用于检测ZNF804A基因中的rs1344706位点的核苷酸的物质的新用途

摘要

本发明公开了用于检测ZNF804A基因中的rs1344706位点的核苷酸的物质的新用途，具体来说为用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质在制备用于评估海洛因成瘾风险性和/或海洛因成瘾后的冲动决策行为损害度的试剂盒中的新用途。本发明有助于预防海洛因成瘾疾病，有助于对海洛因成瘾者进行有效的干预，有助于开发新的针对海洛因成瘾者的药物，具有重大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测ZNF804A基因中的rs1344706位点的核苷酸的物质的新用途， 具体来说为用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质在制备用于评估海洛因成瘾风险 性和/或海洛因成瘾后的冲动决策行为损害程度的试剂盒中的新用途。

背景技术

物质成瘾也称物质依赖，是指长期滥用某种物质后，心理上与躯体上产生的一种 强烈而不能克制的寻觅该种物质的状态，以期体验重复使用该物质所产生的欣快感， 同时避免戒断所引起的躯体不适。物质成瘾性疾病是一种以反复发作的以强迫性觅药 和摄药行为主要特征的慢性复发性脑病。物质成瘾者行为学异常主要表现为学习记忆 能力下降、冲动性行为控制受损和认知能力下降等形式。这些行为改变是物质成瘾者 接触成瘾性物质和发生复吸的直接原因。冲动性表现为缺乏前瞻性考虑、不计后果地 进行一些不恰当或冒险的行为，研究表明，冲动性的高低与药物成瘾有明显的相关性。 研究中发现，物质成瘾者表现出更高的冲动性。冲动性高低与成瘾物质的使用量、渴 求程度以及戒断症状严重性呈正相关。高冲动性被认为是导致复吸的一个关键因素。 研究表明，高冲动性预示着可卡因成瘾者戒断后复吸几率更高。对物质成瘾者的冲动 性研究有多种角度，比如冲动性选择（impulsive choice）、行为去抑制（response  inhibition）和思维冲动（reflection impulsivity）等。对冲动性的评估有多种方 法，其中冲动决策指的是在各种选择中进行决断，以期达到最优化的能力。爱荷华赌 博试验（Iowa Gambling Task,IGT）是一种对冲动决策能力进行定量评估的方法。在 试验中，受试在不确定结果的条件下需要权衡奖赏和惩罚的大小，并作出最优选择。 对阿片类、酒精、可卡因、大麻类等物质成瘾性疾病的研究表明，物质成瘾者的冲动 决策行为受损（冲动决策能力降低），并且冲动决策行为损害程度与药物成瘾复吸行为 密切相关。

物质成瘾性疾病是多种遗传因素与环境因素共同作用而导致的一种复杂的脑疾 病。遗传因素与物质成瘾性疾病的易感性密切相关。与物质成瘾性疾病相关的许多重 要基因的遗传多态性改变能够影响个体对物质成瘾的易感性、耐受性和机体功能。 Tsuang等人对物质成瘾者的双生子的研究中发现，遗传因素是造成个体对成瘾性物质 易感性不同的主要原因。已有研究证明，海洛因成瘾者的行为学异常是可受遗传因素 的调节，而遗传因素对行为学异常的影响，往往会影响成瘾者的复吸率。

阿片类物质成瘾，特别是海洛因成瘾是我国最早开始流行，也是流行最严重的成 瘾类型。根据2013年的中国禁毒报告，中国阿片类成瘾者目前已达到127万，占全国 所有药物成瘾总人数的60.6%，是我国成瘾人群的大多数。找到预示海洛因成瘾疾病 易感性及成瘾后行为学损害程度的生物学靶标，对预防海洛因成瘾疾病的发生和提高 复吸治疗成功率，意义重大。

