一种利用液相法测定多糖铁复合物溶出度的方法

摘要

本发明公开了一种利用液相法测定多糖铁溶出度的方法：取待检测样品，用水稀释，溶解时间t，过滤，向滤液中加入稀硫酸，加热至颜色变浅，取出，降温至室温，然后加入等反应量或过量的乙二胺四乙酸二钠溶液，反应完成后，用液相法测定，记录色谱图，根据峰面积计算待检测样品中多糖铁的浓度或/和含量，进而得到待检测样品在时间t的溶出度。本发明的利用液相法测定多糖铁溶出度的方法，通过实际应用，该方法分离效果好，测定准确，灵敏高，专属性强、分析简便快速，可用于多糖铁溶出溶液的定量，判定实际溶出情况，从而对单批次药物、不同批次药物的吸收及药效的发挥做出评价。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用液相法测定多糖铁复合物溶出度的方法。

背景技术

多糖铁复合物是一种低分子多糖和铁的有机复合物，是用于治疗单纯性缺铁性贫血的药物。目前，对判断化学药物疗效一致的方法除了生物等效性实验外，溶出一致性是最科学合理有效的评价手段。目前，尚未有关于测定多糖铁复合物溶出度的方法，原研药物国内注册标准无溶出质量标准。因此，研发一种测定多糖铁复合物溶出度的方法，并制定相关质量标准，是非常必要的。铁的定量以滴定、原子吸收等最为常见，但滴定方法要求待测溶液浓度非常高，不可能用于溶出度的测定；而原子吸收仪器昂贵，目前使用率较低。

发明内容

本发明目的在于弥补技术空白，提供了一种利用液相法测定多糖铁复合物溶出度的方法，该方法分离效果好，测定准确，灵敏度高，专属性强、分析简便快速，可用于多糖铁复合物溶出溶液的定量，判定实际溶出情况，从而对单批次药物、不同批次药物的吸收及药效的发挥做出评价。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用液相法测定多糖铁复合物溶出度的方法，如下：取待检测样品，用水稀释，溶解时间t，过滤，向滤液中加入稀硫酸，置70～100℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，然后加入等反应量或过量的乙二胺四乙酸二钠溶液，反应完成后，用液相法测定，记录色谱图，根据峰面积计算待检测样品中多糖铁复合物的浓度或/和含量，进而得到待检测样品在时间t的溶出度。

所述“用液相法测定，记录色谱图，根据峰面积计算待检测样品中多糖铁复合物的浓度或/和含量，进而得到待检测样品在时间t的溶出度”的具体方式为以下两种方式之一：

（1）以乙二胺四乙酸铁钠作为对照品，进行梯度稀释，然后做同待检测样品同样的处理，用液相法测定，记录色谱图，制作乙二胺四乙酸铁钠浓度-峰面积的标准曲线，并计算得到线性回归方程，然后将待检测样品的峰面积查标准曲线，从而得到待检测样品中铁的浓度或/和含量，或将待检测样品的峰面积套入线性回归方程，通过常规方法计算得到待检测样品中铁的浓度或/和含量，进而得到待检测样品在时间t时的溶出度。

（2）以乙二胺四乙酸铁钠作为对照品，对对照品做同待检测样品同样的处理，用液相法测定，记录色谱图，测定峰面积，通过常规方法计算得到待检测样品中铁的浓度或/和含量，进而得到待检测样品在时间t时的溶出度。

进一步地，本发明是通过以下技术方案实现的：

取待检测样品，以水500～1000ml为溶剂，转速为每分钟50～100转，30～60分钟后，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入10%稀硫酸（质量百分数）0.1ml，置70～100℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液（质量百分数）0.3～1ml，摇匀，放置3～15min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取相当于铁的质量为15mg的乙二胺四乙酸铁钠，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。

本发明的优选技术方案的为：

取待检测样品，以水900ml为溶剂，转速为每分钟100转，45分钟后，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入10%稀硫酸0.1ml，置90℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.5ml，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取相当于铁的质量为15mg的乙二胺四乙酸铁钠，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。

本发明的优选技术方案还可以为：

取待检测样品，以水1000ml为溶剂，转速为每分钟100转，30分钟后，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入10%稀硫酸0.1ml，置100℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液1ml，摇匀，放置5min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取相当于铁的质量为15mg的乙二胺四乙酸铁钠，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。

本发明的优选技术方案还可以为：

取待检测样品，以水500ml为溶剂，转速为每分钟75转，60分钟后，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入10%稀硫酸0.1ml，置100℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.5ml，摇匀，放置5min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取相当于铁的质量为15mg的乙二胺四乙酸铁钠，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。

以上技术方案中，所述液相法测定的色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.15%四丁基氢氧化铵溶液（质量百分数）-甲醇为流动相，二者体积比为70～90：30～10；检测波长为256nm。

