含猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病抗原的疫苗组合物及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种含猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病抗原的疫苗组合物及其制备方法和应用，该疫苗组合物包含免疫量的猪支原体肺炎抗原，免疫量的猪链球菌病抗原和佐剂。该疫苗组合物免疫程序简单，能同时有效的防治猪支原体肺炎和猪链球菌病，其免疫效果至少与分别注射单苗效果相当，副反应小，免疫期长，耗时少、费力少；该疫苗组合物生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。

说明书

技术领域

本发明涉及一种含猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病抗原的疫苗组合物及其制备方法，属于兽药领域。 

背景技术

猪气喘病又称猪支原体肺炎或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶、中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。发病率高，死亡率低。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合症病毒和其它病原混合感染，使其感染的严重性进一步提高。到目前为止，该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。 

猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种。该疾病通过咳嗽产生的飞沫以及与感染或恢复期的病原携带猪直接接触而传播。感染动物和未感染动物混居导致早期和频繁的再感染。感染通常开始于携带病原的母猪产胎时感染小猪。由于猪群集中管理，感染在生命后期才变得明显。当断乳后把猪集中起来时，通常还可发现其它感染。在六周龄或更大的猪中常常观察到明显的疾病。感染猪的生长速度和饲料转化率显著降低。使用抗生素治疗贵并且需要长期使用，此外，再感染也是一个问题，因此，目前疫苗是避免感染及其影响的最有效方法。 

猪链球菌病（Swine streptococcosis）最早在1945年由Bryante报道，是母猪或仔猪发生的一种由链球菌引起的败血性传染性流行病,目前,美法日、俄、印度、丹麦、荷兰、加拿大等国家均有猪链球菌病 的报道，在国内最早由吴硕显(1949)于上海郊区发现本病的散发病例,20世纪70年代发病增加,80年代后期发病更趋严重,在许多地方呈大群爆发地方流行，迄今已有13个省市(区)报道了链球菌病,并在华南、西南和华东等地区造成大面积的流行，损失惨重，是多年来一直困扰我国养猪业的主要传染病之一。1987年9月中旬,江苏省宝应、淮安、沭阳、涟水等地爆发马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病；1998年7月中下旬,江苏省局部爆发猪链球菌2型引发的猪链球菌病；2005年再次在四川爆发猪链球菌2型链球菌病，并有相关从业人员感染致死，引起世界范围内的高度重视。 

在临床上，常可见到猪链球菌病和气喘病的混合感染（杨永柏、张守勇，温和型猪瘟与猪气喘病、链球菌混合感染的诊治，中国牧业通讯，2009，(9):43-44）。猪肺炎支原体是条件性致病菌，发生本病后，可使机体抵抗力降低，极易继发感染链球菌病等，使病情加重和病死率升高（安淑秀、李英茹，猪支原体肺炎继发猪链球菌病的诊治，今日畜牧兽医，2006，(6):30）。抗菌药物的使用常常会引起耐药性以及药物残留问题，治疗效果不理想。而在使用疫苗防治这两种疾病时，单苗多次注射会引发应激和安全问题，并且在混合感染的情况下，预防效果质量下降。因此，本领域需要能产生保护性免疫应答以同时抵抗猪肺炎支原体和猪致病性链球菌感染的疫苗，减少所述感染的发生率和/或减轻所述感染的严重性，或预防与所述感染有关的临床表现。联合疫苗不仅方便、多效、低成本，与单一疫苗相比，还可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。 

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明目的在于提供一种含有猪支原体肺 炎抗原和猪链球菌病抗原的疫苗组合物及其制备方法，所述疫苗组合物免疫程序简单，能同时有效的防治猪支原体肺炎和猪链球菌病，其免疫效果至少与分别注射单苗效果相当，副反应小，免疫期长，耗时少、费力少；所述疫苗组合物生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。 

本发明提供了一种含猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病抗原的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的猪支原体肺炎抗原，免疫量的猪链球菌病抗原和佐剂。 

优选地，所述猪支原体肺炎抗原为灭活的、改良的活的或减毒的猪肺炎支原体，含猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽； 

所述猪链球菌病抗原为灭活的、改良的活的或减毒的猪链球菌病抗原，含猪链球菌病病原的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含猪链球菌病病原的免疫原性氨基酸序列的多肽。 

更优选地，所述猪支原体肺炎抗原为灭活的猪肺炎支原体J株或HN0613株，所述猪链球菌病抗原为灭活的马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和猪链球菌2型SC株。 