ZNF804A蛋白即锌指蛋白804A（zinc finger protein804A）。ZNF804A基因位 于染色体2q32.1，大小为341kb。目前，ZNF804A基因的确切功能尚不清楚。ZNF804A 基因在人脑内广泛表达，尤其在未发育完全的海马和皮质，在成年的小脑内也有大量 表达。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测ZNF804A基因中的rs1344706位点的核苷酸的物质 的新用途，具体来说为用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质在制备用于评估海洛 因成瘾风险性和/或海洛因成瘾后的冲动决策行为损害程度的试剂盒中的新用途。

本发明要求保护用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质在制备用于评估海洛因 成瘾风险性的试剂盒中的应用。基于rs1344706位点，T等位基因为海洛因成瘾风险 基因，携带T等位基因的受试者海洛因成瘾风险性高，不携带T等位基因的受试者海 洛因成瘾风险性低。

本发明还要求保护用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质在制备用于评估海洛 因成瘾后的冲动决策行为损害程度的试剂盒中的应用。基于rs1344706位点，T等位 基因为冲动决策行为损害风险基因（携带T等位基因越多，冲动决策行为的损害程度 越高），携带T等位基因的受试者冲动决策行为的损害程度高，不携带T等位基因的受 试者冲动决策行为的损害程度低。

本发明还要求保护一种用于评估海洛因成瘾风险性的试剂盒，包括用于检测 rs1344706位点的核苷酸的物质。基于rs1344706位点，T等位基因为海洛因成瘾风险 基因，携带T等位基因的受试者海洛因成瘾风险性高，不携带T等位基因的受试者海 洛因成瘾风险性低。

本发明还要求保护一种用于评估海洛因成瘾后的冲动决策行为损害程度的试剂 盒，包括用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质。基于rs1344706位点，T等位基 因为冲动决策行为损害风险基因（携带T等位基因越多，冲动决策行为的损害程度越 高），携带T等位基因的受试者冲动决策行为的损害程度高，不携带T等位基因的受试 者冲动决策行为的损害程度低。

以上任一所述“用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质”具体可为序列表的序 列1所示的单链DNA分子与序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的特异引物对。

以上任一所述rs1344706位点位于ZNF804A基因中，具体来说为序列表的序列3 所示的双链DNA分子自5’末端第465位核苷酸。

本发明还保护一种特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子与序列表 的序列2所示的单链DNA分子组成。

ZNF804A基因如序列表的序列3所示。rs1344706位点为位于ZNF804A基因靠近 3’端的第二个内含子区域的SNP位点，此区域在哺乳动物中高度保守。

本发明有助于预防海洛因成瘾疾病，有助于对海洛因成瘾者进行有效的干预，有 助于开发新的针对海洛因成瘾者的药物，具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中各组基因型受试者的IGT得分结果。

图2为实施例2的步骤一的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为实施例2的步骤二的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

海洛因成瘾者全部来源于广东省中山市公安局强制隔离戒毒所。入选标准：（1） 汉族，年龄30-45岁，广东省中山市籍男性，且父母均为中山本地人（并排除客家人）； （2）符合美国精神疾病诊断与统计手册第四版（DSM-Ⅳ）阿片类物质成瘾诊断标准， 吸食海洛因的时间在10年以上，静脉注射给药，除海洛因外没有滥用其它成瘾性物质 （如大麻、甲基苯丙胺类物质、氯胺酮等），戒断时间介于1-12个月之间；（3）受教 育年限介于9-12年之间（相当于初中毕业到高中毕业之间）；（4）无严重精神障碍和 躯体疾病。排除标准：（1）日吸烟量大于40支者，中度或重度酒精成瘾者，甲基苯丙 胺、氯胺酮等多药滥用者；（2）慢性疾病或当前正在服用其他药物者；（3）过度激越 不能配合完成试验者；（4）有过严重的神经和精神疾病史或家族史者；（5）不愿参与 试验者。

