一种基于纳米纤维支架的人体黑素细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种基于纳米纤维支架的人体黑素细胞的培养方法，本发明利用组织工程技术构建具有良好生物相容性的纳米纤维支架，进行了黑素细胞或其与成纤维细胞、角质形成细胞的（共）培养和转移，适用于色素脱失症（如白癜风）和皮肤颜色的调节。本发明涉及纳米纤维支架的制备、细胞-纳米纤维支架复合材料的构建。由于纳米纤维支架中存在多孔结构，促进了细胞培养及活性的保持。

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域，尤其涉及一种基于生物材料的纳米纤维支架的黑素细胞培养方法。 

发明背景

白癜风是一种获得性皮肤色素脱失性疾病, 表现为局部或泛发性色素脱失，以形成白斑为特征，组织学及免疫细胞化学显示其皮损表皮黑素细胞消失。白癜风在人群中发病率达到0.5-2%，白斑处因缺乏黑色素，容易被阳光灼伤甚至引发癌变，同时也会给患者带来社交忧虑引起心理疾病。传统的治疗手段包括内服药物、紫外线照射以及外科手术治疗等。但药物治疗和紫外线照射的治愈率有限。外科手术治疗方法主要包括自体表皮移植、黑素细胞悬液移植等，这些治疗方法证实是有效的，但表皮移植需大面积取皮，而细胞悬液移植中细胞悬液易流失，影响疗效，且不适合大面积移植。构建生物相容性支架，将黑素细胞培养在支架上形成细胞皮片达到培养和转移一体化，能有效改善悬液移植疗法的不足之处。

利用组织工程技术、通过细胞负载与转移，为治疗白癜风提供新的途径。CN 1919352A公开了一种含壳聚糖的纳米纤维组织修复支架，但支架的机械强度低。CN 1952227A公开了以一种用于仿生细胞外基质的明胶-壳聚糖纤维支架，支架浸泡后其结构易受损。CN 101445971A公开了一种仿细胞外基质的丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维支架，丝素蛋白的引入可能引发细胞的免疫性反应。CN 103194856A公开了一种具有抗菌作用的壳聚糖-丝胶纳米纤维，用作伤口敷料。现有公开的纳米纤维支架专利主要用于组织工程的修复，尚无用于人体黑素细胞培养的公开报道。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于纳米纤维支架的黑素细胞的培养方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于纳米纤维支架的黑素细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）制备生物材料的纳米纤维支架：将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后溶解于溶剂中，配成重量百分比为1-10%的溶液，通过静电纺丝，制备得到厚度为30-200微米的纳米纤维支架，在真空、20-50oC下烘2-48小时；然后用交联剂对纳米纤维支架在20-50oC交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；然后用氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时，再用去离子水清洗至溶液pH为中性，所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中，氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成，且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1；再在鼓风条件下于30-120oC下烘2-48小时。

（2）构建细胞-纳米纤维支架复合材料：纳米纤维支架用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以 个细胞/cm²的密度接种在孵化过的纳米纤维支架上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-纳米纤维支架的复合材料。 

所述溶剂包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜等及其与二氯甲烷的混合溶剂，混合溶剂的重量比为5:1-1:1。 

所述静电纺丝条件：电压为5-30KV、推进速率为0.1-10ml/h、接收距离为5-30cm、温度为10-50 oC。 

所述细胞培养液含100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、 10-50000微克IBMX、0.1-100毫升Glutamine和100-500000微克Gentamicin等成分。 

本发明的有益效果是：通过对所得的生物相容性纳米纤维支架材料（图1）进行表征，具有多孔结构（图2），适合细胞生长。同时具有良好的机械性能，在制备、负载、转移和移植过程不发生破碎和断裂，符合转移和移植的要求。细胞-纳米纤维支架复合材料的构建过程中，细胞在生物相容性纳米纤维支架材料上的形态良好，多孔的纳米纤维结构益于培养液的更新，从而促进了细胞的增殖，使细胞保持良好的活性（图3）。 

