m, 4H),3.13(t,J=4.5Hz,1H),2.28(t,J=7.2Hz,2H),1.57-1.69(m,4H)。 表征为式（Ⅲ）所示的1,5-脱水山梨醇衍生物。

2、利用色谱/质谱技术（LCMS）对得到的衍生物进行分析鉴定， 采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用 正离子或负离子化模式。色谱柱规格为：Welchrom XB-C18(50×4.6 mm,5μm)，柱温为30℃，流速为1.5mL/min，检测波长为214nm， 流动相为95%水(TFA)-5%乙腈（CH₃CN）～40%水(TFA)-60%乙腈 （CH₃CN），6min，最后在此条件下持续0.5min。LCMS结果显示： 纯度>98%，保留时间：2.063min，分子量：264，分子离子：265 ([M+H]⁺)。

综合上述结果，可以确定该最终所得化合物为式（IV）所示的 1,5-脱水山梨醇衍生物。

实施例二：BSA-1,5-脱水山梨醇衍生物免疫原的合成

BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原由牛血清白蛋白BSA与式（II）所示 的1,5-脱水山梨醇衍生物的-(CH₂)_n-COO-基团连接而成，在本实施例 中，以n=4为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：

（1）将牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（200mg）溶 解于50ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；

（2）将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的1,5-脱 水山梨醇衍生物、3.5ml二甲基酰胺（dimethylformamide， DMF）、3.5ml乙醇、7.0ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、 200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代 琥珀酰亚胺（N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS），将这些 化学品在室温下搅拌溶解反应30min；

（3）将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜， 得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到1,5-脱水 山梨醇免疫原。

类似的，n取1～20范围内的其他整数时，用同样的方法可 以制备出如式（I）所示的1,5-脱水山梨醇免疫原。当然，载体 仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白（KLH） 和甲状腺球蛋白。优选的，载体为牛血清白蛋白。

本发明中仅提供连接基团R为-(CH₂)_n-COO-，且n=4的1,5- 脱水山梨醇衍生物的合成实施例并进行了相关后续实验，由于连 接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与 所合成的1,5-脱水山梨醇衍生物分子结构及所选载体种类有关， 因此理论上n取1至20之间的任意整数时，实验结果并无显著 差异，使用不同n值的1,5-脱水山梨醇衍生物制备的1,5-脱水山 梨醇免疫原均具备强免疫原性，相应制备的特异性抗体均具有优 异性能。

实施例三：抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的制备

将上述制得的BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原采用常规方法接种实 验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：

用PBS将上述合成的BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原稀释至1.0 mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合， 对实验动物兔进行注射。

2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上 述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。

对上述实验动物兔取血，分离纯化得到抗1,5-脱水山梨醇特异性 抗体，经测定，该抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的效价为1:30000。

实施例四：1,5-脱水山梨醇ELISA检验

采用制得的抗体进行1,5-脱水山梨醇的ELISA检验。

该检验是利用竞争性免疫分析法来测定液体样本中的1,5-脱水 山梨醇含量。

样本中的1,5-脱水山梨醇与偶联的1,5-脱水山梨醇衍生物 （HRP-1,5-脱水山梨醇衍生物酶偶联物）竞争结合包被在酶联板中抗 体上的有限位点。如果液体样本中几乎没有或没有1,5-脱水山梨醇， HRP酶偶联的1,5-脱水山梨醇衍生物就会与酶标板中的抗体结合。相 反的，如果液体样本中含有大量或一定数量的1,5-脱水山梨醇，那么 酶-1,5-脱水山梨醇衍生物偶联体就会减少与抗体的结合，从而使显色 信号减弱。因此，检验产生的吸光度与液体样本中的1,5-脱水山梨醇 含量成反比。其剂量效应曲线如图1所示。

实施例五：1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检验

采用制得的抗体进行1,5-脱水山梨醇的均相酶免疫检验 （Homogeneous Enzyme Immunoassay）。

该检验是一种竞争性反应，反应体系中与抗体结合的1,5-脱水山 梨醇和游离的1,5-脱水山梨醇不需要通过固相来分离。该检验的基本 原理是，液体样本中游离的1,5-脱水山梨醇与偶联在葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH）上的1,5-脱水山 梨醇衍生物对特异性抗体的结合位点进行竞争。液体样本中的1,5- 脱水山梨醇竞争性的取代与抗体结合的1,5-脱水山梨醇酶偶联物，并 使其从抗体的结合位点上释放出来，从而使酶恢复活性。因此，液体 样本中1,5-脱水山梨醇的含量越多，游离的1,5-脱水山梨醇衍生物 -G6PDH酶偶联物就越多，从而能得到更强的信号。

其均相酶免疫检验得到的剂量效应曲线如图2所示。

实施例六：药物干扰试验

选取45种常见药物，调整浓度至10.0μg/ml，进行干扰试验测定。 常见的45种药物以及测定结果具体参见表1。

表1常见干扰药物测定结果

测定结果：上述45种常见药物等价于1,5-脱水山梨醇的浓度均小 于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗1,5-脱水山梨醇的特异性抗体。 需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明 的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等 效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在 本发明的专利保护范围内。