pH值依赖的三联吡啶钌重复结晶合成法及其应用

摘要

本发明公开一种pH值依赖的三联吡啶钌重复结晶合成法及其应用。本发明采用逐步降低pH值的结晶方法，使pH值由高到底降低，每降低pH值一个梯度就收集一次结晶，在整个降低过程中，三联吡啶钌结晶会源源不断的出现，直至pH降到最低。采用本发明的方法能大大提高产率，使三联吡啶钌的合成产率从70％左右提高到89%，产率提升约20%左右，产率显著提高。以此为基点，我们将合成的三联吡啶钌应用到核酸检测领域，并验证了其用于核酸检测领域的可行性。本发明的DNA探针性质稳定，便于修饰及储存，操作简单。该方法适用于核酸检测，也可作为免疫分析中抗体标记的方法，以提高灵敏度。

说明书

技术领域

本发明属于三联吡啶钌合成及核酸电化学检测技术领域，特别涉及一种pH 值依赖的三联吡啶钌重复结晶合成法及其应用。

背景技术

三联吡啶钌电化学发光(Electrochemiluminescence,简称ECL)具有原位响 应、检测灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点,在药物分析、氨基酸分析、 DNA探针分析、酶生物传感器领域得到了广泛应用。近年来，随着免疫分析与 三联吡啶钌技术相结合，使得电化学免疫分析日益成为分子诊断的重要手段， 并广泛的运用于临床分子诊断领域。因此，三联吡啶钌的需求量大大增加，然 而其价格居高不下，给免疫分析带来了较高的成本。因此，发展一种高产率的 三联吡啶钌合成方法具有重要意义。核酸电化学检测技术是重要的检测手段， 广泛运用于免疫诊断、病原微生物筛查及环境监控等领域。该方法以分子生物 学技术为检测基础（常利用核酸扩增技术）、以电化学发光原理为支撑，旨在于 构建高灵敏度、快速及可靠的检测方法。得益于电化学发光原理的优越性，该 方法具有较宽的检测范围、高灵敏度、反应体系可控及高信噪比等特点。

现有的三联吡啶钌合成方法，通常采用降低pH值至4.4的单步结晶的方法， 结晶完成时，其产率也只能达到70%左右。但反应溶液还有三联吡啶钌溶解其 中，不能很好的收集三联吡啶钌。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种pH值依 赖的三联吡啶钌重复结晶合成法。本发明采用逐步降低pH值的方法，使pH值 由高到底降低（从pH值为4一直降到1，设置4个梯度，每降低一个梯度，pH 值降低1），每降低pH值一个梯度就收集一次结晶，在整个降低过程中，三联 吡啶钌结晶会源源不断的出现，直至pH降到最低。

本发明的另一个目的在于提供上述方法在核酸检测领域上的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种pH值依赖的三联吡啶钌重复结 晶合成法，包括如下步骤：

①称取二氯双(2,2'-联吡啶)钌、NaHCO₃和4-羧酸-2,2'-联吡啶，混合；

②往步骤①得到的混合物中加入甲醇水溶液，得到混合液，混合液在硅油 浴下回流，收集溶液；

③将步骤②中所得溶液在冰浴（冰水混合物）中冷却2h；

④将pH值调到4.4，形成沉淀；

⑤将步骤④中形成的沉淀过滤，收集滤液；

⑥往步骤⑤中所得滤液中加入NaPF₆水溶液，搅拌后进行反应；

⑦将pH值调到4，冰浴2h，观察结晶形成；

⑧抽滤并收集晶体，并保留滤液；将所得晶体进行干燥；

⑨取步骤⑧中所得滤液，将pH值调到3，冰浴2h，观察结晶形成；抽滤并 收集晶体，并保留滤液；将所得晶体进行干燥；

⑩取步骤⑨中所得滤液，将pH值调到2，冰浴2h，观察结晶形成；抽滤并 收集晶体，并保留滤液；将所得晶体进行干燥；

1○1取步骤⑩中所得滤液，将pH值调到1，冰浴2h，观察结晶形成；抽滤并 收集晶体，将所得晶体进行干燥；

1○2将步骤⑧至1○1中所得晶体汇总，得到二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡 啶）钌的二（六氟磷酸盐）结晶。