附图说明

图1纳米纤维支架； 

图2纳米纤维支架SEM扫描电镜照片；

图3黑素细胞在纳米纤维支架上生长形态图。

具体实施方式

本发明属生物医学领域，利用组织工程技术构建具有良好生物相容性纳米纤维支架材料，用于黑素细胞或其与成纤维细胞、角质形成细胞的（共）培养，实现细胞的体外培养及移植。具体涉及具有生物相容性纳米纤维支架材料的制备、细胞-纳米纤维支架复合材料的构建及其应用，满足色素脱失症（如白癜风）和皮肤颜色调节的要求。 

本发明选用生物相容性良好的材料，纳米纤维支架材料制备条件温和，多孔的纳米纤维结构益于培养液的更新，从而促进了细胞的增殖，使细胞保持良好的活性生物安全。经交联处理的纳米纤维支架材料，具有优越的机械性能，满足可直接从细胞培养板中取出用于细胞转移和移植的要求。此外，本发明通过调节细胞的接种密度、培养时间和培养方法，保持细胞活性，实现对不同个体皮肤颜色的调控，使黑素细胞的功效性在移植中得到成功的表达，具有实际的可操作性，为大面积色素脱失症和皮肤颜色的调节提供了极大的便利。 

本发明的一种基于纳米纤维支架的细胞培养方法，包括以下步骤： 

（1）制备生物材料的纳米纤维支架：将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后溶解于溶剂中，配成重量百分比为1-10%的溶液，通过静电纺丝，制备得到厚度为30-200微米的纳米纤维支架，在真空、20-50oC下烘2-48小时；然后用交联剂对纳米纤维支架在20-50oC交联处理0.5-24小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；然后用氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时，再用去离子水清洗至溶液pH为中性，所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中，氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成，且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1；再在鼓风条件下于30-120oC下烘2-48小时。

（2）构建细胞-纳米纤维支架复合材料：纳米纤维支架用于接种细胞前，用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时，随后再用PBS洗净残留酒精，并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后，在细胞培养板里注入细胞培养液，置于细胞培养箱中于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以个细胞/cm²的密度接种在孵化过的纳米纤维支架上，同时加入1-10毫升的细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度条件下培养，每两天更换一次细胞培养液，培养时间为1-10天，即获得细胞-纳米纤维支架的复合材料。 

溶剂包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜等及其与二氯甲烷的混合溶剂，混合溶剂的重量比为5:1-1:1。 

静电纺丝条件：电压为5-30KV、推进速率为0.1-10ml/h、接收距离为5-30cm、温度为10-50 oC。 

细胞培养液含100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、 10-50000微克IBMX、0.1-100毫升Glutamine和100-500000微克Gentamicin等成分。 

下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。 

实施例1. 壳聚糖纳米纤维支架材料的制备 

a、将壳聚糖用三氟乙酸/二氯甲烷重量比3:1混合溶剂溶解，配成浓度为5 %的壳聚糖溶液；

b、在电压为15KV、推进速率为1ml/h、接收距离为15cm、温度为20oC条件下进行静电纺丝；

c、将壳聚糖纳米纤维支架在真空、50oC下烘12小时；

d、20oC下，壳聚糖纳米纤维支架用硫酸钠交联2小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂；

e、用质量分数为4%的NaOH溶液浸泡壳聚糖纳米纤维支架24小时，再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4；

f、将壳聚糖纳米纤维支架置于鼓风烘箱中，50oC条件下干燥24小时；

g、得到可用于细胞培养的壳聚糖纳米纤维支架材料。

实施例2. 壳聚糖-明胶纳米纤维支架材料的制备 

a、将壳聚糖-明胶（重量配比10:1）用三氟乙醇/二氯甲烷（重量配比2:1）混合溶剂溶解，配成浓度为4%的壳聚糖-明胶溶液；

b、在电压为20KV、推进速率为3ml/h、接收距离为18cm、温度为30oC条件下进行静电纺丝；

c、将壳聚糖-明胶纳米纤维支架在真空、25oC下烘24小时；

d、20oC下，壳聚糖-明胶纳米纤维支架用柠檬酸钠交联12小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂； 

