自活病毒疫苗中清除宿主细胞组分

摘要

生产其为高减毒的以及仅含有最低限度动物来源组分或不含动物来源组分的活疫苗为合乎需要的。与使用更不确定的原代细胞相比，当使用特别设计的细胞系作为生产者基质时，可更好地实现高减毒活病毒的生产。然而，由此生产的活病毒包含来自细胞系和细胞培养物的不合乎需要的组分。本发明涉及生产和纯化适于接种的活包膜病毒的方法。

说明书

生产其为高减毒的以及仅含有最低限度动物来源组分或不含动物来源组分的活疫苗为合乎需要的。与使用更不确定的原代细胞相比，当使用特别设计的细胞系作为生产者基质时，可更好地实现高减毒活病毒的生产。然而，由此生产的活病毒包含来自细胞系和细胞培养物的不合乎需要的组分。本发明涉及生产和纯化适于接种的活包膜病毒的方法。

发明背景

尽管疫苗已广泛应用并防御出人意料广谱的传染病，但仍不能针对许多潜在的和慢性病原体产生防护性或治疗性免疫，所述病原体包括结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒和引起疟疾的疟原虫(Plasmodium)原生生物。主要引起抗体反应的常规方法未成功提供防护性或治疗性免疫。认为这是由于表位为可变的、经常被微生物诱饵掩蔽或保护的事实所致，或者因为感染周期的动态变化(dynamic)可将病原体隔离到不易接近抗体的区室中。

与使用灭活病毒体或纯化的亚单位接种相比，活疫苗诱导亦涉及免疫系统的细胞区室的广泛反应。对于自然感染的安全限制而言，所述疫苗株为减毒的，但是对于某些病毒而言则存在回复成致病毒株的风险((Zurbriggen等2008年于Appl Environ Microbiol 74, 5608-5614)或者对某些受接种者或其接触者存在潜在残留毒力的风险(Marris 2007年于Nat Med 13, 517)。此外，与20世纪70年代的天花根除计划相比，疫苗载体的任何致病可能性可因国际旅行和无免疫应答的个体数量的增加而放大。因此，在任何新型活载体中，更高的安全度为高度合乎需要的(Parrino和Graham 2006年于J Allergy Clin Immunol 118, 1320-1326)。

现代载体化的疫苗(Excler等2010年于Biologicals 38, 511-521；Plotkin 2009年于Clin Vaccine Immunol 16, 1709-1719)将活疫苗的优势与高减毒载体固有的强大安全性特征组合，并因此可提供新的治疗方法或防护方法。复制缺陷型甲病毒属载体和高减毒痘病毒为有前景的载体，所述高减毒痘病毒包括改良的安卡拉痘苗(Modified Vaccinia Ankara, MVA)、禽痘(例如FP9毒株)和金丝雀痘(ALVAC)。这些载体不会在人细胞中复制并因此甚至可安全地给予无免疫应答的受者(例如(Cebere等2006年于Vaccine 24, 417-425；Dorrell等2007年于Vaccine 25, 3277-3283；Jin等2002年于J Virol 76, 2206-2216；Webster等2005年于Proc Natl Acad Sci U S A 102, 4836-4841))。它们可容纳大型插入片段并且提供对抗载体化抗原的免疫系统的强烈刺激(例如(Drillien等2004年于J Gen Virol 85, 2167-2175；Liu等2008年于BMC Immunol 9, 15；Ryan等2007年于Vaccine 25, 3380-3390；Sutter和Moss 1992年于Proc Natl Acad Sci U S A 89, 10847-10851；Sutter等1994年于Vaccine 12, 1032-1040))。

其缺点与有益特性直接相关：高度减毒使得每个剂量需要非常大量的感染单位以达到完全效力，并且因为宿主范围受限，生产需要改良的细胞基质(在一些情况下来自禽类供体)或特殊包装的细胞系。

为用确切的数字和MVA作为实例(并非将本申请仅限于MVA)来说明工业挑战的程度：

剂量需求预计为10⁸个感染单位的MVA/接种(Coulibaly等2005年于Virology 341, 91-101；Gilbert等2006年于Vaccine 24, 4554-4561)。对于对抗诸如HIV或结核病等复杂传染病的全球计划，每年可需要数亿剂量的高减毒痘病毒。相比之下，同样在禽类细胞生产的较低减毒的毒株包括对抗麻疹、流行性腮腺炎和黄热病的疫苗；这些分别仅需要10³、2 x 10⁴和5.5 x 10⁴个感染单位/剂量(信息来自Sanofi Pasteur的YF-VAX和Merck的M-M-R II的包装说明书)。痘苗株Dryvax在对抗天花的常规接种中的防防性剂量为2.5 x 10⁵ pfu (Rotz等2001年于MMWR Recomm Rep 50, 1-25；问答CE21-27)，为MVA推荐剂量的1/400。

然而，MVA的生产依赖于禽类细胞。目前，适于禽类宿主的疫苗株仅在含胚鸡蛋中或在制备自这类蛋的成纤维细胞上生产，虽然其为历史悠久的技术，但亦伴随某些缺点。因原代细胞在数次传代内经历衰老而使它们必须连续地供应。在时间安排和制备上的差异可导致许多变化(Monto等1981年于J Clin Microbiol 13, 233-235；White和Fazekas De St Groth 1959年于J Hyg (Lond) 57, 123-133)。作为成纤维细胞来源的含胚蛋来自昂贵的SPF (无特定病原体)群。SPF状态需要精心饲养，而跨国界运输材料使物流复杂化并且亦导致短缺。即使就地使用SPF预防措施，亦不能始终防止外来物质的污染。因为从含胚蛋收集到疫苗生产的时间很短，所以对半成品进行外来物质的检测(Philipp和Kolla 2010年于Biologicals 38, 350-351)。偶尔通过质量检测确认污染时，必须废弃整批疫苗(Enserink 2004年于Science 306, 385)。