正常受试者通过广告、电话等方法在广东省中山市本地招募。入选标准：（1）汉 族，年龄30-45岁，广东省中山市籍男性，且父母均为中山本地人（并排除客家人）； （2）无毒品使用史；（3）受教育年限介于9-12年之间（相当于初中毕业到高中毕业 之间）；（4）无严重精神和躯体疾病。排除标准：（1）日吸烟量大于40支者，中度或 重度酒精成瘾者；（2）慢性疾病或当前正在服用其他药物者；（3）过度激越不能配合 完成试验者；（4）有过严重的神经和精神疾病史或家族史者；（5）不愿参与试验者。

rs1344706-upper-1：5’-ACGTTGGATGTCAAAGCCTTATCTCTTCAC-3’；

rs1344706-lower-1：5’-ACGTTGGATGCCAGATAGATATCCAAGAAG-3’。

rs1344706-upper-2(序列表的序列1)：5’-AGTGACCTTGGTGGAAATGG-3’；

rs1344706-lower-2（序列表的序列2）：5’-GATTCAGTGATCATTCAGTTCCTG-3’。

实施例1、检测受试者基于rs1344706位点的基因型、获得受试者群体的基因型 分布和受试者群体的等位基因分布

一、检测各个受试者的基于rs1344706位点的基因型，方法如下：

1、提取受试者的外周静脉血的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用rs1344706-upper-2和 rs1344706-lower-2组成的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、将步骤2的PCR扩增产物进行测序，从而获知受试者基于rs1344706位点的基 因型。测序结果表明，PCR扩增产物均为ZNF804A基因中的靶序列，不存在其它非特 异性扩增，即对于所述特异引物对来说，人基因组中不存在其它可以扩增的靶点，特 异性良好。

海洛因成瘾者群体、正常受试者群体的基因型分布和等位基因分布结果见表1。

表1海洛因成瘾者群体、正常受试者群体的基因型分布和等位基因分布结果

注：括号外为该基因型或携带该等位基因的人数，括号内为该基因型或携带该等位基 因的人数占该群体总人数的比例。

基因型频率分析结果显示，两个群体中的基因型分布菌满足Hardy-Weinberg平衡 （正常对照组：χ2=2.45,df=1,p=0.12；海洛因成瘾组：χ2=0.01,df=1, p=0.94)。基因型（GG/GT/TT）分布频率在两组间有显著差异（χ2=6.51,df=2, p=0.04），等位基因(G/T)分布频率在两组间也有显著差异（χ2=5.79,df=1,p =0.02），置换矫正后的p值为0.023。T等位基因的风险度OR值为1.57,95%置信区 间CI为1.09-2.28（Table1）。证明rs1344706位点为海洛因的疾病风险关联基因 位点（T等位基因为高风险），检测此位点的多态性，可以为预示海洛因成瘾疾病易感 性提供靶标。

二、爱德华赌博试验（Iowa Gambling Task,IGT）

采用IGT经典纸牌方法，共有四组牌(A、B、C、D)，每组牌有40张，按一定规律 叠放。其中A组和B组是代表高风险的牌，得分高，失分更高，选择这两组牌越多， 最后总分越低；C组和D组是低风险性的牌，得分低，失分也更少，选择这两组牌越 多，最后总分越高。受试在事先不知道每一张牌的得分的情况下，以使自己所得总分 最大化为原则，按照指导语每次从四组牌中任意选择1张，共选够100张停止。最后 以选择低风险的C和D组牌总数减去高风险的A和B组牌的总数（（C+D）-（A+B））的 结果代表受试者的冲动决策能力，分值越低，代表受试冲动性越高。

与正常受试者相比，海洛因成瘾者的冲动决策能力显著降低。根据步骤一获知的 基因型，海洛因成瘾者群体和正常受试者群体各分成三组。各组基因型受试者的IGT 得分结果见图1。在海洛因成瘾者群体中IGT的得分随着等位基因T的增多而递减， 而正常受试者群体中没有这种相关性。结果表明，携带T等位基因能影响海洛因成瘾 者的冲动决策行为受损程度，换句话说，携带T等位基因越多的海洛因成瘾者冲动决 策行为受损更加严重。

实施例2、引物对的灵敏度检测

从海洛因成瘾者群体中随机取5位、从正常受试者群体中随机取5位。

一、检测不同含量的引物扩增固定含量的模板DNA的灵敏度

1、提取受试者的外周静脉血的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用rs1344706-upper-1和 rs1344706-lower-1组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，结果见图2A。

