哺乳动物细胞培养瞬时表达人骨桥蛋白

摘要

随着生物医药技术的不断发展，重组蛋白质已成为医药领域的一个重要组成部分，其中有50％以上是通过哺乳动物细胞表达获得的。作为重组蛋白的一种重要表达系统，哺乳动物细胞能够对所表达的蛋白质进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰，这对于表达分子量大、结构复杂的蛋白质，尤其是需要糖基化才能具有生物活性的蛋白质来说是至关重要的。
　　 瞬时表达作为一种重要的重组蛋白表达技术，可以在短时间内制备出产量可观的蛋白质，用于高通量的药物筛选和蛋白药的早期研究，与传统的构建稳定表达细胞株相比，节省了大量的时间和人力物力。因此，建立一种高效表达的瞬时转染系统具有非常重大的意义。
　　 本论文在传统的夹心法ELISA检测的基础上利用生物素-亲和素的级联放大效应建立了高灵敏度检测人OPN蛋白的ELISA检测方法，通过响应曲面法对转染时的细胞密度、DNA浓度、PEI浓度和复合物的孵育时间等转染条件进行优化，并且在优化的基础上通过HEK293和CHO-S两个细胞株分别表达人OPN，并对蛋白的表达量以及细胞生长状况进行比较。
　　 经过一系列的实验，选择选择捕捉抗体的浓度为5μg/mL、生物素化抗体的浓度为0.2μg/mL以及酶标亲和素的稀释比例为1/1000的条件作为检测OPN蛋白的条件;筛选出了CHO-S瞬时转染的最佳条件:转染时的细胞密度为2×106 cells/mL、DNA浓度为3μg/mL、PEI浓度为10μg/mL，复合物孵育时间为16.5 min。
　　 最后，本论文通过人OPN在HEK293-F和CHO-S细胞中的表达，获得具有完整生物活性的重组蛋白，测得人OPN在CHO-S细胞中的表达量远低于在HEK293-F细胞中的表达量，证实了HEK-293-F是一种高效的表达系统。

目录

声明

摘要

第一章 综述

第一节 引言

第二节 哺乳动物细胞表达重组蛋白

1．2．1 表达载体

1．2．2 宿主细胞

1．2．3 转染方法

1．2．4 PEI介导的瞬时转染及转染条件的优化

1．2．5 哺乳动物细胞的培养

1．2．6 重组蛋白的分析方法

1．2．7 纯化方法

第三节 本研究的目的、主要内容及意义

第二章 OPN在悬浮培养的HEK-293细胞中的瞬时表达

第一节 引言

第二节 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

第三节 结果与分析

2．3．1 OPN的ELISA检测方法

2．3．2 复合物颗粒分析

2．3．3 转染方法的选择

2．3．4 OPN的表达

2．3．5 OPN的纯化

第四节 小结

第三章 OPN在悬浮培养的CHO-S细胞中的瞬时表达

第一节 实验材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

第二节 结果与分析

3．2．1 CHO-S生长曲线

3．2．2 曲面响应法优化转染条件

3．2．3 OPN在悬浮培养的CHO-S细胞中的表达

第三节 小结

第四章 结论

参考文献

致谢

个人简历