最后，使用原代细胞亦不能稳定地表达转基因，所述转基因可进一步增进高减毒病毒的产生或允许复制缺陷型载体的包装。

本发明人已使来自疣鼻栖鸭(muscovy duck)胚的原代细胞无限增值化以替换原代细胞作为基质(Jordan等2009年于Vaccine 27, 748-756)，并基于此细胞系开发了用于病毒疫苗的化学上确定的生产过程。他们还产生了基于此细胞系的包装细胞(WO 2009/156155)。使用此可得技术，目前可将开发向自在化学上确定培养基中且受现代病毒载体感染的连续培养物生产疫苗扩展。

此刻的主要挑战为要符合卫生监管指导方针的要求。此处适用的指导方针之一为1998年的World Health Organization Technical Report Series 878 (世界卫生组织技术报告系列878)。建议(参见自第26页开始的章节)每剂活载体10 ng DNA的水平会是可接受的。

据本发明人所知，目前还没有获准的自传代细胞系生产的活疫苗。当前获准的活疫苗使用原代细胞生产，所述原代细胞例如鸡胚成纤维细胞(减毒的麻疹、流行性腮腺炎、黄热病和流感病毒)、MRC-5或WI-38人二倍体细胞制品(风疹和水痘病毒)和Vero细胞(痘苗病毒和轮状病毒)。对于这些细胞系，对于宿主细胞来源组分的监管程序较不严格，这主要是因为存在大量的经验。然而，如上对于鸡胚成纤维细胞的论述，任何原代细胞制品均具有相当大的缺点以及供应上的限制。这亦适用于可认为是传代细胞系的Vero细胞。然而，此细胞系仅在低的细胞传代水平下才可为疫苗生产所接受(Manohar等2008年于Biologicals 36, 65-72)。

现代传代细胞系克服了原代细胞的许多缺点，但是引入了新挑战，其需要确定可能与带入疫苗制品的宿主细胞组分有关的风险并随后使之降至最低。因此，本发明人提供生产和纯化活疫苗的方法，所述方法克服先有技术疫苗的问题并提供另外的优势。

发明概述

在第一方面，本发明涉及包括以下步骤的病毒纯化的方法：

(i)在细胞裂解之前向产病毒细胞中加入一种或多种离液盐和/或极性或带电大分子，

(ii)裂解所述产病毒细胞，和

(iii)将所述病毒与在所述产病毒细胞中或其细胞培养基中包含的至少部分非病毒物质分离。

在第二方面，本发明涉及包括以下步骤的病毒纯化的方法：

(i)裂解产病毒细胞，和

(ii)将所述产病毒细胞的裂解物施涂到硅质物质上。

在第三方面，本发明涉及具有可用依照第一和/第二方面的方法获得的纯度的一种或多种病毒。在第四方面，本发明涉及第三方面的一种或多种病毒，其用于诱导免疫反应。在第五方面，本发明涉及第三和/或第四方面的一种或多种病毒，其用于预防或治疗感染。

本发明此概述未描述本发明的所有特征。

发明详述

1.免责声明

在下文中详细阐述本发明之前，要理解的是，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。亦要理解的是，本文所用术语仅以描述具体实施方案为目的，而非意图其限制本发明的范围，所述范围仅受随附权利要求的限制。除非另有规定，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员的通常理解相同的含义。

优选本文所用术语按在“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations) (生物技术术语的多语种词汇表：(IUPAC推荐))”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.和K?lbl, H.编辑，(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)中所述定义。

本说明书的全文引用数篇文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明书、GenBank检索号序列提交书等)，不论上下文，均通过引用以其整体结合到本文中。不应将本文中的事物解释为承认本发明因先有的发明而无权享有先于这类公开内容的资格。

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素以具体的实施方案列出，然而应理解的是，它们可以任何方式和以任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的实施例和优选的实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应理解为支持和包含将明确描述的实施方案与任何数量的公开要素和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非文段另有指示，否则本申请中描述的全部要素的任何排列和组合应视为通过本申请的说明书公开。本发明的焦点放在作为最相关污染物的DNA的去除。然而，宿主细胞来源的蛋白质的去除亦很重要并且在实施例1中具体考虑。随着DNA的成功去除，宿主细胞来源的蛋白质的清除常常为高度需要的副效应。

除非文段另有要求，否则遍及本说明书和所附权利要求的单词“包含”以及诸如“包括”和“包括的”等变体，应理解为意味着包含所述的整数或步骤或者一组整数或步骤，但不排除任何其它的整数或步骤或者其它组整数或步骤。

除非文段另有明确指示，否则本说明书和随附权利要求所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数的指示对象。

2. 焦点

本发明人在本文中公开结果并描述进展，所述结果和进展可应用于减少宿主细胞污染并因此利于解决从传代细胞系生产活疫苗和/或载体的领域的重大挑战。

作为内源性寄生物，病毒依赖于宿主细胞功能以用于后代形成。在其生命周期中，病毒可掺入宿主细胞来源的组分，例如将核糖体掺入沙粒病毒的病毒体中或将亲环蛋白A掺入HIV颗粒中。这类掺入的细胞因子可有利于再感染的第一步(核糖体)或者甚至对于病毒成熟而言为必需的(亲环蛋白A)。它们不应被纯化程序去除。本文所述方法在病毒形态发生完成之后对病毒悬液施以转化活性，并因此不影响病毒颗粒的有益整合组分。