PCR体系（10μl）：10×PCR Buffer（含20mM MgCl₂）1μl、MgCl₂水溶液（25mM） 0.8μl、dNTP mix（25mM each）0.2μl、引物混合物1.0μl（含有等摩尔混合的 rs1344706-upper-1和rs1344706-lower-1）、Hotstar Tag（5U/μl）0.2μl、模板DNA 1μl，用H₂O补足10μl。PCR体系中，rs1344706-upper-1的含量分别为2pmoL、1pmoL、 0.5pmoL、0.4pmoL、0.3pmoL、0.2pmoL、0.1pmoL、0.05pmoL或0.01pmoL。PCR体系 中，模板含量为150ng。

PCR程序：95℃2min；94℃30s、50℃1min30s、72℃1min，40个循环；72℃ 10min。

3、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用rs1344706-upper-2和 rs1344706-lower-2组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，结果见图2B。

PCR体系（10μl）：10×PCR Buffer（含20mM MgCl₂）1μl、MgCl₂水溶液（25mM） 0.8μl、dNTP mix（25mM each）0.2μl、引物混合物1.0μl（含有等摩尔混合的 rs1344706-upper-2和rs1344706-lower-2）、Hotstar Tag（5U/μl）0.2μl，、模板DNA 1μl，用H₂O补足10μl。PCR体系中，rs1344706-upper-2的含量分别为2pmoL、1pmoL、 0.5pmoL、0.4pmoL、0.3pmoL、0.2pmoL、0.1pmoL、0.05pmoL或0.01pmoL。PCR体系 中，模板含量为150ng。

PCR程序：95℃2min；94℃30s、50℃1min30s、72℃1min，40个循环；72℃ 10min。

4、对比图2A和图2B，rs1344706-upper-2和rs1344706-lower-2组成的引物对 的扩增效果优于rs1344706-upper-1和rs1344706-lower-1组成的引物对，且灵敏度 更高。

二、检测固定含量的引物扩增不同含量的模板DNA的灵敏度

1、提取受试者的外周静脉血的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用rs1344706-upper-1和 rs1344706-lower-1组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，结果见图3A。灵敏度为3ng。

PCR体系（10μl）：10×PCR Buffer（含20mM MgCl₂）1μl、MgCl₂水溶液（25mM） 0.8μl、dNTP mix（25mM each）0.2μl、引物混合物1.0μl（含有等摩尔混合的 rs1344706-upper-1和rs1344706-lower-1）、Hotstar Tag（5U/μl）0.2μl、模板DNA 1μl，用H₂O补足10μl。PCR体系中，rs1344706-upper-1的含量为500nmoL。PCR体系 中，模板含量分别为150ng、30ng、15ng、3ng、1.5ng或0.15ng。

PCR程序：95℃2min；94℃30s、50℃1min30s、72℃1min，40个循环；72℃ 10min。

3、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用rs1344706-upper-2和 rs1344706-lower-2组成的引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，结果见图3B。灵敏度为1.5ng。

PCR体系（10μl）：10×PCR Buffer（含20mM MgCl₂）1μl、MgCl₂水溶液（25mM） 0.8μl、dNTP mix（25mM each）0.2μl、引物混合物1.0μl（含有等摩尔混合的 rs1344706-upper-2和rs1344706-lower-2）、Hotstar Tag（5U/μl）0.2μl、模板DNA 1μl，用H₂O补足10μl。PCR体系中，rs1344706-upper-2的含量为500nmoL。PCR体系 中，模板含量分别为150ng、30ng、15ng、3ng、1.5ng或0.15ng。

PCR程序：95℃2min；94℃30s、50℃1min30s、72℃1min，40个循环；72℃ 10min。

4、对比图3A和图3B，rs1344706-upper-2和rs1344706-lower-2组成的引物对 的扩增效果优于rs1344706-upper-1和rs1344706-lower-1组成的引物对，且灵敏度 更高。