一种化学成分确定的培养基、其应用及大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺

摘要

本发明公开了一种化学成分确定的培养基，以公开的DMEM/F12配方为基础，调整各组成成分浓度，并在此基础上增减某些成分，适用于多种哺乳动物细胞的大规模生产。本发明还公开了上述培养基在大规模培养哺乳动物细胞（CHO细胞、BHK细胞或杂交瘤细胞）中的应用以及大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺。本发明的培养基不含血清和蛋白质，并去除了以往培养基中所使用的动物成分及植物蛋白水解物，所有组分化学成分确定，有利于产物的纯化、生产批次的稳定性，从而保证和提高了产品质量；采用本发明的培养基和生产工艺，可提高细胞密度并提高目的产物产量，整体生产成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种化学成分确定的培养基、其应用及大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺。 

背景技术

随着重组DNA技术的问世，培养基已被广泛用于多种细胞培养，包括动物、植物和细菌。生物制药工业中的目标产物（如抗体）可以通过在液体培养基中培养细胞而大量生产。这些细胞为天然的或者工程化的，利用生物反应器在液体培养基中快速成倍增长，并生产目标产物。这些产物可以直接从培养基中收集，也可以从收获的细胞中提取获得。 

培养基提供细胞培养过程中所需的营养物质，在早期的细胞培养过程中，培养基配方以血液的化学组成和物理化学性质为基础（如渗透压、pH值等），被简称为“生理性的解决方案”。但是，不同类型的细胞在不同的培养环境中对于氧气/二氧化碳分压、营养物、维生素和微量元素的需求有所不同，因此，培养基的配方取决于特定的细胞要求。一般而言，培养基的主要成分包括氨基酸、有机盐、无机盐、维生素、微量金属、糖类、脂质和核酸等，各组分的浓度根据给定细胞的特定要求而相应调整。 

目前在单克隆抗体生产或基因重组蛋白的生产中，动物细胞的培养多数采用特异的低血清或无血清培养基。无血清培养基可通过在标准的基础 培养基（如RPMI1640(Moore et al.(1993)In Vitro Cell Dev.Biol.29A:265-267)；Iscove'smodifiedEagle"sMedium(IMDM);Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM)等）中添加营养物或者用某种功能成分取代血清获得，也可以通过在基础培养基中补充微量金属元素和接近等压水平的盐（如主要的阳离子钾、钠、钙、镁等）来获得（Barnes,D.,and Sato,G.(1980)Cell22:649-655;Cleveland,W.L.,et al(1983)J Immunol Meth56:221-234;Iscove,N.,and Melchers,F.(1978)J Exp Med147:923-933;Kawamoto,T.,et al(1983)Analytical Biochemistry130:445-453;Wolpe,S.D.,"In Vitro Immunization and Growth of Hybridomas in Serum-Free Medium",inJ.P.Mather,ed.,Mammalian Cell Culture,Plenum Press,New York,1984）。此外，完全无蛋白成分的培养基也已被开发出来（Fik et al.(1991)BioPharm.March,pp.26-29）。 

经过几十年的发展，哺乳动物细胞培养基大致经历了从有血清培养基，动物蛋白水解物培养基，植物蛋白水解物培养基到无血清、化学成分确定培养基（Chemically-defined Media）4个阶段。出于对疯牛病毒（TSE）及其他各类动物病毒引起的生物安全性的考虑，培养基要尽量避免使用动物源的成分。典型的无血清或化学成分确定培养基含有50-70种成分，包括氨基酸、维生素、微量元素和生长因子等。向培养基中添加动物或植物的蛋白水解物可以有效地提高细胞生长密度、延长细胞活性，从而提高抗体表达量。常见的动物细胞培养的蛋白水解物来源有大豆、酵母和小麦等，但由于其成分的复杂性和批次间的质量变化,添加蛋白水解物可能会造成培养基批次间不稳定从而影响培养过程和产品质量。化学成分确定培养基则全部由化学结构明确的小分子化合物构成。目前，虽然国际上已经普遍使用化学成分确定培养基进行生物制药，但由于生产成本高，国内还普遍使用血清和蛋白水解物做为提高目标产物产量的手段。 

多种细胞株可用来生产单克隆抗体或基因重组蛋白。通常宿主细胞的选择依赖于产物的特性。例如，高糖化的重组蛋白通常采用真核宿主细胞生产。常用的真核细胞株有中国仓鼠卵巢细胞（CHO），幼鼠肾细胞（BHK），转化的人胚胎肾细胞（HEK-293）和鼠杂交瘤细胞（如NS0和SP2/0）。而细菌细胞如大肠杆菌和芽孢杆菌多用来生产非糖基化的多肽。 

