一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂

摘要

本发明提供一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂。本发明的幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂，其活性成分是一条多肽链，主要是由鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic的D0和D1区与幽门螺杆菌鞭毛蛋白FlaA的D2和D3区构成。该蛋白佐剂的核苷酸序列是由PCR技术合成的，并利用表达载体在大肠杆菌中表达，经蛋白纯化后，得到该佐剂蛋白。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种幽门螺杆菌(Hp)多表位疫苗的新型嵌合鞭 毛蛋白的设计、构建和制备方法。

背景技术

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要组成蛋白，根据鞭毛蛋白基因结构与功能将鞭毛蛋白分为四 个区域，即高度保守的N-末端和C-末端(D0，D1区)和高度变异的中间部分(D2，D3区)， 这些复杂的表面复合物与细菌运动有关，同时也与诱导特异性免疫应答相关联。机体对外来 抗原物质如对病原微生物的识别是由细胞的特定受体介导的。目前已证实，这一识别主要是 通过细胞表面的Toll样受体(Toll-like receptor，TLRs)家族分子来实现的。TLRs可识别病原 微生物高度保守的结构基序，即所谓的病原相关分子模式(pathogen associated molecular  patterns，PAMPs)，并诱导产生天然免疫应答。特定的TLRs可以识别相应的PAMPs，其中鞭 毛蛋白高度保守的D0，D1区能以配体受体识别的方式激活表达TLR5受体的APC，如树突 状细胞(DC)，巨噬细胞以及肠上皮细胞，诱导分泌前炎性因子及细胞因子，进而介导激活T 细胞和B细胞应答；而高度变异的D2，D3区的抗原性能刺激机体产生特异性的免疫反应； 细菌鞭毛蛋白作为佐剂不仅可使机体产生特异性的体液和细胞免疫，越来越多的研究显示鞭 毛蛋白还能通过TLR5受体调节黏膜免疫反应。细菌鞭毛蛋白与TLR5受体结合后，主要是 通过髓样分化因子MyD88激活白介素受体相关激酶(IRAK4)和肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)，TRAF6被磷酸纤维素化后，诱导转化因子β活化激酶1(TAK1)和促分裂原活化 蛋白酶MKK6，激活下游的NF-κB、JNK和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38信号通路， 诱导促炎细胞因子如IL-6、IL-12及TNF-α等基因的表达。目前，鞭毛蛋白已作为一种有效 的免疫佐剂用于各类疫苗的研究中，如尿道致病性大肠埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli， UPEC)，抗鼠疫(耶尔森氏)杆菌(Yersinia Pestis)、疟原虫(Plasmodium falciparum)、破伤风 梭菌(Clostridium tetani)、西尼罗病毒(West Nile viruses)等疫苗的研究。

Hp中的鞭毛蛋白在Hp的定植过程中起着至关重要的作用，能够通过摆动提供动力，帮 助Hp穿过黏液层，到达胃上皮表面适合其生存的微氧环境，是影响Hp定植及感染持续存在 的重要因素。但是，由于Hp鞭毛蛋白因其结构特殊性，虽然能引发机体产生特异性的抗体 反应，却不能被APC上的TLR5识别，刺激机体产生有效的黏膜免疫应答，从而逃避了机体 的免疫监督形成持续感染。

如何解决Hp鞭毛蛋白不能有效调节黏膜免疫的问题以及能否改造Hp鞭毛蛋白使其做为 Hp疫苗的生物佐剂，使其既能刺激机体产生体液和细胞免疫，又能调节黏膜免疫反应，有效 清除Hp胃黏膜感染，抑制Hp胃部定植，增强疫苗治疗Hp感染的效果，成为Hp疫苗研究 的一个新的思路。根据国内外研究报道，鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic高度保守的D0，D1区 能以配体受体识别的方式激活TLR5，调控TNF-α、IL-6和IL-12等促炎细胞因子的合成，具 有很好的免疫佐剂功效，已经应用于流感疫苗、鸡瘟疫苗等病原体疫苗研究中，其中与Flic 融合表达的两个流感病毒疫苗已经进入II期临床实验

本发明的思路如下：依据鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic和Hp鞭毛蛋白FlaA的结构特点和 免疫学效果，通过生物信息学软件分析，选择了能特异性激活TLR-5的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋 白Flic的D0和D1区域与Hp鞭毛蛋白FlaA的D2，D3区域，设计出了一种Hp多表位疫苗 的嵌合鞭毛蛋白佐剂CF，该嵌合鞭毛蛋白佐剂结构新颖，功能独特。通过密码子优化、基因 合成和基因克隆等技术，成功构建了CF，通过原核表达和蛋白纯化等技术，获得了纯化蛋白 CF。

