钆(Ш)-碳量子点和其制备方法以及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用

摘要

本发明公开了一种钆(Ш)-碳量子点和制备方法以及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用，属于医学影像材料制备技术领域，包括以下步骤：1）将前驱体进行热处理，生产热解产物；2）将热解产物加入碱性溶液中进行超声分散处理，得到悬浊液；3）将悬浊液经水性微孔滤膜抽滤得到含有钆(Ш)-碳量子点的滤液；4）将含有钆(Ш)-碳量子点的滤液透析并干燥得到钆(Ш)-碳量子点。本发明简单易行，对设备要求低，反应条件易控制，无需有机试剂参与，制得的钆(Ш)-碳量子点能够均匀稳定地分散于水中，具有优良的磁共振响应和光致发光性能，适用于磁共振-荧光双模态成像探针。

说明书

技术领域

本发明属于医学影像材料制备技术领域，具体涉及一种钆(Ш)-碳量子点 和其制备方法及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用。

背景技术

磁共振-荧光双模态分子影像技术克服了单一分子影像技术的局限性，使 不同分子影像技术的优势得到互补，大大拓宽了分子影像技术的研究范围与 应用前景。临床中得到广泛应用的磁共振成像（MRI）技术能提供高分辨率 的组织信息和三维结构成像，并且无需使用放射性物质作为对比剂，但其灵 敏度较低，难以准确预测早期病变和微小病变。荧光成像技术具有相当高的 灵敏度，但其穿透力有限。

磁共振-荧光双模态分子影像技术用探针的开发已经成为医学和材料领 域的研究热点，其中钆(Ш)螯合物和半导体量子点结合而构筑的双模态探针 最有研究价值。近年来，纳米技术的发展推动了稀土、荧光蛋白和半导体量 子点等与超顺磁性铁剂或顺磁性钆(Ш)螯合物类MRI造影剂的结合（Chem. Soc.Rev.，2008，38(2)：372-90）。其中，钆(Ш)螯合物可以降低组织内水分 子中质子的弛豫时间，表现出增强的信号，已广泛用于临床；半导体量子点 光褪色过程长，发射波长根据尺寸可调，较荧光蛋白和稀土材料有着显著优 势。但是半导体量子点含有镉或其它重金属具有毒性，将会限制钆(Ш)螯合 物与半导体量子点结合的双模态探针的推广和应用。Heesum Yang等人通过 两步反应制备了钆(Ш)功能化的SiO₂包覆的CdS：Mn/ZnS纳米探针 [Biomaterials，2011，32(4)：1185-92]。通过SiO₂包覆可以降低半导体量子点 的毒性，但使量子点的尺寸增加了4～7nm，且制备方法比较复杂。

具有优异生物相容性的荧光碳量子点可以替代半导体量子点和钆(Ш)螯 合物组建双模态探针。碳量子点制备方法简单，主要包括激光消融法、电化 学法、水热法、高温热解/煅烧有机物法和超声法。高温热解/煅烧有机物法 是目前制备碳量子点最简单快速的方法，该法制得的荧光碳量子点的量子产 率较高。碳量子点具有优异的生物相容性，在生化传感、成像分析和光热治 疗等领域的研究工作已在国外大量开展（Analyst，2013，138:6551-57；J.Mat. Chem.B.，2013，1：4972-82）。但碳量子点用于组建双模态探针的研究才刚 刚起步。仅Athanasios B.Bourlinos等选用三羟甲基氨基甲烷为碳源，二乙三 胺五醋酸钆为钆源，盐酸甜菜碱为表面亲水改性剂，经过高温热解制得用于 磁共振-荧光双模态成像探针的钆(Ш)掺杂的碳量子点（J.Mat.Chem.，2012， 22(44)：23327-30）。这种技术选用的前驱体为独立的碳源和钆源，且制备过 程复杂，且前驱体需经过在水溶液中的反应和复杂的有机试剂参与的后处理 过程后才能进行热解。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种钆(Ш)- 碳量子点和其制备方法及其在磁共振-荧光双模态成像探针中的应用，该方法 简单易行，对设备要求低，反应条件易控制，且无需有机试剂参与，环境友 好，经该方法制得的钆(Ш)-碳量子点，能够均匀、稳定地分散于水中，并具 有优良的磁共振响应和光致发光性能，适用于磁共振-荧光双模态成像探针。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种钆(Ш)-碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