不同类型的细胞通常需要不同的营养元素和生长因子，因此许多个性化的培养基已被开发来满足不同细胞的需要。目前已开发的多种真核细胞培养基已被阐述（Ham and McKeehan Meth.Enz.,58:44(1979))；Bottenstein et al.,Meth.Enz.,58:94(1979)）。同时商业化规模发酵已成功用于制备人重组多肽药物（如抗体）。 

目前，最为广泛使用的细胞系为CHO细胞。CHO细胞来源于中国仓鼠卵巢上皮细胞和纤维细胞。CHO细胞系始于中国仓鼠卵巢CHO-K1（Kao,F.-T.And Puck,T.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA60:1275-1281(1968)）以及杂交瘤细胞等。美国专利第5316938号公开了一种适用于CHO细胞悬浮培养的不含从动物源中分离的蛋白质、脂类和碳水化合物的培养基；美国专利5122469公开了一种适用于CHO细胞悬浮培养的无血清、不含蛋白的培养基；美国专利第4767704号公开了一种适用于杂交瘤细胞培养的无蛋白培养基。 

国际上目前已有大量的商业化的化学成分确定培养基应用于各种哺乳动物细胞培养中，例如GIBCO公司用于CHO细胞培养的CD CHO培养基、CD OptiCHO培养基和CD FortiCHO培养基；SIGMA公司的CD CHO Fusion培养基等等。这些化学成分确定培养基都有各自的优点，比如能较好的支持细胞生长，同时又具有局限性：（1）所有培养基都是一种针对某一特定细胞株或细胞系的特异性培养基，比如CD CHO培养基主要用于CHO K1细胞，CD OptiCHO主要用于DG44细胞；（2）化学成分确定培养基价格 昂贵，生产成本高，不适用于大规模生产。 

而在目前的国内市场上，还没有一种可以支持高密度细胞培养的化学成分确定培养基。国内生物制药业使用的培养基大部分为进口培养基，市场被GIBCO、SIGMA、HYCLONE所垄断。同时由于此种培养基的价格昂贵，每升从700元到1500元不等，所以众多中小型生物制药企业还在使用低血清、无血清和添加蛋白水解物来提高细胞密度和目标产物产量。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种高效低成本、适用于多种哺乳动物细胞大规模培养的化学成分确定的培养基。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种化学成分确定的培养基，包括以下终含量的各组成成分： 

本发明的第二个目的是提供上述化学成分确定的培养基的应用，采用如下技术方案：用于培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为CHO细胞、BHK细胞或杂交瘤细胞。 

进一步地，所述CHO细胞为CHO-K1、CHO-K1SV、CHO-DG44、CHO S、CHO DXB11，所述杂交瘤细胞为NS0细胞或SP2/0细胞。 

进一步地，用于通过大规模培养哺乳动物细胞来生产生物类药物，所述生物类药物包括抗体、融合蛋白、重组蛋白、酶或疫苗。 

本发明的第三个目的是提供一种可高密度大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺，采用如下技术方案：采用上述的化学成分确定的培养基作为生产基础培养基，进行哺乳动物细胞的传代培养、高密度流加培养或连续灌注培养。 

进一步地，在哺乳动物细胞培养过程中不添加谷氨酰胺。 

进一步地，在所述高密度流加培养或连续灌注培养过程中，通过添加高浓度流加补料培养基使整个培养发酵过程的葡萄糖浓度维持在10mM以上。 

进一步地，在所述哺乳动物的活细胞密度达到峰值以前将渗透压控制 在400Osm以下，在培养晚期渗透压控制在500Osm以下。 

由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点： 

（1）本发明的培养基不含血清和蛋白质，并去除了以往培养基中所使用的动物成分及植物蛋白水解物，所有组分化学成分确定，有利于产物的纯化、生产批次的稳定性，从而保证和提高了产品质量。 

（2）本发明的培养基及生产工艺支持高密度大规模细胞培养，细胞密度可提高10倍，达5-50x10⁶vc/mL；可提高目的物的产量，如单克隆抗体产量可达2-10g/L；平均缩短细胞培养工艺开发的时间2-6个月。 