病毒体亦可非特异地与细胞组分结合。用于此相互作用的感染性病毒的易接近表面可以纯粹为蛋白质的(例如腺病毒和微小RNA病毒)或者基于脂膜(例如甲病毒属、狂犬病和痘苗病毒)。后者称为包膜病毒，并且对于这组病毒而言纯化特别困难：病毒包膜可包含非常复杂和易变的不同分子的集合，所述分子范围从糖蛋白中的磺基变化到鞘脂中的脂肪醇，其针对来源于培养基自身、生产者细胞或其它病毒颗粒的各种结合配偶体，各自或组合呈现一系列静电、范德瓦尔斯或疏水相互作用表面。本发明利于本质上适于此化学反应的生产和纯化过程。

MVA感染细胞的典型的粗裂解物含有2.5 x 10⁵ ng/mL DNA和3.0 x 10⁹ pfu/mL MVA。使用1 x 10⁸ pfu作为疫苗剂量，通常获得8300 ng DNA/剂量，与根据WHO指导方针可容许的DNA量相比超出800倍以上。此DNA污染以及其它污染为巨大的挑战，必须在来自任何传代细胞系的载体疫苗可大规模生产和使用之前将其解决，这对于对抗高破坏性传染病的全球接种而言为必需的。

诸如Benzonase?等DNA核酸酶可帮助减少DNA的量和大小但其昂贵，并且如果核酸与碎片或病毒颗粒结合则因位阻所致而不完全有效。此外，向制品中添加的任何核酸酶亦必须在处理完成后去除以符合监管要求。因此，即使裂解物中包含DNA的酶促水解，将DNA降至可接受的水平仍为必须解决的持续问题。

本发明人发现并在本文中描述了允许防止污染物转移到病毒制品中的程序的组合。使用特定的化学品以及同渗容摩和pH的改变来破坏病毒体和宿主细胞或宿主细胞碎片之间的复合体，其优选在裂解后进行。

本发明人还确定可防止污染物和病毒包膜之间的复合体形成。这可通过在宿主细胞仍大部分完整(即宿主细胞仅少量发生裂解或未发生裂解)的时间开始收获来实现，所述裂解可在增殖期间发生，例如因病毒芽殖期间的裂解所致或者由于衰老和/或凋亡所致。在这一方案中，紧接纯化的第一步为加入与感染性病毒或与污染物结合的掩蔽化合物，例如离液盐和/或极性或带电大分子。这些掩蔽化合物保护介导病毒体与宿主细胞因子或碎片结合的任何结合部位免受下游加工。

3. 实施方案

因此，在第一方面，本发明涉及包括以下步骤的病毒纯化的方法：

(i)在细胞裂解之前向产病毒细胞中加入一种或多种离液盐和/或极性或带电大分子，

(ii)裂解所述产病毒细胞，和

(iii)将所述病毒与在所述产病毒细胞中或其细胞培养基中包含的至少部分非病毒物质分离。

对于将病毒与不需要的杂质分离，本发明人借助于使用硅藻土来纯化而非去除病毒的独特步骤。

因此，在第二方面，本发明涉及包括以下步骤的病毒纯化的方法：

(i)裂解产病毒细胞，和

(ii)将所述产病毒细胞的裂解物施涂到硅质物质上。

此外，在优选的实施方案中，第一方面方法的步骤(iii)通过经硅质物质的过滤来进行。对于第二方面亦优选的是优选通过过滤将裂解物与硅质物质分离。

4. 硅质物质

硅质物质优选选自硅藻土、酸洗硅藻土、酸蚀硅藻土或用硅烷处理的硅藻土。在优选的实施方案中，使用0.1 g-20 g (优选3 g-10 g)硅质物质(优选硅藻土)/mg非病毒物质(优选非病毒胞内或胞外物质)。硅质物质的量最优选基于裂解液中的DNA含量来确定，裂解液中的每mg DNA使用0.1 g-20 g、优选3 g-10 g硅质物质。优选的是，将裂解物与硅质物质优选通过搅拌进行孵育。如果将裂解物通过硅质物质过滤，则优选通过将硅质物质施涂至孔隙宽度小于所用的相应硅质物质的平均颗粒宽度的漏斗或者其它阻留装置来实现。

5. 离液序列高的物质和极性或带电的大分子

为了将条件调向与病毒相比优先结合DNA，本发明人将离液盐和/或极性或带电大分子引入制品中。因此，在优选的实施方案中，第二方面的方法包括在步骤(i)之前或之后加入一种或多种离液盐和/或极性或带电大分子。预期这类添加物杀死大部分感染性病毒，这使得所述制品不适于载体疫苗应用。一个原因在于，根据定义，离液剂和极性或带电大分子利于病毒和非病毒组分周围溶剂化壳的形成。所述溶剂化壳亦可影响病毒完整性或宿主质膜处的受体识别。

出人意料的是，本发明人发现这些相对需求的平衡(定义为“温和的离液序列高的环境”)，其允许以非常高的产率回收感染单位并同时去除污染物以用于进一步的下游加工。此发现防止色谱材料中孔的堵塞并防止交换纯化或亲和纯化所需的色谱基质中官能团的掩蔽。因此，此步骤亦显著提高裂解物进一步加工的效率。可用于产生“温和的离液序列高的环境”的离液盐为那些屏蔽电荷并防止盐桥稳定的盐，例如尿素、硫脲、盐酸胍、高氯酸锂、溴化钠和氯化钾。这些为本领域众所周知。然而，为产生所需温和的离液序列高的环境，所述离液盐以不减少分离病毒的感染性的浓度添加。在其中已在孵育期间添加离液盐的实施方案中，优选的是，选择离液盐的量使得细胞裂解不显著增加。