发明内容

本发明的第一个方面是提供了一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂。

本发明的第二个方面是提供了该幽门螺杆菌多表位疫苗的嵌合鞭毛蛋白的制备方法。

本发明的第一个方面是提供了一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂CF。 该嵌合鞭毛蛋白CF主要由鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic的D0和D1区域与Hp鞭毛蛋白FlaA 的D2和D3区域嵌合构成，具有以下优点：(1)鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic高度保守的D0 和D1区能以配体受体识别的方式激活表达TLR5受体的APC，如树突状细胞(DC)，巨噬 细胞以及肠上皮细胞，诱导分泌前炎性因子及细胞因子，进而介导激活T细胞和B细胞应答。 (2)天然的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic可以激活TLR5介导的黏膜免疫应答，但不能产生针 对Hp鞭毛蛋白FlaA的特异性抗体。本发明的嵌合鞭毛蛋白CF既保留鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋 白Flic可以刺激TLR5能力，又可以激发针对Hp鞭毛蛋白FlaA的特异性抗体。

本发明的第二个方面是提供了幽门螺杆菌多表位疫苗的嵌合鞭毛蛋白CF的制备方法，其 技术路线简述如下：

(1)嵌合鞭毛蛋白CF分子的结构设计

在GenBank数据库中查找幽门螺杆菌26695鞭毛蛋白FlaA的D2、D3区域的核苷酸序 列以及肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白Flic(GenBank：AEO27871.1)的D0、D1区的核苷酸序列， 通过生物信息学软件对Flic的D0区、D1区与FlaA的D2-D3的间隔序列，加以分析和确定， 设计一个具有科学合理结构的嵌合鞭毛蛋白。

(2)重组表达质粒pETCF(含有嵌合基因CF)的构建

将所设计的嵌合鞭毛蛋白CF的基因序列送至基因合成公司进行密码子的优化并合成，利 用基因克隆技术将CF基因克隆至pET28a载体中，构建重组表达载体pETCF。

(3)嵌合鞭毛蛋白CF的原核表达及纯化

将重组表达载体pETCF转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株 BL21(DE3)/pETCF。利用IPTG诱导表达，并通过HisTrap^TM FF crude镍离子亲和层析和DEAE Sepharose FF阴离子交换层析能够获得高纯度嵌合鞭毛蛋白CF。

附图说明

图1：嵌合鞭毛蛋白CF的分子结构设计特点。

图2：重组表达载体pETCF的质粒图谱。

Nco I和Xho I之间为插入的嵌合基因CF；

图3：嵌合鞭毛蛋白CF的原核蛋白表达。

1：未加IPTG诱导的pET28a空载；2：加IPTG诱导的pET28a空载；3：未加IPTG诱 导的pETCF；4：加IPTG诱导的pETCF；

图4：嵌合鞭毛蛋白CF的HisTrap^TM FF crude镍离子亲和层析纯化。

1-6：20mM咪洗脱下的杂蛋白和部分目的蛋白；7-11：30mM咪唑洗脱的目的蛋白CF； 12-16：40mM咪唑洗脱下的部分目的蛋白CF和杂志蛋白；17-22：50mM咪洗脱下的杂蛋 白；23-27：500mM咪洗脱下的杂蛋白；

具体实施方式

材料

1.IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml无菌水，充分混匀溶解后， 定容至50ml。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2.卡那霉素(Kan)贮液(50mg/mL)：称取50mg卡那霉素(Kan)溶于1mL无菌水， 制得浓度为50mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱 中。

3.培养基：(1)LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl，加蒸馏 水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。(2)LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB 培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4.DNA电泳缓冲液(50x TAE)：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1ml冰乙 酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。

5.SDS-PAGE电泳缓冲液(5X)：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS5.0g；加入约 800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着 壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6.考马斯亮蓝蛋白染色试剂：(1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用)：考马斯亮 蓝G-250100mg溶解在50ml95％乙醇中，然后加入86％磷酸100ml，用蒸馏水稀释至1000ml。 (2)考马斯亮蓝R-250染液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中。(3)固定液： 500ml乙醇、100ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。(4)脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸 用蒸馏水稀释至1000ml。(5)保存液：25ml87％甘油溶于225ml脱色液中。