（3）本发明的培养基适用于CHO细胞、BHK细胞、杂交瘤细胞等多种哺乳动物细胞。且在细胞培养过程中，不需要在培养基中添加谷氨酰胺。 

（4）本发明的培养基为国内研发产品，从整体上降低了生产成本，适用于大规模生产。 

（5）综上，本发明的培养基弥补了现有化学成分确定培养基的不足，填补了国内无化学成分确定的培养基的空白。 

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。 

图1是不同CHO细胞在本发明的化学成分确定的培养基中的生长情况示意图。 

图2是SP2/0细胞在本发明的化学成分确定的培养基中的生长情况示意图。 

图3是在本发明的化学成分确定的培养基中添加和不添加谷氨酰胺时CHO细胞的生长情况示意图。 

图4A、4B、4C、4D、4E、4F分别是Ab1、Ab2、Ab3三种抗体在不同体积（5L、100L、300L）培养基中的细胞生长累积及产量情况示意图。 

图5A、5B分别是细胞在一般反应器和使用截流系统的生物反应器中生长情况及抗体产量示意图。 

图6A、6B、6C、6D分别是细胞在一般反应器和使用截流系统的生物反应器中Gluc比消耗速率、NH₄⁺累积情况、CO₂累积情况和NH₄⁺比生成速率示意图。 

具体实施方式

本发明的一种化学成分确定的培养基，包括如表1中所示的以下终含量的各组分： 

表1培养基的组分和含量 

所述培养基以公开的DMEM/F12配方为基础培养基，用化学成分替代重组血清白蛋白（II）、人转铁蛋白和胰岛素，通过实验设计方法，调整氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及其他组分浓度，并在此基础上添加DMEM/F12公开配方不含有的组份如硫酸镍等，组成一种化学成分确定的、适用于规模生产的培养基。 

其中，人转铁蛋白的替代物为含铁化合物；胰岛素的替代物为含锌化合物。 

上述化学成分确定的培养基可用于大规模培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为CHO细胞、BHK细胞或杂交瘤细胞，如可为CHO-K1、CHO-K1SV、CHO-DG44、CHO S、CHO DXB11、NS0细胞或SP2/0细胞等，但不局限于此。 

上述化学成分确定的培养基可用于通过大规模培养哺乳动物细胞来生产生物类药物，所述生物类药物包括抗体、融合蛋白、重组蛋白、酶或疫苗等，但不局限于此，上述生物类药物可分泌到细胞的液体培养基中或从细胞中提取获得。 

可以以上述化学成分确定的培养基作为生产基础培养基，进行哺乳动物细胞的传代培养、高密度流加培养或连续灌注培养。 

以下以具体实施例详细描述本发明的化学成分确定的培养基、其应用及 大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺，应当指出，本发明不局限于以下实施例中所描述的特定的方法学，包括研究、开发方法、工艺规程和细胞株。所使用的术语是用来描述特定的实施案例，而并非旨在限制本发明的涵盖范围。 

实施例1：培养基配方的开发 

一种典型的哺乳动物细胞培养基含有50-70种组分。完全优化这些组分通常耗时而且工序复杂。每种成分一一优化都需要大量时间而且达不到整体优化的效果。我们的方案是首先将培养基主要组分划分为氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、抗氧化剂等，通过实验设计（DOE）对基础培养基进行优化，平衡所有营养组分并基于细胞代谢需求优化组分浓度。典型的CHO细胞培养基配方如表2所示。 

表2典型的CHO细胞培养基及配方 

*培养基配制时加入。 

实施例2：生产和流加补料培养基的配制 

1升生产培养基和1升高浓度流加补料培养基的配制方法分别见表3和表4。 

表31升生产培养基的配制 

表41升高浓度流加补料培养基的配制 

实施例3：利用本发明的培养基（实施例2的生产培养基）培养不同种类CHO细胞（CHO K1、CHO S和CHO DG44） 

分别从液氮罐中取出CHO K1、CHO S和CHO DG44三种细胞冻存管，立即在37℃水浴中复苏。无菌转移到10mL新鲜培养基重新悬浮细胞。计数后将培养体积稀释至30mL转移至125ml摇瓶中培养，初始细胞浓度为（0.5-1）×10⁶cells/mL，培养条件为37℃、湿度≥85％和5％CO₂，每天取样，记录细胞密度和活率。 

从图1中可以看出三种细胞均可以在本发明的化学成分确定的培养基中生长，细胞密度峰值可以达到（5-6）×10⁶cells/mL，培养6-7天活率维持在90%以上。 

实施例4：利用本发明的培养基培养SP2/0细胞 

从液氮罐中取出SP2/0细胞冻存管，立即在37℃水浴中复苏。无菌转移到10mL实施例2中新鲜生产培养基，（添加0.02-0.2mL/L脂类添加物储液（D-alpha维生素E1g/L，亚油酸20g/L溶解到1L乙醇中）)重新悬浮细胞。计数后将培养体积稀释至30mL转移至125ml摇瓶中培养，初始细胞浓度为（0.5-1）×10⁶cells/mL，培养条件为37℃、湿度≥85％和5％CO₂，每天取样，记录细胞密度和活率。 

从图2中可以看出SP2/0细胞可以在本发明的化学成分确定的培养基中生长，细胞密度峰值可以达到（5-6）×10⁶cells/mL，培养6-7天活率维持在85%以上。 