1）将前驱体置于高温电阻炉中，以1～30℃/min的升温速率由室温升至 200～450℃之间的某个温度，然后在此温度下保温0～5h，最后降至室温，得 到热解产物；

所述的前驱体为钆(Ш)螯合物或者为1份的氧化钆、氯化钆、硝酸钆或 葡甲胺与1～5份钆(Ш)螯合物组成的混合物；

2）将2份热解产物加入20～50份质量浓度为0.01～0.1mol/L的碱性溶液 中，超声分散处理，得到悬浊液；

3）将悬浊液经0.22～1μm的水性微孔滤膜抽滤，取滤液，得到含有钆(Ш)- 碳量子点的滤液；

4）将含有钆(Ш)-碳量子点的滤液透析，得到分散液，然后将分散液干 燥至恒重，得到钆(Ш)-碳量子点。

步骤1）所述的钆(Ш)螯合物为二乙三胺五醋酸钆、乙二胺四乙酸钆、 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸钆、钆喷酸单葡胺、钆喷酸葡胺、钆 特酸单葡胺或钆特酸葡胺中的一种或几种。

步骤1）所述的热处理是在氦气、氮气、氩气或空气气氛中的一种或几 种气氛中进行。

步骤2）所述的碱性溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水。

步骤2）所述的超声分散处理是在功率为300～600W的条件下，分散处 理20～60min。

在步骤3）所述的抽滤过程中持续用质量浓度为0.01～0.1mol/L的碱性 溶液洗涤滤饼，直至滤出的液滴变为无色；所述的碱性溶液为氢氧化钠水溶 液、氢氧化钾水溶液或氨水。

步骤4）所述的透析是将滤液装入截留分子量为500～3000D的再生纤维 素透析袋中，经去离子水或pH值为7.4的PBS缓冲溶液透析36～72h。

步骤4）所述的干燥为真空干燥或冷冻干燥。

钆(Ш)-碳量子点的直径分布在1.5～5nm，纵向弛豫率达5.6mM·L^-1·S^-1， 量子产率达12.4%。

钆(Ш)-碳量子点在制备磁共振-荧光双模态成像探针中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明主要以兼作钆源和碳源的有机化合物为前驱体，采用一步热解形 成牢固络合了钆(Ш)的碳量子点，即钆(Ш)-碳量子点。本发明具有以下优点：

1、与传统半导体量子点相比，碳量子点具有无毒、制备方法简单的优势， 本发明由钆(Ш)和碳量子点结合制得的钆(Ш)-碳量子点，显示增强的磁共振 信号，并表现出优异的光致发光性能，具有良好的生物相容性。

2、本发明方法以可兼作钆源和碳源的有机化合物为前驱体，经过一步热 解得到钆(Ш)-碳量子点，保证了钆(Ш)和碳量子点的紧密结合。纯净的钆(Ш)- 碳量子点中钆(Ш)被碳量子点牢固螯合，以螯合物形式存在的钆(Ш)基本保证 了钆(Ш)-碳量子点在体内应用的安全性。

3、本发明方法通过调节热解温度和热解时间可以实现钆(Ш)-碳量子点 的分子结构和性能的可控制备，该方法制备的钆(Ш)-碳量子点表面含有亲水 的羟基和羧酸盐基团，可均匀、稳定地分散于去离子水、缓冲溶液或培养液 中。

4、本发明方法简单易行，对设备要求低，前驱体发生热解之前无需复杂 的处理过程，钆(Ш)-碳量子点的制备过程中条件容易控制、无需有机试剂的 参与。

5、经本发明制得的钆(Ш)-碳量子点直径约为3nm，具有优异的磁共振 响应（纵向弛豫率达5.6mM·L^-1·S^-1）和光致发光性能（量子产率达12.4%）； 通过Hela细胞培养实验，证明该钆(Ш)-碳量子点具有良好的生物相容性，因 此能够用于制备磁共振-荧光双模态成像探针。

附图说明

图1为本发明制得的钆(Ш)-碳量子点的TEM照片

图2为本发明制得的钆(Ш)-碳量子点的尺寸分布柱状图；

图3为Hela细胞在不同浓度的钆(Ш)-碳量子点溶液中的活力柱状图 (CCK-8法)；

图4为Hela细胞在钆(Ш)-碳量子点溶液中培养后的细胞形态照片，其中， a为在浓度为200μg/mL的钆(Ш)-碳量子点溶液中培养24h后的形态照片；b 为空白对照组中的细胞形态（即不含钆(Ш)-碳量子点）。