e、用质量分数8%的Na₂CO₃溶液浸泡壳聚糖-明胶纳米纤维支架24小时，再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4；

f、将壳聚糖-明胶纳米纤维支架置于鼓风烘箱中，50oC条件下干燥24小时；

g、得到可用于细胞培养的壳聚糖-明胶纳米纤维支架材料。

实施例3. 壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架材料的制备 

a、将壳聚糖-聚乙二醇（重量配比5:1）用二甲基亚砜溶解，配成浓度为6%的壳聚糖-聚乙二醇溶液；

b、在电压为25KV、推进速率为3ml/h、接收距离为12cm、温度为40oC条件下进行静电纺丝；

c、将壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架在真空、25oC下烘24小时；

d、50oC下，壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架用戊二醛交联12小时，交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂； 

e、用质量分数为6%的NaOH/Na₂CO₃(重量比1：1)溶液浸泡壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架24小时，再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4；

f、将壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架置于鼓风烘箱中，50oC条件下干燥24小时；

g、得到可用于细胞培养的壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架材料。

实施例4. 黑素细胞-壳聚糖纳米纤维支架复合材料的构建 

a、将实例1所述的壳聚糖纳米纤维支架置于体积分数为75%的酒精中浸泡12小时后用PBS冲洗干净；

b、将覆盖壳聚糖纳米纤维支架的细胞培养板置于紫外灯下照射12小时；

c、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度下孵化4小时；

d、将黑素细胞以个细胞/cm²的密度接种在壳聚糖纳米纤维支架上，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度下培养；

e、每两天换一次细胞培养液，培养时间为6天；

f、得到黑素细胞-壳聚糖纳米纤维支架复合材料，可进一步用于的移植。

实施例5. 黑素细胞/成纤维细胞-壳聚糖-明胶纳米纤维复合材料的构建 

a、将实例2所述的壳聚糖-明胶纳米纤维支架置于体积分数为75%的酒精中浸泡12小时后用PBS冲洗干净；

b、将覆盖壳聚糖-明胶纳米纤维支架的细胞培养板置于紫外灯下照射12小时；

c、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度下孵化4小时；

d、将黑素细胞和成纤维细胞以比例为1:2，密度为个细胞/cm²接种在壳聚糖-明胶纳米纤维支架上，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度下培养；

e、每两天换一次细胞培养液，培养时间为1-10天；

f、黑素细胞和成纤维细胞-壳聚糖-明胶纳米纤维复合材料，可进一步用于的移植。

实施例6. 黑素细胞/成纤维细胞/角质形成细胞-壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架复合材料的构建 

a、将实例3所述的壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架置于体积分数为75%的酒精中浸泡12小时后用PBS冲洗干净；

b、将覆盖壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架的细胞培养板置于紫外灯下照射12小时；

c、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度下孵化4小时；

d、将黑素细胞、成纤维细胞、角质形成细胞比例以1:2:1，密度为个细胞/cm²接种在壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架上，置于细胞培养箱于37oC、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度下培养；

e、每两天换一次细胞培养液，培养时间为6天；

f、黑素细胞/成纤维细胞/角质形成细胞-壳聚糖-聚乙二醇纳米纤维支架复合材料，可进一步用于的移植。

本发明利用组织工程技术实现黑素细胞或其与成纤维细胞和角质形成细胞的体外培养、负载及移植。通过将细胞-纳米纤维支架复合材料移植到脱色皮肤创口处，使黑素细胞或其与成纤维细胞和角质形成细胞由载体材料迁移到皮肤创口处，为脱色处皮肤提供黑素细胞，从而实现色素脱失症（如白癜风）和皮肤颜色的调节。