在第一和第二方面方法的优选实施方案中，所述离液盐和/或极性或带电大分子与一种或多种非病毒物质(优选胞内或胞外物质)和/或与所述病毒结合。

在特别优选的实施方案中，能够产生温和的离液序列高的环境的离液盐为NaBr和/或KCl和/或尿素，任选与硫酸葡聚糖和/或聚磷酸和/或聚乙烯吡咯烷酮组合。优选离液盐和/或极性或带电大分子的浓度为使得病毒基本上保持完整和/或感染性的浓度。基本上完整的意指病毒在血清(优选人血清)中的半寿期为未使用离液盐和/或极性或带电大分子处理的病毒的半寿期的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%。更优选NaBr的浓度为5 mM-750 mM、25 mM-700 mM、50 mM-650 mM、75 mM-600 mM、100 mM-550 mM、125 mM-500 mM、150 mM-450 mM、175 mM-400 mM、或优选200 mM-350 mM。优选pH在7.4-8.0、6.0-6.5、6.5-6.8、6.8-7.2、更优选7.2-7.4的范围内。

优选KCl的浓度为1 mM-750 mM、15 mM-700 mM、30 mM-650 mM、45 mM-600 mM、60 mM-550 mM、75 mM-500 mM、90 mM-450 mM、105 mM-400 mM、或优选120 mM-350 mM。优选尿素的浓度为0.2 mM-2 M、5 mM-1 M、或100 mM-500 mM。优选硫酸葡聚糖的浓度为5 mg/l-1000 mg/l、10 mg/l-800 mg/l、或优选15 mg/l-600 mg/l。优选聚磷酸的浓度为0.1 mM-100 mM、0.2 mM-80 mM、或优选0.3 mM-60 mM。优选聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.2%-10%、1%-8%、2%-6%、3%-4%。优选吐温-20和/或辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(IGEPAL)的浓度各自为0.05%-0.25%、0.1%-0.20%、或优选0.13%-0.17%。优选pH在7.4-8.0、6.0-6.5、6.5-6.8、6.8-7.2、更优选7.2-7.4的范围内。

6. 时间安排详述

出人意料的是，本发明人发现亦可在裂解之前(例如优选在感染时或紧随其后)添加一种或多种离液盐和/或极性或带电大分子来达到本发明的效果。这很出人意料，因为这些物质的某些已用于下游加工，但仍与生产过程的多个阶段相容，在所述阶段中细胞生存力必须足以用于病毒复制。因此，优选在细胞受病毒感染时、紧接感染之后、在病毒生产峰值时或者临细胞裂解之前添加离液盐和/或极性或带电大分子。

7. 裂解详述

技术人员了解如何裂解细胞以释放病毒。然而，根据各种宿主细胞和待生产的各种活病毒，从宿主细胞内或从宿主细胞表面、或者从与其它病毒体或细胞碎片的复合体中有效释放病毒的裂解方法可能需要优化。所述优化包括确定最适方法(例如机械上使用超声、混合或通过窄阀的高压匀浆；或者化学上使用渗透性冲击或去污剂)、最适能量或试剂输入(例如超声处理的强度和持续时间或者去污剂的浓度)、最适pH和培养基添加物浓度(用以维持自细胞环境中释放的病毒的活性，例如在纯化的重组人白蛋白存在下使用pH 7.2)和最佳时间点(例如在细胞完整性和病毒产率两者都高的时间裂解，或者在细胞完整性因细胞病变效应而非常低的时间裂解)。

本发明的方法与不同的细胞裂解方法相容。优选的裂解方法包括通过使用一个或多个极端温度的循环(优选至少-85℃和25℃的温度)、去污剂(优选选自吐温-20和Triton X-100)、超声和渗透性冲击处理来破碎。亦考虑在存在或不存在掩蔽化合物的情况下以及在存在或不存在促进凋亡的条件下，通过使感染进行到越过峰值产率利用细胞病变效应来裂解。凋亡的优势在于，可利用细胞培养物中的自然过程来消化DNA和去除蛋白质，而载体颗粒受包膜保护。因此，除先前描述的裂解方法之外或作为备选方案，优选细胞裂解由一种或多种下列坏死或程序性细胞死亡(优选凋亡)所致。

所述方法与在感染周期完成之后很久收获的受感染细胞悬液相容。例如， MVA的感染效价在感染后48 h达到峰值，并且感染后72 h的收获得到可根据我们的方法进一步纯化的裂解物。

8.进一步加工详述

裂解物的另外操作可在通过切向流过滤或连续流动离心浓缩感染单位之前进行，或者在经由离子交换、疏水相互作用或假亲和力(pseudoaffinity)的色谱法纯化之前进行。一个重要的观察结果为，即使在低相对离心力下，高减毒痘病毒的感染单位仍因沉降而损失。为了在色谱法之前使裂解物澄清，优选进行特定的过滤程序，因为这些病毒非常大(扁平柱面的长轴为360 nm (Cyrklaff等2005年于Proc Natl Acad Sci U S A 102, 2772-2777))。

因此，在优选的实施方案中，本发明的方法进一步包括细胞裂解之后的以任何顺序的一个或多个下列额外的纯化步骤：

a)预过滤，例如切向流过滤、连续流动过滤或通过诸如整料等大孔材料的过滤，

b)色谱法，例如经由离子交换、疏水相互作用或假亲和力，

c)离心分离，例如连续流动离心，和

d)絮凝。

优选在所述病毒过滤步骤之前和/或之后进行所述一个或多个额外的纯化步骤。

因此本发明的一个特别优选的实施方案为在硫酸葡聚糖、NaBr和KCl存在下，将来自受感染细胞的10倍浓缩、5倍浓缩、单倍浓缩或稀释的裂解物过滤通过二氧化硅基质。此过滤步骤可重复一次或多次。之后，可获得澄清溶液并且可通过所述一个或多个额外的纯化步骤(例如假亲和色谱、切向流过滤或连续流动离心)从此制品中回收病毒、优选感染性病毒。