优选的，所述液相法测定的色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.15%四丁基氢氧化铵溶液-甲醇为流动相，二者体积比为87：13；检测波长为256nm。

其中，所述0.15%四丁基氢氧化铵溶液的pH值为3～4（用甲酸调）。

优选为：所述的0.15%四丁基氢氧化铵溶液的pH值为3.6（用甲酸调）。

本发明所检测的目标样品——多糖铁复合物是一种低分子多糖和铁的有机复合物，目前，国内有生产企业生产制剂和原料药，也有从国外进口的制剂。本发明的检测方法适用于所有的多糖铁复合物原料药和制剂。

本发明的利用液相法测定多糖铁复合物溶出度的方法，通过实际应用，该方法分离效果好，测定准确，灵敏高，专属性强、分析简便快速，可用于多糖铁复合物溶出溶液的定量，判定实际溶出情况，从而对单批次药物、不同批次药物的吸收及药效的发挥做出评价，具有以下特点：

1.本发明创立了多糖铁复合物的溶出度方法，填补了技术空白。

2.该方法能客观反映多糖铁复合物的溶出行为，可以简便、快速、准确地测定多糖铁复合物的溶出度及溶出曲线，从而更加科学合理的控制产品质量，保障科学用药。

3.本发明的检测方法专属性强，线性关系好，准确度，精密度，范围等均符合要求。

4.本发明采用液相方法，简便、快速、准确。

附图说明

图1：对照品溶液峰面积与浓度线性关系图。

图2：多糖铁复合物胶囊溶出曲线图。

具体实施方式

下面结合实验例及实施例对本发明作进一步的说明。

实验例1测定波长的选择

1.仪器与试剂

（1）仪器：PHARMTEST610半自动溶出仪，ANGILENT1260液相色谱仪，SHIMADZUUV-2550紫外-可见分光光度计，METTLERTOLEDOXS205电子天平。

（2）试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

按质量标准制备供试品溶液、对照品溶液和空白对照溶液（空白对照溶液为精密量取水1ml按供试品溶液制备方法制备）。取上述三种溶液照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版二部附录ⅣA），分别在200～400nm波长处进行吸收曲线测定，结果见表1。供试品溶液、对照品溶液在256nm波长处有最大吸收，而空白对照溶液在256nm处没有吸收。故选择256nm作为测定波长。

表1紫外吸收测定数据

实验例2线性关系考察与标准曲线的制备

精密称取乙二胺四乙酸铁钠对照品（相当于10mg铁），置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。分别量取该对照品贮备液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8ml，置100ml量瓶，分别加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取上述各溶液，照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录ⅤD），在256nm波长处分别测定峰面积。以对照品浓度（μg/ml）为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并对测得的数据进行回归分析，回归方程为y=76.184x+98.213，相关系数R2=0.9999，结果表明，浓度在2.9694～17.8164μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，结果见表2，线性关系图见图1。

表2线性关系考察试验数据

实验例3精密度试验

取多糖铁复合物（批号为130604），照溶出度测定法（《中国药典》2010年版二部附录ⅩC第一法），以水900ml为溶剂，转数为每分钟100转，依法操作，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取滤液1ml，置10ml量瓶中，加入稀硫酸（10%）（给出具体浓度）0.1ml，置水浴中加热至颜色变浅，取出，放至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.5ml，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。在同一溶出杯中，不同位置连续取样6份。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录ⅤD），在256nm波长处分别测定峰面积。6份样品峰面积测定值的平均值为1359.6，RSD为0.60%。试验数据见表3。

表3精密度试验数据

实验例4稳定性试验

取溶出度实验多糖铁复合物制剂供试品溶液，以45分钟溶出液的峰面积为起点（0时），照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录ⅤD），在256nm波长处于0、1、2、4、6、8小时分别测定峰面积。峰面积测定值的平均值为0.347，RSD为0.48%。试验数据见表4。

表4稳定性试验数据

实验例5重复性试验

取样品颗粒9份精密称定，分别加胶囊壳1粒，照溶出度测定法（中国药典2010版二部附录XC第一法）以水900ml为溶剂，转速为每分钟100转，依法操作，经45分钟时，取溶液，滤过，取滤液1ml，置10ml量瓶中，加入稀硫酸0.1ml，置水浴中加热至颜色变浅，取出，放至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.5ml，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取乙二胺四乙酸铁钠约相当于15mg铁，精密称定，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。计算出每粒的铁含量。9次测定溶出量的平均值为41.38%，RSD为1.09%。结果表明，用液相法测定本品的重复性，RSD%小于2%，其方法稳定，重复性好。试验数据见表5。

表5重复性试验数据

实验例6加样回收试验

采用加样回收法，精密称取已知含量的多糖铁复合物胶囊样品9份（含铁41.38%），分别加入乙二胺四乙酸铁钠对照品，按供试品溶液的制备方法依法制备、测定其含量，计算回收率。平均回收率为99.64%，RSD为1.36%，小于2%，表明其方法稳定，准确性好。结果见表6。