更优选地，所述猪支原体肺炎抗原为10⁸~10¹⁰MHDCE/ml，所述猪链球菌病抗原为10⁸~10¹⁰CFU/ml。 

更优选地，所述的疫苗组合物，其中，所述猪支原体肺炎抗原为1×10⁹～2×10⁹MHDCE/ml，所述猪链球菌病抗原为1×10⁹～2×10⁹CFU/ml。 

优选地，所述佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、蜂胶、ISA206、ISA760VG，优选卡波姆、Gel01、ISA206、ISA760VG；更优选卡波姆、Gel01；最优选Gel01。 

优选地，所述佐剂为10wt%~60wt%。 

优选地，所述疫苗组合物还包含其他辅剂，所述辅剂包括防腐剂、稀释剂，所述防腐剂包括硫柳汞，所述稀释剂包括PBS溶液。 

猪支原体肺炎抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的抗原的任何组合物。 

所述猪肺炎支原体HN0613株（Mycoplasma hyopneumoniae strainHN0613）的保藏编号为：CCTCC M 2012230，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）。保藏日期为2012年6月13日。 

猪支原体肺炎抗原还可以包含以下疫苗组合物中的任一种抗原如勃林格殷格翰公司的M.hyo；哈药集团公司的Respisure和RespisureOne；美国先灵葆雅的Myco西班牙海博莱生物大药厂的MYPRAVAC SUIS；美国普泰克公司的MycoGard;美国辉瑞公司的RespiFend MH；梅里亚动物保健公司的猪克喘（BQ14株）。 

猪链球菌病抗原是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪链球菌病的免疫应答的抗原的任何组合物。 

优选地，猪链球菌病抗原是灭活形式的马链球菌兽疫亚种、猪链球菌1型、猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型。优选地，猪链球菌病抗原是灭活形式的马链球菌兽疫亚种、猪链球菌2型。最优选地，猪链球菌病抗原是灭活形式的马链球菌兽疫亚种ATCC35246株（购自ATCC）、猪链球菌2型SC株。所述猪链球菌2型SC株（Streptococcussuis Serotype 2，Strain SC）的保藏编号为：CCTCC M 2011351，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）。保藏日期均为2011年10月12日。 

猪链球菌病抗原还可以包含以下疫苗组合物中的任一种抗原如上海海利生物技术股份有限公司的猪链球菌病灭活疫苗（猪链球菌2型+马链球菌兽疫亚种）、华中农业大学的猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型+猪链球菌7型）；专利CN101721695A中的马链球菌兽疫亚种C55138株、兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949株；专利CN 101703769A中的猪链球菌2型HA9801株。 

本发明中所述用语“全细胞菌体”，是指猪肺炎支原体或猪链球菌病病原的完整细胞体。 

优选地，本发明疫苗组合物中，猪肺炎支原体HN0613株抗原含量为灭活前10⁸~10¹⁰MHDCE/ml；更优选地，本发明疫苗组合物中，猪肺炎支原体HN0613株抗原含量为灭活前1×10⁹～2×10⁹MHDCE/ml。 (MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体)。 

优选地，本发明疫苗组合物中，猪链球菌2型SC株抗原含量为灭活前10⁸~10¹⁰CFU/ml、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株灭活前含量为10⁸~10¹⁰CFU/ml；更优选地，本发明疫苗组合物中，猪链球菌2型SC株抗原含量为灭活前1×10⁹~2×10⁹CFU/ml、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株灭活前含量为1×10⁹~2×10⁹CFU/ml。 

本发明提供了一种根据本发明的所述疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤：将抗原与疫苗辅剂混合制得抗猪支原体肺炎、猪链球菌病的疫苗组合物，其中，所述抗原包括猪肺炎支原体抗原和猪链球菌病抗原。 

根据本发明方法，所述方法还包括在配苗步骤之前的抗原准备步骤，包括制备抗原，或者通过其他方法获得抗原，如直接购买抗原。所述制备抗原包括分别培养猪肺炎支原体和猪链球菌病病原，并分别进行浓缩，获得猪肺炎支原体抗原和猪链球菌病抗原。优选所述制备抗原包括分别培养猪肺炎支原体和猪链球菌病抗原，并分别进行浓缩、灭活，获得猪肺炎支原体灭活抗原和猪链球菌病灭活抗原。 

本发明提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括：分别培养所述猪肺炎支原体HN0613株，所述马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和猪链球菌2型SC株；测定含量并浓缩，分别灭活；按比例配制，混匀乳化。 