9. 合适的宿主细胞

在本发明的第一和/或第二方面方法的一个实施方案中，产病毒细胞为分裂细胞，优选为无限增殖细胞。优选处于未感染状态的所述产病毒细胞来源于诸如AGE1.CR、AGE1.CR.pIX、AGE1.HN、AGE1.R06E、AGE1.R05T、MDCK (马-达犬肾（Madin-Darby Canine Kidney）；ATCC CCL 34)、BHK (幼仓鼠肾) 21 (ATCC CCL-10)、BHK TK (ECACC号85011423)、HEK (人胚肾) 293 (ATCC CRL 1573)或DF-1 (Doug Foster开发的鸡成纤维细胞系)等传代细胞系。细胞系AGE1.CR.pIX (17a11b)于2005年11月24日通过ProBioGen, Goethestr. 54, 13086 Berlin, Germany以保藏号DSM ACC2749保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany。细胞系AGE1.HN (NC5T11#34)于2005年11月4日通过ProBioGen, Goethestr. 54, 13086 Berlin, Germany以保藏号DSM ACC2744保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany。细胞系AGE1.R06E于2008年4月3日通过ProBioGen, Goethestr. 54, 13086 Berlin, Germany以保藏号DSM ACC2902保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany。

在另一个实施方案中，所述产病毒细胞来源于疣鼻栖鸭胚或人神经元组织。术语“分裂细胞”是指能够增殖的细胞。术语“无限增殖细胞”或“传代细胞系”是指能够增殖至少50个细胞倍增、优选至少100个细胞倍增以及最优选无限数量的细胞倍增的细胞或者包含所述细胞的细胞系。

10.病毒详述

在本发明的第一和/或第二方面方法的另一个实施方案中，所述病毒为减毒的和/或复制缺陷的。减毒和复制缺陷可通过去除涉及致病性和/或病毒在宿主细胞内包装的基因来实现。显然这些基因取决于所用的具体病毒并且为本领域所熟知。优选所述病毒为活疫苗或载体疫苗。在另一个实施方案中，所述病毒为包膜病毒。优选所述病毒选自痘病毒科，最优选改良的安卡拉痘苗(MVA)、禽痘和金丝雀痘；披膜病毒科，最优选甲病毒属和风疹病毒；单股负链病毒目(Mononegavirales)，最优选狂犬病病毒和麻疹病毒；正粘病毒科，最优选甲型和乙型流感病毒；以及疱疹病毒科，最优选水痘带状疱疹病毒和巨细胞病毒。

11.污染详述

在本发明的第一和/或第二方面方法的又另一个实施方案中，所述非病毒胞内或胞外物质对于病毒作为疫苗的应用而言为不合乎需要的。在最优选的实施方案中，所述非病毒胞内或胞外物质为多核苷酸(优选为DNA以及更优选为细胞DNA)，或者宿主细胞蛋白质，或者用于宿主细胞培养或病毒生产的培养基添加物。

通常自流出液(flow through)中回收具有增加的纯度和/或浓度的活病毒。因此，两种方法均优选包含另一个步骤，其为回收第一方面的分离步骤(iii)的流出液，或者回收在第二方面的步骤(ii)中将裂解物施涂至硅质物质之后的流出液。

12. 制剂详述

在第三方面，本发明涉及具有用本发明的第一和/或第二方面方法可获得的纯度的一种或多种病毒。优选所述纯度为这样的纯度，其使得所述一种或多种病毒基本上不含所述非病毒细胞来源的物质，所述物质优选为多核苷酸以及更优选为DNA。更优选病毒的量大于1 x 10²、1 x 10³、1 x 10⁴、3.5 x 10⁴、1 x 10⁵、1 x 10⁶或优选1 x 10⁷ pfu/ng多核苷酸，所述多核苷酸包含在细胞培养基中或者包含在来源于细胞培养基的混悬液中，优选为DNA。用语“在培养基中”是指多核苷酸浓度不包括病毒颗粒中含有的病毒基因组这一事实。“基本上不含”意指包含在产病毒细胞或其细胞培养基中的非病毒物质的至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或优选至少99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%已被去除。

在另一个实施方案中，将第三方面的一种或多种病毒与所述一种或多种离液序列高的物质和/或极性或带电大分子结合。

附图简述

以下附图仅说明本发明而不应以任何方式解释为限制如通过随附权利要求指出的本发明的范围。

图1：使用化学上确定的培养基在生物反应器中的可缩放病毒生产过程的说明。图(A)显示在用于生产野生型MVA的生物反应器过程的不同阶段，AGE1.CR传代细胞系在化学上确定培养基中的形态。第0天是指感染的时间，负天数为增殖期，正天数为直到收获的形态。图(B)提供所述时间点的细胞密度和感染单位。图(C)证实传代细胞系的一个有利特性：可将所述基质自冷冻管中融化并在生产设备中扩增，除产生培养基所需的纯化学品外无需外部供给。

图2：包括亲和色谱的下游加工的说明。图(A)显示在收获很大程度上完整的细胞时、这类MVA-感染细胞通过TFF浓缩时和通过超声处理裂解时的培养物形态。(B)提供通过肝素亲和色谱纯化MVA的色谱图。通过紫外光吸收和各流分对MVA抗原的免疫印迹(色谱图下的蓝斑)来监测色谱。图(C)显示MVA感染单位的浓度和产率、上样中的总蛋白质和DNA、流出液体积和合并的洗脱液体积。

图3：破坏病毒:DNA复合体的说明。硅藻土的渐增量通过横坐标下的三角形表示，超声处理期间存在或不存在离液剂通过(+)或(-)符号表示。将此实验结果转换成感染单位与ng DNA的比率。较大数值表明病毒的蓄积和DNA的清除，其比较小数值优选。

图4：使用硅藻土清除DNA和回收病毒的说明。红线表示粗裂解物中DNA的水平，黑线表示粗裂解物中pfu的水平。在右下角的图表中，黑线表示粗裂解物中pfu:ng DNA的比率。

