负向调控I型干扰素通路的miRNA分子及其应用

摘要

本发明涉及负向调控I型干扰素通路的miRNA分子及其应用。首次发现和证明了小核糖核酸Hsa-miR-127-3p与系统性红斑狼疮密切相关。本发明人还进一步验证了所述miRNA的作用靶通路，发现Hsa-miR-127-3p可抑制I型干扰素通路，从而可用于防治I型干扰素通路异常活化相关疾病。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域；更具体地，本发明涉及负向调控I型干扰素通路的miRNA分子及其应用。

背景技术

Ι型干扰素，是一类具有抗病毒、抗细菌感染和免疫调节功能的细胞因子，在先天免疫和适应免疫发挥着重要作用[Theofilopoulos,A.N.,R.Baccala,et al.Type I Interferons(α/β)in Immunity and Autoimmunity.Annual Review ofImmunology.2005.23(1):307-335]。近来研究发现，在自身免疫疾病系统性红斑狼疮中，Ι型干扰素通路是异常活化的，活化的Ι型干扰素通路可以激活自身反应的T细胞、DC细胞和B细胞等，从而促进自身免疫反应，加重系统红斑狼疮病情[Virginia Pascual,Jacques Banchereau.Systemic Lupus Erythematosusand Type I interferon.Nature Immunology；L Type I Interferon inSystemic Lupus Erythematosus.Arthritis&Rheumatism.2006]。

miRNA是一类19-22nt长的不编码蛋白质的单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，主要对靶基因起负调控作用。它通过核酸序列互补结合到靶mRNA的3’UTR区来抑制翻译或促进靶mRNA的降解。随着研究的深入，人们发现miRNA在不同的生物学过程中都发挥着重要的作用。已有的研究表明，在免疫系统中，miRNA参与了包括造血细胞的分化、免疫细胞内的信号传导、免疫细胞抗病毒功能的发挥等一系列免疫学过程。

但是，关于miRNA在Ι型干扰素通路中的功能研究工作却是甚少。因此，该方向的深入研究是本领域亟需进行的，从而为相关疾病的预防、诊断和治疗提供新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供负向调控I型干扰素通路的miRNA分子及其应用。

在本发明的第一方面，提供Hsa-miR-127-3p、其类似物、前体、上调剂或它们的变异体的用途，用于制备预防、缓解或治疗I型干扰素通路异常活化相关疾病的组合物。

在一个优选例中，所述的I型干扰素通路异常活化相关疾病包括(但不限于)：系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、干燥综合症、肌炎、系统性硬皮病、风湿性关节炎、HIV相关认知障碍、脑炎或Aicardi-Goutières综合症。

在另一优选例中，所述的I型干扰素通路异常活化相关疾病为系统性红斑狼疮。

在另一优选例中，所述的Hsa-miR-127-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的Hsa-miR-127-3p的前体的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

在另一优选例中，所述的Hsa-miR-127-3p的变异体是5’端第2-7位碱基为CGGAUC，第8位之后一个或多个(如1-5个；较佳地1-3个；更佳地1-2个)碱基被替换的变异体。

在另一优选例中，所述的组合物：用于抑制I型干扰素诱导的下游基因表达；较佳地，所述下游基因包括：CCL2、CXCL10或IFIT3；或用于抑制STAT1和STAT2磷酸化。

在另一优选例中，所述的Hsa-miR-127-3p的类似物包括(但不限于)：Hsa-miR-127-3p成熟体模拟物(mimics)或Agomir-127-3p。

在本发明的另一方面，提供Hsa-miR-127-3p的用途，用于作为筛选预防、缓解或治疗I型干扰素通路异常活化相关疾病的潜在物质的靶标；或用于筛选预防、缓解或治疗I型干扰素通路异常活化相关疾病的物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、缓解或治疗I型干扰素通路异常活化相关疾病的潜在物质的方法，所述方法包括步骤：

(a)将候选物质与表达Hsa-miR-127-3p的体系接触；

(b)观察候选物质对于Hsa-miR-127-3p的表达的影响；

其中，若所述候选物质可提高Hsa-miR-127-3p的表达，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗I型干扰素通路异常活化相关疾病的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达Hsa-miR-127-3p的体系中；和/或

步骤(b)包括：检测测试组的体系中Hsa-miR-127-3p的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达Hsa-miR-127-3p的体系；

如果测试组Hsa-miR-127-3p的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，更优选高40%，进一步优选高60%或更高)对照组，就表明该候选物是预防、缓解或治疗I型干扰素通路异常活化相关疾病的物质。

在另一优选例中，所述的体系包括：细胞体系，亚细胞体系，动物体系，组织体系。较佳地，为细胞体系。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、Hsa-miR-127-3p mimics(mir-127-IFN1000)对于Type I IFN诱导的ISRE-荧光素酶活性的影响，以阴性对照mimics作为对照(NC-IFN1000)。

图1B、Hsa-miR-127-3p mimics(mir-127-IFN1000)对于Type I IFN诱导的GAS-荧光素酶活性的影响，以NC-IFN1000作为对照。

图1C、Hsa-miR-127-3p mimics(miR-127)以及hsa-miR-127-3p seed mut1（seed mut1）和hsa-miR-127-3p seed mut2（seed mut2）对于Type I IFN诱导的ISRE-荧光素酶活性的影响，以阴性对照mimics作为对照(NC)。