本发明还提供了所述含猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病抗原的疫苗组合物用于制备预防和治疗猪支原体肺炎和猪链球菌病的药物的应用。 

本发明的所述疫苗组合物中的两种抗原不仅均能保留各自成分的免疫效力，没有相互干扰，更有相互免疫促进作用，组合疫苗比单苗效果更佳。 

本发明的含猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病抗原的疫苗组合物具有以下优点： 

1）含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的 联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。 

2）本发明的抗猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪支原体肺炎和猪链球菌病的二联疫苗，不仅不会产生两种抗原成份的相互免疫干扰或影响，而且意外发现猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病的抗原混合后，不仅能产生保护性免疫应答，同时，还意外发现猪肺炎支原体抗原和抗猪链球菌病抗原有相互增强免疫效果的作用，而且如本发明后续实施例所证明的，特别是存在其中一种抗原的情况下，另一种抗原量减半仍能维持本抗原的免疫效果，而这出乎本领域普通技术人员预料的。 

3）上述预防和治疗猪支原体肺炎和猪链球菌病的二联疫苗与猪支原体肺炎或猪链球菌病的单疫苗的效力相比，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此，本发明的二联疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。 

4）解决了现有技术的困难，改变了人们对猪支原体肺炎病原和猪链球菌病病原同时感染时的认识偏见，首次将抗猪支原体肺炎抗原和抗猪链球菌病抗原按照合适的比例联合使用，而在本发明之前，一直没有人认为两种病可以同时进行预防进而这两种疫苗可以联合使用。 

5）此外，本发明预防和治疗猪肺炎支原体相关疾病和猪链球菌病的二联疫苗，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫1次就能够预防猪支原体肺炎和猪链球菌病，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

本发明所涉及的预防和治疗猪支原体肺炎和猪链球菌病的二联疫苗，采用猪肺炎支原体、猪链球菌和其他能致猪链球菌病的链球菌作为抗原，本发明实施例中选用其中猪肺炎支原体菌株为HN0613株，其他猪肺炎支原体菌株也具有同样的效果；链球菌选用猪链球菌2型SC株及马链球菌兽疫亚种菌株ATCC35246株，其他能致猪链球菌病的菌株也能达到同样的效果，也能实现本发明的发明目的。 

实施例1、猪肺炎支原体抗原、猪链球菌病抗原的制备 

1．菌（毒）株的来源 

所选用的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，简称Mhp）为HN0613株，保藏号为CCTCCM2012230，保藏日期为2012年6月13日。 

所选用的猪链球菌2型（Streptococcus suis Type 2，简称SS2）为SC株，保藏编号为：CCTCCM2011351，保藏日期均为2011年10月13日。 

所选用的马链球菌兽疫亚种（S.equi subsp.zooepidemicus，简称SESZ）菌株为ATCC35246株（购自美国模式培养物集存库，即Americantype culture collection，ATCC） 

2．疫苗半成品的制备及检验 

2.1生产用种子的制备 

2.1.1猪链球菌2型、马链球菌兽疫亚种： 

一级种子的繁殖 

将SS2SC株、SESZ ATCC35246株冻干菌种用缓冲马丁肉汤稀释， 分别划线接种于Clumbia羊血琼脂（法国梅里亚公司），37℃培养24h，选择有明显溶血环、光滑、稍大的菌落接种于Clumbia羊血琼脂（法国梅里亚公司）斜面，37℃培养18~24h作为一级种子。 

二级种子的繁殖 

用少量缓冲马丁肉汤冲洗一级种子的血琼脂斜面培养物，接种于含1.5%（v/v）犊牛血清的缓冲马丁肉汤，同时加入0.2%葡萄糖（制成50%溶液灭菌后按比例加入），37℃静置培养16~18h，经检验纯粹后即为二级种子。 

缓冲马丁肉汤的配制：将蛋白胨20g，氯化钠2g加入1000ml牛肉汤中，加热至80~90℃，用氢氧化钠调整pH值为7.2，再缓缓加入磷酸氢二钠1g，碳酸氢钠2g，煮沸90分钟，静置2~8h，吸取上清液，116℃高压灭菌40分钟，灭菌后pH值为7.6~8.0。将葡萄糖配成50%溶液，116℃高压灭菌30分钟，在接种时加入。 

2.1.2猪肺炎支原体： 

一级种子的繁殖 

将Mhp HN0613株冻干菌种用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7d,选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7d，作为一级种子。 