图5：根据图3所述实验的数据的产率展示。

图6：(A)通过连续过滤进一步清除DNA，和(B)比较离心后和过滤后的制品中感染性病毒的浊度和含量。

实施例

下文给出的实施例仅用于说明性目的，而非以任何方式限制上述的本发明。

实施例1：在可缩放化学生产过程中的病毒生产

在化学上确定的培养基CD-U2 (由Biochrom, Germany或 PAA, Austria生产)中以搅拌悬浮培养AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞系。

小规模悬浮培养在Multitron (Infors HT, Switzerland)振荡培养箱的通气管或通气瓶中进行，使用5 cm平台振幅和180 rpm (管)或150 rpm (瓶)旋转以及8% CO₂气氛。

1 l规模生物反应器中的培养使用cellferm pro (DASGIP, Germany)并联反应器系统进行。以50 l规模的生物反应器运行利用具有Bioengineering (Switzerland)数字控制单元的一次性SUB 50系统(Hyclone, USA)进行。默认设置为7.2个单位的pH (使用0.5 M NaOH以及经由CO₂补给来控制)、50%的氧饱和度和12 W/m³的搅拌能量输入。Wave反应器中的培养使用BIOSTAT CultiBag RM (Sartorius, France)进行，其程序设置为50%氧饱和度、7.2个单位的pH、6°摇摆振幅和12次摇摆/min的频率。

对于高减毒痘病毒或甲病毒属的生产，在CD-U2中以50%的反应器或容器体积(例如，在1 l DASGIP装置中为400 ml)培养细胞。接种密度为0.8-1 x 10^6个细胞/mL。三天后，细胞密度为4-6 x 10⁶个细胞/mL。加入1体积的CD-VP4病毒生产培养基(专有，由Biochrom生产)并直接向培养物中加入MVA (野生型ATCCVR-1508)。MVA用作说明目的的非限制性实例；本领域技术人员可将所述进展应用于其它包膜病毒。

病毒分离通过超声处理受感染细胞悬液来进行，对于直到3 mL的体积，使用Branson S250-D装置以10%能量驱动3.2 mm超声波仪尖端超声处理45 s，或者对于大于400 ml的体积以及用以证实所述过程的可缩放性，使用连续流式小室以100%能量和0.23 L/min的流速超声处理。

切向流过滤(TFF)使用具有平均孔径为0.1 μm和表面积为850 cm²的中空纤维盒(GE Healthcare Life Sciences, USA)进行。系统参数为常规的0.3巴跨膜压、10 L/min流速和6000 s^(-1)剪切率。预期浓缩系数为10倍。这并非关键参数，对于纯化而言可接受任何更高或更低的浓缩系数。

将浓缩的混悬液经过超声处理并将所得裂解物直接使用或用20 mM Tris, pH 8.0稀释5-10倍，用于上样至?kta Explorer System (GE Healthcare)，其装备有显示缀合的肝素分子的实验性亲和膜吸附器(Sartorius，孔径>3 μm，吸附面积250 cm²，床高4 mm，床体积7 mL)。上样之前，将膜吸附器用250 ml洗脱缓冲液(20 mM Tris, pH 8.0, 2 M氯化钠)预洗并随后用250 ml吸附缓冲液(20 mM Tris, pH 8.0)平衡。上样之后，用等同于10倍膜床体积的70 ml运行缓冲液洗涤膜吸附器以去除未结合的物质。在亲和膜上的纯化用作纯化病毒颗粒的方便实例，所述病毒颗粒在设计用于疫苗生产的传代细胞系上生产。离子交换程序(阳离子和阴离子交换二者)和诸如整料等大孔材料为本发明人已成功试验的其它方法。

吸附的病毒颗粒通过不连续梯度来洗脱，其使用含有2 M氯化钠的20 mM Tris缓冲液(pH 8.0)作为洗脱液。为了实现完全洗脱，使用10倍床体积的洗脱液以10 mL/min的流速冲洗膜吸附器。收集的洗脱体积约为50 mL。通过在每次运行后用10倍床体积的1 M氢氧化钠再生来反复使用膜吸附器。

整个过程通过280 nm和260 nm处的紫外吸收、通过针对病毒抗原的斑点印迹以及通过依照制造商说明书使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit (Invitrogen, USA)嵌入染料的dsDNA浓度测定来监测。

使用如前所述由Reed和Münch修改的免疫聚焦测定法(Jordan等2009年于Vaccine 27, 748-756)，在Vero细胞(非洲绿猴肾细胞；ATCC CCL-81)中进行MVA的滴定。

图1显示来自此实施例的结果，图2证实所述细胞悬液可用于进一步的下游加工。然而，图2 (C)亦证实对于有效的下游加工而言必须改进用于自受感染培养物中制备裂解物的方案。尽管可对裂解物进行亲和色谱，但是洗脱流分中仍存在宿主细胞DNA和感染单位的未充分分离。在此实施例中，在色谱之前将TFF制品稀释10倍。假设在待施用的1 ml疫苗中含有10⁸个感染单位以及10 ng DNA的剂量，那么本发明人在上样流分中以1个疫苗剂量起始，并洗脱2个疫苗剂量。在同样稀释的裂解物中，本发明人在上样流分中以1000倍过量的DNA起始，并自柱上洗脱500倍过量的DNA。因此，本发明人以2倍清除DNA并以同一系数增加病毒浓度，获得纯化系数为4以及以两个数量级获得以下目标。对于总蛋白含量，本发明人测得施加的上样中为430 μg/ml，洗脱流分中为113 μg/ml；对流分体积上的偏差进行校正，蛋白质的产率为13%并由此清除87%。