步骤①中所述的二氯双(2,2'-联吡啶)钌、NaHCO₃和4-羧酸-2,2'-联吡啶的质 量比优选为4:4:3；

步骤①中所述的二氯双(2,2'-联吡啶)钌与步骤⑥中所述的NaPF₆的质量比优 选为2：25；

步骤②中所述的甲醇水溶液优选为体积分数80%的甲醇水溶液；

步骤②中所述的混合液中各成分的终浓度优选为二氯双(2,2'-联吡啶)钌20 g/L，NaHCO₃20g/L，4-羧酸-2,2'-联吡啶15g/L；

步骤②所述的回流的条件优选为80℃下回流加热10h；

步骤④、⑦、⑨、⑩和1○1中所述的pH值优选用1mol/L的H₂SO₄进行调节；

步骤⑤中所述的过滤优选为用滤纸过滤；

步骤⑥中所述的NaPF₆水溶液优选为将NaPF₆溶于水中得到，浓度为200 g/L；

步骤⑥中所述的反应优选为37℃反应四个小时；

步骤⑧、⑨、⑩和1○1中所述的干燥优选为用真空冷冻干燥机干燥，去除挥 发性物质甲醇及水；

所述的pH值依赖的三联吡啶钌重复结晶合成法在核酸检测领域上的应用， 包括如下步骤：

（1）通过上述方法合成二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌的二（六 氟磷酸盐）结晶；

（2）三联吡啶钌的活化：（称量是根据晶体量调整的）

①称取二环己基碳二亚胺（DCC）1.1635g和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 0.5947g；

②搅拌条件下溶解于7.7568mL二甲基甲酰胺（DMF）中，然后冰浴冷却 1h；

③加入0.1616g步骤（1）合成的二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌 的二（六氟磷酸盐），混合物冰浴搅拌混匀；

④室温下密封振荡；

⑤通过吸滤装置除去所得沉淀，滤液中含有活性的钌配合物，即活化三联 吡啶钌；

（3）三联吡啶钌DNA探针的制备

①取一管5端连六碳氨基探针（2.5OD）离心，使粘在管壁上的DNA落入 管底；

②打开管盖，并加入75μL0.1M、pH8.5的硼酸钠溶液，盖上管盖；上下振 荡5min，离心收集；

③加入30μL步骤（2）⑤中所得到的活化三联吡啶钌；室温避光孵育12 小时；

④加入1mL预冷无水乙醇（沉淀DNA），低温放置2小时；

⑤离心，倒去溶液，加入1mL预冷无水乙醇洗涤，低温放置1小时；

⑥离心，倒去溶液，加入1mL预冷80%（v/v）乙醇水溶液洗涤，低温放置 1小时；

⑦离心，倒去溶液，加入1mL预冷80%（v/v）乙醇水溶液洗涤，低温放置 1小时；

⑧离心，倒去溶液，加20μL水稀释，得到三联吡啶钌DNA探针，分成两 管；

（4）磁捕捉检测目标DNA序列：

本部分以传统的磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种三联吡啶钌 为信号放大基团的核酸检测方法；

（Ⅰ）取生物素探针、电化学探针，靶序列溶解于水中，终浓度为10μM；

（Ⅱ）构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100μL，生物素探针及电化 学探针的终浓度为100nM，PBS缓冲液的终浓度为1×PBS缓冲液，加水补充至 100μL；