二级种子的繁殖 

取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养7d，经检验纯粹后作为二级种子。 

液体培养基的配方（按1065m1计）：牛心浸出液300ml，ddH2O360ml，校正pH值到7.4,121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，0.25%酚红10ml马血清200ml，5%水解乳蛋白100m1，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1%醋酸铊溶液25m1。 

固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar（纯化琼脂）即可。 

2.2制苗用菌液的制备 

2.2.1猪链球菌2型、马链球菌兽疫亚种： 

将缓冲马丁肉汤预热至37℃左右，按10~20%接种二级种子液，37℃静置培养16~18h，培养期间振摇2~3次，收获菌液做纯粹检验后，置2~8℃保存备用。 

2.2.2猪肺炎支原体： 

将液体培养基培养的猪肺炎支原体二级种子液按10%(v/v)接种于液体培养基中。37℃下培养3-6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)。培养结束后，取样，根据《中华人民共和国兽药典(2010版)》中细菌类活疫苗纯粹检验方法进行纯粹检验，置2~8℃保存备用。 

2.3含量测定 

2.3.1猪链球菌2型、马链球菌兽疫亚种：活菌计数取培养9-10h菌液1ml，按《中华人民共和国兽药典》（2005年版）附录方法进行活菌计数。 

2.3.2猪肺炎支原体菌体：用PCR方法对培养物进行计数。10倍比稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检出的最低限量为3×10-3μg（相当于1000左右个菌体），按稀释的倍数算出菌体数（沈青春，谭青松，王琴，等，PCR方法测定Mhp培养物菌数，中国预防兽医学报，2006，28（1）：55-57）。 

2.5浓缩 

2.5.1将猪链球菌2型、马链球菌兽疫亚种离心，弃去上清获得菌泥，加无菌PBS悬浮，进行活菌计数。 

2.5.2将猪肺炎支原体培养液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为1000Kda道尔顿）进行浓缩，进行菌体计数。 

2.5灭活 

分别取检验合格的猪肺炎支原体、猪链球菌2型、马链球菌兽疫亚种菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2%的甲醛溶液（v/v），放37℃灭活，其间每隔3-4小时搅拌一次，24小时后取出，进行灭活检验和无菌检验，结果无菌生长。 

表1制备的浓缩抗原及含量 

抗原>灭活前含量>猪链球菌2型SC株>10¹¹CFU/ml>马链球菌兽疫亚种ATCC35246株>10¹¹CFU/ml>猪肺炎支原体HN0613株>10¹¹MHDCE/ml>

实施例2.疫苗组合物的制备 

1防腐剂的配制 

1%（w/v）的硫柳汞（国药集团化学试剂有限公司20120106）水溶液 

2稀释剂的配制 

无菌的PBS（0.01M，pH=0.02）缓冲溶液：在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0.25g氯化钾、3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，然后定容至1L，121℃高压灭菌30min备用。 

3佐剂的配制 

Gel 01（法国SEPPIC公司20120401），121℃高压灭菌30min备用。 

4配苗 

取实施例1制备的Mhp、SS2、SESZ浓缩灭活抗原，根据联苗及单苗中最终的抗原含量制成混合抗原液或直接制成抗原液，然后将抗原液与Gel01佐剂按90:10（v/v）混合，用pH为7.2的PBS补充至所需体积，以500r/min搅拌30分钟即可。 

具体制备如下： 

表2疫苗L 

表3疫苗H 

表4疫苗1 

表5疫苗2 

表6疫苗3 

表7疫苗4 

表8疫苗5 

成分>体积百分比%v/v>SS2SC株（灭活前含量10¹¹CFU/ml）>2%>

[0098] 

Gel 01>10%>1%的硫柳汞水溶液（w/v）>1%>无菌PBS>87%>总计>100%>

表9疫苗6 

表10疫苗7 

制备各种疫苗如表11： 

表11 

实施例3、本研究是为了评价不同抗原含量Mhp-SS2-SESZ组合疫苗的组合效力。 

1材料： 

实施例2制备疫苗： 

表12 

动物：4-5周龄，Mhp、SS2、SESZ血清抗体均为阴性的猪 

攻毒菌株：SS2SC株、SESZ ATCC35246株（购自美国模式培养物集存库，即American type culture collection，ATCC）、Mhp CVCC354株（购自中国兽医药品监察所） 