具体实施方式

下面结合具体的附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对 本发明的解释而不是限定。

实施例1

1）以二乙三胺五醋酸钆为前驱体，将其置于预先设定升温程序并连续通 入氮气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程 序设定为：以1℃/min的升温速率由室温升高至200℃，在200℃下保温5h， 最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入20份浓度为0.01M的氢氧化钠水溶液中，然后 置于超声波清洗器中（功率为300W）分散处理20min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.22μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量 子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.01M的氢氧化钠水溶液持续洗涤滤饼， 直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为500D的再生纤维素透析袋中，经去离子水 透析36h，得到的分散液经旋转蒸发仪浓缩后置于真空烘箱中在50℃下干 燥24h，制备出纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例2

1）以二乙三胺五醋酸钆为前驱体，将其置于预先设定升温程序并连续通 入氦气和氮气的混合气体的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高 温电阻炉的升温程序设定为：以5℃/min的升温速率由室温升高至400℃， 400℃下保温3h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入30份浓度为0.05M的氢氧化钠水溶液中，然后 置于超声波清洗器中（功率为400W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.45μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量 子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.05M的氢氧化钠水溶液持续洗涤滤饼， 直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1500D的再生纤维素透析袋中，经pH值 为7.4的PBS缓冲溶液透析48h，得到的分散液经过旋转蒸发仪浓缩后置于 真空烘箱中在50℃下干燥24h，制备出纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例3

1）以1份二乙三胺五醋酸钆、1份乙二胺四乙酸钆和1份1,4,7,10-四氮 杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸钆混合物为前驱体，将其置于预先设定升温程序 的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定 为：以30℃/min的升温速率由室温升高至450℃，450℃下保温3h，最后降 温至室温。

2）将2份热解产物加入30份浓度为0.05M的氢氧化钾水溶液中，然后 置于超声波清洗器中（功率为600W）分散处理60min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.65μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量 子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.05M的氢氧化钾水溶液持续洗涤滤饼， 直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为3000D的再生纤维素透析袋中，经pH值为 7.4的PBS缓冲溶液透析48h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃ 后，将冻结的样品真空干燥6h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例4

1）以钆喷酸单葡胺为前驱体，将其置于预先设定升温程序的高温电阻炉 中进行加热处理，生成热解产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以1℃/min 的升温速率由室温升高至450℃，然后降温至室温。

2）将2份热解产物加入50份浓度为0.1M的氨水中，然后置于超声波 清洗器中（功率为600W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.8μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量 子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氨水持续洗涤滤饼，直至滤出的 液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1000D的再生纤维素透析袋中，经pH值为 7.4的PBS缓冲溶液透析72h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃ 后，将冻结的样品真空干燥10h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例5

1）以1份钆喷酸葡胺和1份氧化钆组成的混合物为前驱体，将其置于预 先设定升温程序并连续通入氩气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产 物。高温电阻炉的升温程序设定为：以1℃/min的升温速率由室温升高至 450℃，然后保温0.5h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入50份浓度为0.1M的氨水中，然后置于超声波 清洗器中（功率为600W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为1μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量子 点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氨水持续洗涤滤饼，直至滤出的液 滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1000D的再生纤维素透析袋中，经pH值为 7.4的PBS缓冲溶液透析72h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃ 后，将冻结的样品真空干燥10h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例6

1）以5份钆喷酸单葡胺和1份葡甲胺组成的混合物为前驱体，将其置于 预先设定升温程序并连续通入氮气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解 产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以20℃/min的升温速率由室温升高 至350℃，350℃下保温3h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入50份浓度为0.1M的氢氧化钠水溶液中，然后 置于超声波清洗器中（功率为600W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.45μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量 子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氢氧化钠水溶液持续洗涤滤饼， 直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1000D的再生纤维素透析袋中，经去离子 水透析72h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样 品真空干燥8h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例7

1）以3份钆特酸单葡胺和1份氯化钆组成的混合物为前驱体，将其置于 预先设定升温程序并连续通入氮气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解 产物。高温电阻炉的升温程序设定为：以25℃/min的升温速率由室温升高 至300℃，300℃下保温2.5h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入50份浓度为0.1M的氨水中，然后置于超声波 清洗器中（功率为600W）分散处理30min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.55μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量 子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氨水持续洗涤滤饼，直至滤出的 液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为3000D的再生纤维素透析袋中，经去离子 水透析48h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样 品真空干燥8h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