（Ⅲ）信号检测：将步骤（Ⅱ）的产物，放入分析仪中检测电化学发光信 号。

步骤（2）④所述的振荡的条件优选为1500r/min振荡5h；

步骤（3）①和步骤（3）②中所述的离心的条件优选为12000r/min离心5min；

步骤（3）⑦、⑧、⑨、⑩中所述的离心的条件优选为4℃，12000rpm离心 20min；

步骤（3）③中所述的避光优选为用黑胶布或锡箔纸进行避光；

步骤（3）④、⑤、⑥和⑦中所述的低温优选为-86～-60℃；

步骤（4）中所述的生物素探针优选为DNA探针；

步骤（4）（Ⅲ）所述的分析仪优选为罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免 疫分析仪。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

（1）本发明采用pH值依赖的三联吡啶钌重复结晶合成方法合成三联吡啶 钌，能大大提高产率，使三联吡啶钌的合成产率从70％左右提高到89%，产率 提升约20%左右，产率显著提高。以此为基点，我们将合成的三联吡啶钌应用 到核酸检测领域，并验证了其用于核酸检测领域的可行性。

（2）本发明的发明人在实验过程中发现如果将pH值再调低，结晶又会出 现。因此，设计一种采用梯度pH值的结晶方法，多步结晶提高产率，以达到节 约合成成本。

（3）本发明最终可得到纯度高的活化钌。

（4）本发明的DNA探针性质稳定，便于修饰及储存，操作简单。

（5）适用于核酸检测：该实验原理可用于DNA及RNA的检测。

（6）本发明亦可作为免疫分析中抗体标记的方法，以提高灵敏度。

附图说明

图1是三联吡啶钌合成及其活化过程原理图。

图2是磁捕捉“sandwich”模型原理图。

图3是实施例1获得的三联吡啶钌的吸收光谱图。

图4是实施例1所得的活化三联吡啶钌的吸收光谱图。

图5是实施例1所得的活化三联吡啶钌的荧光光谱图。

图6是实施例1所得的三联吡啶钌结晶的粒径图。

图7是实施例2所得DNA探针标记三联吡啶钌前后的质谱图；其中图A为 DNA探针标记三联吡啶钌前的质谱图；其中图B为DNA探针标记三联吡啶钌 后的质谱图。

图8是实施例3中目标序列检测电化学发光强度图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1三联吡啶钌的合成及活化

（1）pH值依赖的三联吡啶钌重复结晶合成法

①称取：二氯双(2,2'-联吡啶)钌0.2g，NaHCO₃0.2g，4-羧酸-2,2'-联吡啶0.15 g；

②加入10mL体积分数80%甲醇水溶液，混合液在硅油浴下加热并回流12 小时，收集溶液；

③将步骤②中所得溶液在冰浴（冰水混合物）中冷却2h；

④用1mol/L的H₂SO₄将pH值调到4.4（精密pH试纸定标），形成沉淀；

⑤将步骤④中形成的沉淀用滤纸过滤，收集滤液；

⑥将步骤⑤中所得滤液中加入12.5mL NaPF₆水溶液（2.5g NaPF₆溶于12.5 mL水中），搅拌后置于37℃环境反应四个小时。

⑦用1mol/L的H₂SO₄将pH值调到4，冰浴两小时，观察结晶形成。

⑧抽滤并收集晶体，并保留滤液。所得晶体用真空冷冻干燥机干燥去除挥 发性物质甲醇及水。

⑨取步骤⑧中所得滤液，用1mol/L的H₂SO₄将pH值调到3，冰浴两小时， 观察结晶形成。抽滤并收集晶体，并保留滤液。所得晶体用真空冷冻干燥机干 燥。

⑩取步骤⑨中所得滤液，用1mol/L的H₂SO₄将pH值调到2，冰浴两小时， 观察结晶形成。抽滤并收集晶体，并保留滤液。所得晶体用真空冷冻干燥机干 燥。

1○1取步骤⑩中所得滤液，用1mol/L的H₂SO₄将pH值调到1，冰浴两小时， 观察结晶形成。抽滤并收集晶体。所得晶体用真空冷冻干燥机干燥。

1○2将步骤⑧至1○1中所得晶体汇总，得到二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡 啶）钌的（六氟磷酸盐）晶体并称量，计算产率。二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'- 联吡啶）钌的（六氟磷酸盐）晶体的产率达到理论值的89%（质量百分比）。