实施例5：CHO细胞在低或无谷氨酰胺下培养 

从液氮罐中取出一管CHO S细胞冻存管，立即在37℃水浴中复苏。无菌转移到10mL新鲜培养基重新悬浮细胞。计数后将培养体积稀释至30mL转移至两个125ml摇瓶中培养（其中一瓶添加2mM的谷氨酰胺），初始细胞浓度为（0.5-1）×10⁶cells/mL，培养条件为37℃、湿度≥85％和5％CO₂，每天分别取样，记录两摇瓶的细胞密度和活率。 

从图3中可以看出，CHO S细胞可以在本发明的化学成分确定的培养基中生长，是否添加谷氨酰胺对其生长无影响。氨根离子是影响细胞生长的一种主要抑制剂，而谷氨酰胺是氨根离子的主要来源。细胞在含游离谷氨酰胺的培养基中生长会将其利用产生高水平的氨根离子。细胞株在本发明所述的化学成分确定培养基中培养，通过代谢会产生足够的谷氨酰胺，从而在细胞培养起始阶段或培养过程中不需要加入大量谷氨酰胺，进而减少了氨根离子的积累。 

实施例6：本发明的培养基在单克隆抗体生产中的应用 

分别从液氮罐中取出三种生产抗体的细胞冻存管，立即在37℃水浴中复苏。无菌转移到10mL新鲜培养基重新悬浮细胞。计数后将培养体积稀释至30mL转移至125ml摇瓶中培养，初始细胞浓度为（0.5-1）×10⁶cells/mL，培养条件为37℃、湿度≥85％和5％CO₂，每2-3天取样计数。当细胞密度达到（2-3）×10⁶cells/mL时，补充培养基至足够体积使细胞密度为（0.5-1）×10⁶cells/mL，当细胞数量足够时转移至5L、100L或300L反应器中进行批次补料生产，初始接种密度为（0.5-1）×10⁶cells/mL，分别在培养第3、6、9天流加生产体积10%的浓缩流加液。培养条件为37℃、40%DO和pH7.0。 

在反应器培养过程中，细胞密度最高可以达到10-12x10⁶cells/mL，可以维持15天。从图4A-F中可以看出，三种抗体生产细胞可以实现反应器生产平行放大，细胞累计密度可达到（80-140）x10⁶cell*days/mL，抗体产量均在2g/L以上。通过发酵的早期和中期精确控制pH值，可以实现全过程的单 位产量都很高。通过添加流加液使整个发酵过程的葡萄糖浓度维持在10mM以上。在培养早期乳酸会累积但在中期会逐渐下降，大多数碱的添加是在培养的早期以中和乳酸对pH的影响，在反应器中CO₂的积累影响很小。同时，为了实现细胞的高培养密度（>10⁷cells/mL），在活细胞密度达到峰值以前将渗透压控制在400Osm以下，在培养晚期为了维持细胞的高活率，渗透压控制在500Osm以下。 

实施例7：本发明的培养基在单克隆抗体灌流生产中的应用 

从液氮罐中取出一管生产抗体的细胞冻存，立即在37℃水浴中复苏。无菌转移到10mL新鲜培养基重新悬浮细胞。计数后将培养体积稀释至30mL转移至125ml摇瓶中培养，初始细胞浓度为（0.5-1）×10⁶cells/mL，培养条件为37℃、湿度≥85％和5％CO₂，每2-3天取样计数。当细胞密度达到（2-3）×10⁶cells/mL时，补充培养基至足够体积使细胞密度为（0.5-1）×10⁶cells/mL，当细胞数量足够时转移至5L反应器中进行批次补料生产，初始接种密度为（1-2）×10⁶cells/mL，使用的培养基为90%-95%的生产培养基混合（5-10）%的浓缩流加液，当细胞密度达到（3-4）×10⁶cells/mL时，开启ATF截流系统，维持培养液每天进出系统速度为总体积的0.5-1.25倍。培养条件为37℃、40%DO和pH7.0。 

图5A、B描述了生产抗体细胞在一般反应器和使用截流系统的生物反应器中生长情况及抗体产量情况。在培养过程中通过流加液的加入控制糖浓度在10mM以上。在培养早期乳酸会累积但随后会逐渐下降。大多数碱的添加是在培养的早期以中和乳酸对pH的影响。细胞密度峰值可以达到35million cells/mL以上。培养20天的抗体产量在9.1g/L，最终抗体产量在（10-12）g/L左右。图6A-D描述了生产抗体细胞在一般反应器和使用截流系统的生物反应器中代谢参数变化情况，可以看出，与未使用截流系统相比，使用本发明的化学成分确定的培养基NH₄⁺的累积更加平缓，而发酵后期NH₄⁺的比生成速 率趋于零，这对于大规模发酵培养有明显优势。 

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。