实例1：新型嵌合鞭毛蛋白CF的分子结构设计

在GenBank数据库中查找鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flic(GenBank：AEO27871.1)的D0、 D1区的核苷酸序列和幽门螺杆菌26695鞭毛蛋白FlaA的D2、D3区的核苷酸序列，其中Flic 的D0区对应的的核苷酸序列为1～426，Flic的D1区对应的的核苷酸序列为1255～1515，FlaA 的D2-D3区对应的核苷酸序列为559～909。

经过生物信息学软件DNAstar分析，间隔序列(GGGGS)易形成转角和β-折叠，不易形 成α-螺旋，为柔性结构，能有效间隔开Flic/D0、FlaA/D2-D3和Flic/D1，有利于幽门螺杆菌 鞭毛蛋白FlaA抗原表位的有效呈递且表现出较高的复性效率。

结果：嵌合鞭毛蛋白CF的分子结构设计特点和思路如图1所示。

实例2：重组表达载体pETCF(含有嵌合基因CF)的构建

将所设计的嵌合鞭毛蛋白CF的基因序列送交南京思普金生物有限公司进行密码子的优 化并全基因合成，并克隆至pET28a中。

结果：思普金生物有限公司采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序，证明PCR 合成的pETCF中嵌合基因CF的核苷酸序列完全正确，且无移码突变。重组表达载体pETCF 的质粒图谱如(图2)所示。

实例3：嵌合鞭毛蛋白的原核表达

将思普金生物有限公司合成的重组质粒pETCF转化进E.coli BL21(DE3)菌株中。在预先制 备好的含50μg/mL Kan的LB平板上，接种环划线基因工程菌株BL21(DE3)/pETCF，倒置 于37℃培养箱，过夜培养12～16h后，挑取单个菌落，接种于含50μg/mL Kan的LB培 养基中，37℃，180rpm，培养12～16h。送至思普金生物有限公司进行序列测定。

将测序正确的菌种以2％接种量接种于含50μg/mL Kan LB培养基中，37℃，180rpm振荡 过夜，次日晨再将该菌液以1％接种量接种于含50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃， 180rpm摇瓶3h(OD值在0.6～0.8)，加入IPTG使终浓度达到0.5mmol/L，16℃，180rpm 诱导表达，以空载体菌BL21(DE3)/pET28a作为阴性对照。

结果：将基因工程重组菌株BL21(DE3)/pETCF在PH值为7、IPTG浓度为0.5mmol/L、 诱导温度18℃、诱导时间为10h的情况下进行诱导表达。与对照菌株对比，基因工程重组菌 株BL21(DE3)/pETCF在约33KD处出现目的蛋白条带，与嵌合鞭毛蛋白CF的理论大小相符 合(图3)。嵌合鞭毛蛋白在可溶性蛋白和包涵体蛋白中都有存在。

实例4：嵌合鞭毛蛋白CF的纯化

(1)HisTrap^TM FF crude镍离子亲和层析柱的纯化

向装填好的HisTrap^TM FF crude柱中加入适量的去离子水将乙醇冲洗干净后，加入8倍 柱体积的Binding buffer平衡，平衡结束后即可上样。收集菌体后，每100mg菌体加入1-5ml Binding Buffer，超声裂解菌体。将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时；使用15 倍柱体积的Wash buffer冲洗柱子，收集流穿峰；使用5倍柱体积的Elution Buffer洗脱，收 集洗脱峰；依次使用3倍柱体积的Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤后，用3倍 柱体积的20％乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，4℃保存。

结果：经HisTrap^TM FF crude镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行 SDS-PAGE分析，可以发现嵌合鞭毛蛋白CF集中在30mM咪唑洗脱产生的蛋白峰(图4)。

(2)阴离子交换层析(Sepharose FF)的纯化

Sepharose FF阴离子交换层析方法：用离子交换层析缓冲液A平衡DEAE Sepharose FF 离子交换层析柱。将经过HisTrap^TM FF crude亲和层析一级纯化后的蛋白样品以10ml/min流 速上样DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱；用离子交换层析缓冲液B洗脱蛋白；洗脱方 式：连续梯度洗脱40min，收集目的蛋白峰。

结果：经Sepharose FF阴离子交换层析纯化，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析， 嵌合鞭毛蛋白CF主要集中在用0.5MNaCl的磷酸盐缓冲溶液洗脱下的蛋白峰中。