表6回收率试验

实验例7溶出曲线测定

取本品6粒，照溶出度测定法（中国药典2010版二部附录XC第一法）以水900ml为溶剂，转速为每分钟100转，依法操作，经5、15、30、45、60分钟时，取10ml（同时补加同体积同温度的水），用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入稀硫酸0.1ml，置水浴中加热至颜色变浅，取出，放至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.5ml，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取乙二胺四乙酸铁钠约相当于15mg铁，精密称定，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒在不同时间的溶出量。试验数据见表7，溶出曲线图见图2。

表7溶出度均一性试验数据

注：上表中数据的单位为“%”

结果表明，制剂溶出度均一性较好。

实施例8溶出度测定

取6批多糖铁复合物样品进行溶出度测定。照溶出度测定法（中国药典2010版二部附录XC第一法）以水900ml为溶剂，转速为每分钟100转，依法操作，经45分钟时，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入稀硫酸0.1ml，置水浴中加热至颜色变浅，取出，放至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.5ml，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取乙二胺四乙酸铁钠约相当于15mg铁，精密称定，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。限度为标示量的80%，应符合规定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.15%四丁基氢氧化铵溶液（用甲酸调pH值至3.6）-甲醇（87：13）为流动相；检测波长为254nm。理论板数按乙二胺四乙酸铁钠峰计算应不低于3000。

溶出度测定结果如表8。

表8溶出度测定结果

注：上表中数据的单位为“%”。

结果表明，溶出度均符合规定。

实施例1测定多糖铁复合物胶囊的溶出度

样品多糖铁复合物胶囊，由青岛国风药业股份有限公司生产，商品名：红源达，批号：130601。

测定方法如下：

取待检测样品，照溶出度测定法（中国药典2010版二部附录XC第一法）以水700ml为溶剂，转速为每分钟80转，30分钟后，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入10%稀硫酸0.1ml，置80℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.3ml，摇匀，放置8min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取相当于铁的质量为15mg的乙二胺四乙酸铁钠，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。溶出度为97.8%。

所述液相法测定的色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.15%四丁基氢氧化铵溶液-甲醇为流动相，二者体积比为87：13；检测波长为256nm。所述的0.15%四丁基氢氧化铵溶液是用甲酸调PH值至3.6。

实施例2测定多糖铁复合物胶囊的溶出度

样品多糖铁复合物胶囊，由青岛国风药业股份有限公司生产，商品名：红源达，批号：130603。

测定方法如下：

取待检测样品，以水900ml为溶剂，转速为每分钟100转，45分钟后，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入10%稀硫酸0.1ml，置90℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.5ml，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取相当于铁的质量为15mg的乙二胺四乙酸铁钠，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。溶出度为99.3%。

所述液相法测定的色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.15%四丁基氢氧化铵溶液-甲醇为流动相，二者体积比为87：13；检测波长为256nm。所述的0.15%四丁基氢氧化铵溶液是用甲酸调PH值至3.6。

实施例3测定多糖铁复合物胶囊的溶出度

样品多糖铁复合物胶囊，由青岛国风药业股份有限公司生产，商品名：红源达，批号：130602。

测定方法如下：

取多糖铁复合物样品，照溶出度测定法（中国药典2010版二部附录XC第一法），以水1000ml为溶剂，转速为每分钟100转，30分钟后，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入10%稀硫酸0.1ml，置100℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液1ml，摇匀，放置5min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取相当于铁的质量为15mg的乙二胺四乙酸铁钠，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。溶出度为98.6%。

所述液相法测定的色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.15%四丁基氢氧化铵溶液-甲醇为流动相，二者体积比为87：13；检测波长为256nm。所述的0.15%四丁基氢氧化铵溶液是用甲酸调PH值至3.6。

实施例4测定多糖铁复合物胶囊的溶出度

样品多糖铁复合物胶囊，由青岛国风药业股份有限公司生产，商品名：红源达，批号：130603。

测定方法如下：

取多糖铁复合物制剂样品，以水500ml为溶剂，转速为每分钟75转，60分钟后，取溶液，滤过，取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加入10%稀硫酸0.1ml，置100℃水浴中加热至颜色变浅，取出，降温至室温，加入0.4%乙二胺四乙酸二钠溶液0.5ml，摇匀，放置5min，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取相当于铁的质量为15mg的乙二胺四乙酸铁钠，置100ml量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液10μl，同法测定，按外标法以峰面积计算出每粒的溶出量。溶出度为99.5%。

所述液相法测定的色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.15%四丁基氢氧化铵溶液-甲醇为流动相，二者体积比为87：13；检测波长为256nm。所述的0.15%四丁基氢氧化铵溶液是用甲酸调PH值至3.6。