2方法： 

选4-5周龄仔猪50头，随机分为10组，每组5头。第0天，对第1、4、7组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗L，对第2、5、8组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗H，第3、6、9组颈部肌肉注射无菌PBS，均为2ml/头，第10组作为空白对照，既不免疫也不攻毒。第1~6组分同一房间饲养，第7~9组分同一房间饲养，第10组隔离饲养。第28天，用SC株攻击1~3组猪，静脉注射1个致死剂量；用ATCC35246株攻击4~6组猪，静脉注射1个致死剂量，观察14天后统计攻毒保护情况。第60天，用CVCC354株攻击7~9组猪，气管注射5ml/头，30天后统计肺病变。具体见表13。 

表13 

3结果： 

3.1SS2、SESZ攻毒保护结果见表14： 

表14 

组别>免疫疫苗>死亡率>保护率>1>疫苗L>1/5>4/5>2>疫苗H>0/5>5/5>3>PBS>5/5>_>4>疫苗L>1/5>4/5>5>疫苗H>0/5>5/5>6>PBS>5/5>_>

攻毒结果表明疫苗L、H对SC株、ATCC35246株攻击均有免疫保护作用，前者保护率均在80%以上，后者保护率为100%。研究结果表明，SS2、SESZ低剂量抗原组合疫苗和高剂量抗原组合疫苗均能产生良好的保护作用，且随着抗原含量的增加，保护效果增强。 

3.2Mhp攻毒保护结果如表15、16： 

表15 

表16 

组对组比较>P值>7对9>0.039>8对9><0.0001>7对8>0.433>10>0>

[0128] 所有接种组与对照组比较均显示统计学显著差异（P<0.05），组7比组8肺评分高，但差异不明显（P=0.433）。研究结果表明： 

Mhp-SS2-SESZ组合疫苗L和H均能明显减少Mhp引起的肺病变，具有良好的免疫保护作用。另外，随着疫苗中Mhp抗原含量的增加，保护效果会增强。 

4小结： 

实施例3研究表明，Mhp-SS2-SESZ组合疫苗在一定的抗原含量范围之内，均能产生对相应病原感染的保护作用，且抗原含量越大，保护作用越强。 

实施例4、本研究是为了评价Mhp-SS2-SESZ组合疫苗和Mhp单苗相比Mhp部分的免疫效力，以及在组合疫苗中有不同含量Mhp时的组合效力。 

1材料： 

实施例2制备疫苗： 

表17 

动物：4-5周龄，Mhp血清抗体均为阴性的猪 

攻毒菌株：Mhp CVCC354株（购自中国兽医药品监察所） 

2方法： 

选4-5周龄仔猪30头，随机分为6组，每组5头。第0天，对第 1~4组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4各2ml/头，第5组颈部肌肉注射无菌PBS 2ml/头，第6组作为空白对照，既不免疫也不攻毒，隔离饲养。第60天，分别用CVCC354株强毒攻击1-5组猪，气管内注射5ml/头，30天后统计肺病变。具体见下表。 

表18 

3结果： 

3.1攻毒保护结果如下表19、20： 

表19肺病变评分 

组别>平均肺病变评分>1>4.3>2>2.19>3>2.3>4>2.22>5>15.8>6>0>

表20肺评分成对测试结果 

组对组比较>P值>1对2>0.31>1对3>0.43>1对4>0.39>

[0149] 

1对5>0.028>2对5><0.0001>3对5><0.0001>4对5><0.0001>

所有接种组与对照组比较显示统计学显著差异（P<0.05），组2、组3、组4肺评分相当，组1比组2、组3、组4肺评分均要高，但差异不显著。研究结果令人意外：Mhp-SS2-SESZ组合疫苗比单苗更能减少Mhp引起的肺病变；而低含量Mhp抗原组合疫苗、中等含量Mhp抗原组合疫苗、高含量Mhp抗原组合疫苗产生的免疫效力相当，三者减少Mhp引起的肺病变程度相当。 

4小结： 

实施例4研究结果令人意外：实施例2制备的4种疫苗均能产生对Mhp的保护力，但Mhp-SS2-SESZ组合疫苗中Mhp部分免疫效力不仅仍存在，而且明显高于Mhp单苗；而低含量Mhp抗原组合疫苗、中等含量Mhp抗原组合疫苗、高含量Mhp抗原组合疫苗产生的免疫效力相当；表明三种抗原的混合增强了Mhp的免疫保护作用。这些可能是SS2、SESZ抗原对Mhp抗原的免疫效应产生了协同作用，而这种协同作用可能只会在一定抗原量比例下存在并维持在一定范围。 