实施例2：病毒:DNA复合体的破坏

为了增进自疫苗制品中清除DNA，以及去除干扰后续下游步骤的颗粒材料，将硅藻土用作非惰性过滤基质。主要为无定形二氧化硅粉末的硅藻土的优势为价格低廉和连贯供应。这可以是将疫苗生产过程传递到发展中国家或新兴工业化国家的决定性因素，在所述国家中新型且有效的载体疫苗为迫切需要的(Francis 2010年于Biologicals 38, 523-528)。

然而，亦报道硅藻土结合并隔离病毒以用于水净化目的(Farrah等1991年于Appl Environ Microbiol 57, 2502-2506)。此外，DNA的结合需要诸如4 M硫氰酸胍等离液盐的存在，所述离液盐会杀死任何病毒载体(Carter和Milton 1993年于Nucleic Acids Res 21, 1044)。因此，必须确定产生温和离液序列高的环境并诱导DNA或活病毒载体的选择性结合或排斥的物理参数(例如pH、温度和孵育时间)和化学参数(从单个小分子到任何大分子集合)。此环境的诱导必须可转换成可缩放的过程，以及亦必须与在兽医学或人类医学中的预期应用相容。

硅藻土的使用可作为非限制性实例以证实其中已阻止或破坏病毒和宿主细胞DNA之间的复合体形成的过程，以及证实将允许在进一步的下游加工中自感染单位中分离DNA的纯化方案。本领域任一个技术人员已知，可进一步修饰(例如用硅烷包被)或处理(例如用强酸浸蚀)二氧化硅以将纯化方案调整为本文所公开的机制。硅藻土为非动物来源的，并且可以适于制药应用的纯化等级获得。即使在高压下，二氧化硅颗粒和粉末依然坚硬，因此可将我们的程序缩放为非常大的生产体积和高流速。用于以下实施例的硅藻土为来自Advanced Minerals, USA的Acid Washed Celite 545 NF。

如实施例1所述，在化学上确定的培养基中用MVA感染AGE1.CR禽类细胞达0.1 MOI。感染后48小时，将NaBr和KCl分别加至250 mM和150 mM，并且超声处理培养物以破坏受感染细胞。在参比实验中，在不添加离液剂的情况下超声处理培养物，但在裂解之后加入NaBr和KCl。

提前将硅藻土重悬浮于20 mM Tris (pH 7.2)缓冲液中并使其平衡至少6 h。在确定DNA含量之后，向裂解物中加入等同于1 g、2 g或3 g质量的硅藻/mg DNA的体积并在室温下孵育20 min。用于孵育和后续步骤的优选pH为6.8-7.4个单位。之后，将混悬液填充到在出口处分别用5 μm和2 μm孔径的两个玻璃纤维盘式滤器(ULTA Disc GF，来自GE Health Care)密封的柱中。滤液通过负压吸出。使用4倍基质体积的含NaBr和KCl的Tris缓冲液进行洗涤，并用含2 M NaCl的Tris缓冲液洗脱。在具有大约15 ml裂解物的小规模实验中，基质体积为2.5 mL。

图3显示来自此实验的数据。对于MVA疫苗制品，感染单位与ng DNA的比率应为至少10⁷ (在10 ng DNA中10⁸个感染单位)。在未处理的裂解物中，对于两个样品而言所述比率为1.7 x 10⁴。在NaBr和KCl存在下的二氧化硅过滤相对于DNA改善病毒的回收。这是出人意料的观察结果，因为预计处于所述浓度的离液剂应使病毒失活。

在离液剂存在下超声处理的样品中，相对DNA清除的效率进一步改善，并且清除程度与用于孵育的二氧化硅的量相关。在测试的二氧化硅的最大质量下以及在离液剂存在下使用超声处理，获得pfu/DNA比率为4.3 x 10⁴。在粗裂解物中所述比率偏离目标值780倍，而在处理的裂解物中该比率仅偏离目标值230倍。因此本发明人已提出了载体疫苗制备中非常有效的起始步骤，并证实防止污染物和病毒体之间的复合体形成的重要性。

实施例3：硅藻纯化

然后，本发明人使用化学添加物优化硅藻纯化步骤并确证对于离液剂的需要。在病毒生产的峰值但在细胞病变性细胞裂解或诱导的细胞裂解之前，向培养物中加入250 mM NaBr和150 mM KCl并且如上所述通过超声处理进行细胞破碎。测试的其它化合物为聚磷酸(作为离液剂)、聚乙烯吡咯烷酮、吐温-20和硫酸葡聚糖(作为带电或极性聚合物)。一旦确定了我们方法的原理以及使用上文的化学品列表，本领域技术人员可推断的是，可使用诸如NaI等其它盐或者诸如壳聚糖等其它带电或极性聚合物以及诸如辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40或IGEPAL)等去污剂。虽然掩蔽化合物可能干扰感染周期，但是如本文所述在生产过程中的添加时间安排甚至允许使用与病毒结合的物质。

图4和5提供此实施例的实验室数据：如上所述，在化学上确定的过程中用野生型MVA感染CR细胞的培养物达 0.1 MOI。感染后48 h，将受感染培养物分成用不同添加物或添加物的组合补充的等分试样。使一份等分试样未处理(用PBS稀释)作为参比。补充之后，将等分试样超声处理并随后通过硅藻土以10 g硅藻/mg DNA过滤，所述DNA如在粗裂解物中所测定。在不同的滤液、洗涤流分和洗脱流分中确定感染单位和DNA含量。

在此实验中所选的变化为(1)未使用添加物的超声处理和纯化；(2) 0.5 mM聚磷酸、NaBr和KCl；(3) 0.025%吐温20、NaBr和KCl；(4) 2% PVP、NaBr和KCl；(5) NaBr和KCl；(6) 20 mg/L硫酸葡聚糖、NaBr和KCl；和(7)吐温、PVP、NaBr和KCl的组合。加盐时，浓度为250 mM NaBr和150 mM KCl。在图4和5中，流分缩写为F、W和E，而变化通过附标(index)来给出，使得例如F6为在硫酸葡聚糖和离液剂存在下超声处理的等分试样的滤液，而E6为相同等分试样的洗脱液。