取部分所得结晶溶解于水后测量吸收光谱，所得实验结果如图3所示。在 480nm处有明显的吸收峰。

（2）三联吡啶钌的活化：（称量是根据晶体量调整的）

①称取：二环己基碳二亚胺（DCC）1.1635g，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 0.5947g；

②搅拌条件下溶解于7.7568mL二甲基甲酰胺（DMF）中，然后冰浴冷却 1h；

③加入0.1616g步骤（1）合成的二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌 的六氟磷酸盐晶体，混合物冰浴搅拌混匀；

④室温下密封振荡；

⑤通过吸滤装置除去所得沉淀，滤液中含有活性的钌配合物，即活化三联 吡啶钌，密封并做防水处理，保存于-20℃。

将所得活化三联吡啶钌用吸收光谱去表征质量的好坏；活化三联吡啶钌在 480nm处具有明显的吸收峰，实验结果如图4所示。并用480nm激发测量其荧 光光谱，所得实验结果如图5所示。所得结晶用纳米粒度仪测量了其晶体直径， 实验结果如图6所示。

实施例2三联吡啶钌DNA探针的制备

①取一管5端连六碳氨基探针（2.5OD）（购自上海生工生物工程有限公司） 离心5分钟，使粘在管壁上的DNA落入管底。

②轻轻的打开管盖，并迅速加入75μL0.1M硼酸钠（pH8.5），立即盖上管 盖。充分上下振荡5min，离心收集。

③加入30μL的实施例1中步骤（2）⑤获得的活化三联吡啶钌。缠上黑胶 布，置离心管架上避光孵育12小时。

④往上述管中各加入1mL预冷无水乙醇（沉淀DNA），放入超低温冰箱中 2小时。

⑤离心，12000rpm，4℃，20min。倒去橙色溶液，加入1mL预冷无水乙醇 洗涤，放入超低温冰箱中1小时。

⑥离心，12000rpm，4℃，20min。倒去浅黄色溶液，加入1mL预冷80%（v/v） 乙醇水溶液洗涤，放入超低温冰箱中1小时。

⑦离心，12000rpm，4℃，20min。倒去溶液，加入1mL预冷80%（v/v）乙 醇水溶液洗涤，放入超低温冰箱中1小时。

⑧离心，12000rpm，4℃，20min，倒去溶液。加20μL水稀释，由于损失比 较大分成两管进行下面的实验。DNA标记前及标记后的质谱图如图7A、B所示。

实施例3磁捕捉检测目标DNA序列：

本部分以传统的磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种三联吡啶钌 为信号放大基团的核酸检测方法（原理图如图2所示）。该方法包含有两种探针， 生物素探针及电化学探针，生物素探针用于捕捉目标序列并可连接到磁珠上， 实现磁捕捉，5′端标记有生物素，其序列为： 5′-Biotin-TTTTTGGAGCACCCACGTGTCCTGGCC-3′；电化学探针用于标记三 联吡啶钌并作为电化学信号给出探针，3′端标记有氨基（用于DNA与三联吡啶 钌的羧基连接），其序列为：5′-GCTCAGTTTACTAGTGCCATTT-NH2-3′。核酸 靶序列为：5′-ACTAGTAAACTGAGCATACTGGCCAGGACACGTGGGTGC-3′， 该序列是乙肝病毒的pre-s基因的部分序列。

（Ⅰ）取生物素探针、靶序列溶解于水中，终浓度为10μM。

（Ⅱ）构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100μL，生物素探针及电化 学探针的终浓度为100nM，PBS缓冲液的终浓度为1×PBS缓冲液（即用0.1M 的PBS配制），加水补充至100μL。

（Ⅲ）信号检测：将步骤（Ⅱ）的产物，放入罗氏Elecsys2010电化学发光 全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。实验结果如图8所示。 结果显示，以三联吡啶钌为信号基团，电化学发光信号明显增强。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。