所以，只需一次免疫该组合疫苗，即可超过免疫Mhp单苗的效果。实施例5、本研究是为了评价Mhp-SS2-SESZ组合疫苗和单苗相比，SS2-SESZ部分的免疫效力，以及在组合疫苗中有不同含量SS2-SESZ时的组合效力。 

1材料： 

实施例2制备疫苗： 

表21 

动物：4-5周龄，SS2、SESZ血清抗体均为阴性的猪 

攻毒菌株：SS2SC株、SESZ ATCC35246株（购自美国模式培养物集存库，即American type culture collection，ATCC） 

2方法： 

选4-5周龄仔猪40头，随机分为8组，每组5头。第0天，对第2、6组猪分别颈部肌肉注射疫苗7，2ml/头；第3、7组猪颈部肌注疫苗2，2ml/头；第1组猪颈部肌注疫苗5，2ml/头；第5组猪颈部肌注疫苗6，2ml/头；第4、8组猪颈部肌注无菌PBS，2ml/头。第28天，用SC株攻击1~4组猪，用ATCC35246株攻击5~8组猪，静脉注射一个致死剂量，观察14d后统计攻毒保护情况。具体见表22。 

表22 

3结果： 

攻毒保护结果见表23 

表23 

组别>免疫疫苗>死亡数/总数>保护数/总数>1>疫苗5>1/5>4/5>2>疫苗7>0/5>5/5>3>疫苗2>0/5>5/5>4>PBS>5/5>_>5>疫苗6>1/5>4/5>6>疫苗7>1/5>4/5>7>疫苗2>0/5>5/5>8>PBS>5/5>_>

攻毒结果表明疫苗2、疫苗5、疫苗7均对SC株的攻击有免疫保护作用，疫苗5保护率为80%，疫苗2、疫苗7为100%；而疫苗2、疫苗5、疫苗7均对ATCC35246株的攻击有免疫保护作用，疫苗6、疫苗7保护率为80%，疫苗2为100%。 

4小结： 

实施例5研究结果令人意外：组合疫苗对SS2或SESZ的保护力均与单苗相当或者更好。1/2×SS2抗原含量与1×SS2含量的组合疫苗均比单苗的保护效果好，而两者本身效果相当；1/2×SESZ抗原含量组合疫苗与单苗保护效果相当，而1×SESZ含量的组合疫苗效果最好。三种抗原的混合增强了SS2或SESZ的免疫效果，甚至在组合疫苗低抗原含量的情况下达到或超过单苗高抗原含量的免疫效果。这些结果表明，可能是Mhp抗原对SS2或SESZ抗原的免疫效应产生了协同作用，且这种协同作用可能会随着抗原量的增加而加强。 

所以，只需一次免疫该组合疫苗，即可超过分别免疫SS2或SESZ单苗的效果，不但简化了免疫程序，而且提高了免疫效果。 

实施例6、本研究是为了评价Mhp-SS2-SESZ组合疫苗和单苗在使用时对动物产生的副反应。 

1材料： 

实施例2制备疫苗： 

表24 

动物：4-5周龄健康仔猪 

2方法： 

用4-5周龄仔猪15头，随机分为3组，每组5头。第1组颈部肌肉注射疫苗2，2ml/头；第2组分别颈部肌肉注射疫苗1、5、6，每种疫苗2ml/头，共计注射6ml/头；第3组作为空白对照。接种后观察14d，记录猪只的副反应情况，具体见表25： 

表25 

动物分组>头数>免疫方式>疫苗编号>1>5>肌注2ml/头>疫苗2>2>5>肌注各2ml/头>疫苗1、5、6>3>5>_>_>

3结果： 

副反应情况见表26: 

表26 

试验结果表明，与未免疫对照相比，第1组猪仅有极个别出现精神沉郁症状；第2组猪应激反应大，半数以上出现体温升高、精神食欲下降，个别出现了站立不稳和呕吐。 

小结： 

实施例6研究结果表明，组合疫苗在临床使用时，只接种1次，注射剂量小，仅有极个别猪出现轻微反应，属于正常体征范围，安全性好；而单疫苗若要达到相同效力目的，需要3次接种，注射剂量大，猪只产生副反应大，严重影响其生产性能，安全性差。 

因此，本发明的二联疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应 

本发明针对现有技术的不足提供了一种含有猪肺炎支原体、猪链球菌病病原的疫苗组合物，该疫苗组合物免疫程序简单，能同时有效的防治猪支原体肺炎和猪链球菌病。同时，该疫苗组合物生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。