在图4中，结果以1 ml体积时疫苗剂量的倍数描述，其中一个剂量应含有至少10⁸个感染单位但少于10 ng DNA。在此标准化的情况下，粗裂解物含有45倍过量的MVA和2600倍过量的DNA。如果将不含任何添加物的粗裂解物过滤(柱F1)，则MVA水平降至2个疫苗剂量，而DNA水平降至可容许疫苗水平的300倍。在W1中，病毒水平为0.3倍，而DNA水平为71倍。然而，在E1中，病毒仍处于非常低的6倍，而DNA处于很高的2000倍。pfu回收不能接近平衡(对全部流分总计的产率仅为18%)，表明通过与硅酸盐的强相互作用使病毒破坏或使感染单位损失。对于DNA，平衡为82%，强结合需要用2 M NaCl消除。图5右下角的图表描述了所有实验中感染单位的总回收率，并且明确证实本发明人在我们所述变化中成功地改进了病毒与二氧化硅的可逆结合。

例如，用于F5的柱证实离液剂的添加利于病毒通过，由此在480倍过量的DNA存在下回收了25个疫苗剂量的MVA。就相对产率而言，在F5中回收52%的感染单位但仅回收17%的DNA，在洗涤流分中损失25%的感染单位，以及可在洗脱流分中回收60%的DNA。这些结果表明离液剂和硅酸盐过滤的组合改善含有载体疫苗病毒的来源于细胞培养物的裂解物。这是出人意料的观察结果，因为本发明人预期离液剂增加与硅藻土的结合，这与在DNA与二氧化硅的相互作用中诱导的行为类似。

本发明人已在F5中将pfu:ng DNA的比率(如在前述实施例中所论述的)从1.7 x 10⁵增加到5.3 x 10⁵；与目标值10⁷的差距从60倍缩小到小于20倍。

基于F5，测试了其它添加物以改善DNA结合或病毒通行。F4和F7中所示结果为另一个惊喜：PVP的存在将硅藻与DNA的相互作用阻止到以下程度，其使得在滤液中回收了80%-95%的DNA。尽管实施例3的情况为不合乎需要的，但是此发现指出PVP在使用亲和基质的进一步下游纯化中的应用：其中，允许病毒吸附到基质上以及通过PVP的存在抑制DNA的结合。洗涤步骤之后，将病毒洗脱并减少可用于共洗脱的DNA的量。

本发明人还意外地发现一种物质，所述物质选择性地允许DNA吸附到硅藻上，但允许感染单位进入滤液。如F6所示，硫酸葡聚糖连同NaBr和KCl的添加导致滤液中>80%的感染单位产率，但是仅34%的DNA产率。相反，在洗脱液E6中，回收了71%的DNA和2%的pfu。

令人关注的是，洗涤流分W6仍含有各自约10%的病毒和DNA。这表示硅藻对DNA的能力已耗尽，表明使用相同或类似条件的额外过滤步骤F6将进一步降低制品中不需要的DNA含量。或者，可增加用于第一个过滤步骤中的硅藻的量。

实施例4：序贯过滤

接着，本发明人检验本文所述方法能否序贯地应用于进一步增进DNA清除。基于前述实施例，以10 g硅藻/mg 在粗裂解物中确定的DNA使其中的样品F5进行所述过滤 (对于F5的上样)。在图6(A)中，粗裂解物用R表示。在此样品中，DNA的量为超过可容许的1 ml疫苗剂量的2584倍。过滤之后，如图5中F5的报告，超出量减少到541倍。在第二次这样的过滤之后，如图6(A)中的FF5所示，超出量进一步减少到106倍。图6(A)中显示的其它样品对于第二次过滤的上样为LF5 (与F5相同)，对于第二次过滤的洗涤为WW5，对于第二次过滤的洗脱为EE5。

总的说来，本发明人证实在DNA含量上24倍(2584/106)的组合减少，这令人印象深刻，因为疫苗纯化中的这个起始步骤在不存在酶消化的情况下进行。

实施例5：浊度

如上所概括，对于活疫苗而言，在纯化中维持感染性为最复杂的挑战。自脆弱的病毒颗粒中分离诸如宿主细胞DNA或蛋白质等污染物需要进一步的下游加工，通常包括切向流过滤、亲和色谱或膜吸附。这类方法的分辨率、效率和产率随着含病毒混悬液的澄清度而改善。原因在于溶液中的浑浊度或浊度表明不合乎需要的颗粒的存在，所述颗粒可堵塞孔并与病毒竞争与固定相的结合位点。

为了证实硅藻过滤步骤用于进一步下游加工的出人意料的适合性，本发明人还使用Turbiquant 1100 IR (Merck Chemicals Germany)对依照实施例3制备的滤液的浊度进行定量。此装置通过相对于制造商提供的校准标准品的光散射，以比浊法浊度单位(NTU)测定悬浮粒子的存在情况。

在图6(B)中，在浊度和病毒含量上比较滤液和离心分离的上清液。NTU浊度以亮条显示，pfu倍数/1 mL疫苗剂量以暗条显示。R表示在存在250 mM NaBr和150 mM KCl但无进一步纯化处理的情况下通过超声处理获得的裂解物。SN2和SN5分别表示以200 x g和500 x g离心分离的上清液，而F8表示硅藻滤液。

如预期的，即使以200 x g温和的离心分离，亦将大部分感染单位移入沉淀中，并且即使使用500 x g的更强劲的离心分离，亦不会提供明显更不浑浊的上清液。然而，本文所述过滤使浊度降至13%，同时仍保持用以继续进一步下游加工的足量的感染性。

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PCT/RO/134表