实施例8

1）以4份钆特酸葡胺和1份硝酸钆组成的混合物为前驱体，将其置于预 先设定升温程序并连续通入氩气的高温电阻炉中进行加热处理，生成热解产 物。高温电阻炉的升温程序设定为：以15℃/min的升温速率由室温升高至 200℃，200℃下保温1h，最后降温至室温。

2）将2份热解产物加入30份浓度为0.1M的氢氧化钾水溶液中，然后 置于超声波清洗器中（功率为300W）分散处理60min，得到悬浊液。

3）悬浊液经孔径为0.22μm的水性微孔滤膜抽滤，得到含有钆(Ш)-碳量 子点的滤液。抽滤过程中用浓度为0.1M的氢氧化钾水溶液持续洗涤滤饼， 直至滤出的液滴变为无色。

4）将滤液装入截留分子量为1500D的再生纤维素透析袋中，经去离子 水透析36h，得到的分散液置于冷冻干燥机中冷冻至-60℃后，将冻结的样 品真空干燥8h，得到纯净的钆(Ш)-碳量子点。

对制得的钆(Ш)-碳量子点性能进行试验测定，结果如下：

（1）尺寸

对制得的钆(Ш)-碳量子点通过JEOL的JEM-2100高分辨率透射电子显 微镜（HRTEM）测试，参见图1，测得钆(Ш)-碳量子点直径分布在1.5～5nm 之间，平均粒径约为3nm，参见图2。

（2）磁共振响应

采用GE公司的医用3.0T MR仪扫描测试钆(Ш)-碳量子点的纵向弛豫时 间T₁（反转恢复序列TI=100、TI=300、TI=600,TR/TE4000ms/9.2ms)，按 公式（1）计算纵向弛豫率r₁，本方法制备的钆(Ш)-碳量子点的r₁值可达5.6 mM·L^-1·S^-1，比含等浓度Gd(Ⅲ)离子的临床用马根维显（r₁=4.8mM·L^-1·S^-1） 的高。

(1/T₁)_obsd=(1/T₁)_dia+r₁×[M](1)

式中：(1/T₁)_obsd为水质子的弛豫率，(1/T₁)_dia为含Gd(Ⅲ)的造影剂的弛 豫率，[M]是样品中Gd(Ⅲ)的摩尔浓度。

（3）光致发光性能

采用FLsp920型荧光光谱仪扫描钆(Ш)-碳量子点在365nm波长下激发 的发射光谱。以硫酸奎宁的0.1M H₂SO₄溶液为参比物（365nm波长下激发 时，Q=0.55），通过公式（2）计算本方法制备的钆(Ш)-碳量子点的量子产率 可达12.4%。

$Q=Q_R\frac{I}{I_R}\frac{A_R}{A}\frac{{\eta }^2}{{\eta }_R^2}---\left(2\right)$

式中：Q为量子产率，I为光致发光强度，A为激发波长下经UV-vis测 得的碳量子点的吸光度，η为溶剂的反射系数，脚标R代表参比物。

（4）生物相容性

采用CCK-8方法研究了Hela细胞在不同浓度的钆(Ш)-碳量子点溶液中 的活力：以Hela细胞在不含钆(Ш)-碳量子点的培养液中的活力作为空白对照 组。Hela细胞在浓度低于80μg/mL的钆(Ш)-碳量子点溶液中的活力与空白 对照组相当，甚至在浓度高达200μg/mL的钆(Ш)-碳量子点溶液中也有约 83%的活力，如图3所示。钆(Ш)-碳量子点对人体Hela细胞未表现出明显的 毒性。Hela细胞在浓度为200μg/mL的钆(Ш)-碳量子点溶液中培养24h后没 有发生形态变化，如图4（a和b）所示。

综上所述，本发明主要以兼作钆源和碳源的有机化合物为前驱体，采用 一步热解形成牢固络合了钆(Ш)的碳量子点，记为钆(Ш)-碳量子点。其直径 约3nm，能够均匀、稳定地分散于水中，并具有优异的磁共振响应（纵向弛 豫率可达5.6mM·L^-1·S^-1）和光致发光性能（量子产率可达12.4%）。通过Hela 细胞培养实验，证明其具有良好的生物相容性，有望用作磁共振-荧光双模态 成像探针。