图2A、RT-PCR检测Hsa-miR-127-3p mimics对于Type I IFN诱导的下游基因表达如CCL2、CXCL10和IFIT3的mRNA表达的影响。以NC-IFN1000作为对照。

图2B、Elisa检测Hsa-miR-127-3p mimics对于Type I IFN诱导的下游基因表达如CCL2、CXCL10的蛋白表达的影响。以NC-IFN1000作为对照。

图3A、Western Blot检测Hsa-miR-127-3p对于Hela细胞内STAT1磷酸化以及蛋白表达的影响。以NC-IFN1000作为对照。

图3B、Western Blot检测Hsa-miR-127-3p对于Hela细胞内STAT2磷酸化以及蛋白表达的影响。以NC-IFN1000作为对照。

图4A、PBS缓冲液对照组的肺组织H&E染色切片。

图4B、miR-127类似物实验组的肺组织H&E染色切片。

图4C、PBS缓冲液对照组、miR-127类似物实验组的肺出血的发生率。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次发现和证明了小核糖核酸(miRNA)Hsa-miR-127-3p与系统性红斑狼疮(SLE)密切相关。本发明人还进一步验证了所述miRNA的作用靶通路。并且，本发明人还发现Hsa-miR-127-3p可抑制I型干扰素通路，从而可用于防治I型干扰素通路异常活化相关疾病(如系统性红斑狼疮)。在此基础上完成了本发明。

本发明人发现，一种小核糖核酸Hsa-miR-127-3p可调控I型干扰素通路。所述的小核糖核酸具有以下序列结构：

5’UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU3’(SEQ ID NO:1)；

所述的Hsa-miR-127-3p的前体具有如下结构(SEQ ID NO:2)：

5’UGUGAUCACUGUCUCCAGCCUGCUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAUUCAGAAAGAUCAUCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCUGGUCGGAAGUCUCAUCAUC3’。

本发明人将Hsa-miR-127-3p的mimics及阴性对照mimics转染到Hela细胞中，利用荧光素酶报告基因实验，检测Hsa-miR-127-3p对I型干扰素通路的影响。通过在Hela细胞中过表达Hsa-miR-127-3p，发现Hsa-miR-127-3p能够抑制Type I IFN诱导的ISRE/GAS-荧光素酶的活性。进一步检测Type I IFN诱导的下游基因发现，Hsa-miR-127-3p能显著抑制CCL2、CXCL10和IFIT3的表达。磷酸化的STAT1和STAT2在整个Type I IFN通路活化过程中起着重要作用，磷酸化的STAT1和STAT2进入核内，激活Type I IFN诱导的下游基因表达。Western Blot实验证实，Hsa-miR-127-3p能显著抑制STAT1和STAT2磷酸化，从而抑制Type I IFN通路活化。本发明人的研究表明，在整个I型干扰素通路活化过程中，Hsa-miR-127-3p起着十分重要的作用。它通过抑制STAT1和STAT2磷酸化，对整个I型干扰素通路起负向调控作用。其作为一个新的药物干预靶点，为治疗包括病毒感染、肿瘤、免疫排斥、系统性红斑狼疮等疾病带来新的希望。

在得知了所述的小核糖核酸的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调控I型干扰素通路的物质。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选方法，所述的方法包括：(a)将候选物质与表达Hsa-miR-127-3p的体系接触；(b)观察候选物质对于Hsa-miR-127-3p的表达的影响；其中，若所述候选物质可提高Hsa-miR-127-3p的表达，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗I型干扰素通路异常活化相关疾病的潜在物质。

更优选的，可通过设置对照组来观察候选物质对于Hsa-miR-127-3p的表达的影响状况；所述对照组是不添加所述候选物质的表达Hsa-miR-127-3p的体系。

由于Hsa-miR-127-3p的上调剂可调节Hsa-miR-127-3p的表达或活性，因此，所述的Hsa-miR-127-3p的上调剂也可被应用于本发明，其可通过上调Hsa-miR-127-3p的表达或活性，来发挥负向调控I型干扰素通路的作用。

所述的Hsa-miR-127-3p的上调剂是指任何可维持Hsa-miR-127-3p的稳定性、促进Hsa-miR-127-3p表达、延长Hsa-miR-127-3p有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为可用于调控(特别是抑制)I型干扰素通路有用的物质。

Hsa-miR-127-3p的前体也被包含在本发明中，作为调控(特别是抑制)I型干扰素通路有用的物质。天然状态下，动物来源的miRNA是在动物细胞中由前体miRNA加工获得的miRNA。因此，本领域公知Hsa-miR-127-3p的前体可以在体内演变为Hsa-miR-127-3p，发挥作用。

所述的Hsa-miR-127-3p或其前体或类似物的变异体也被包含在本发明中，只要这些变异体中，相应于Hsa-miR-127-3p的5’端第2-7位的碱基是保守的，为CGGAUC。所述的Hsa-miR-127-3p或其前体或类似物的变异体中，相应于Hsa-miR-127-3p的5’端第8位之后的碱基是可以适当变化的，由于这些碱基并非为与靶序列结合的关键位点，并非位于种子区域；因此，这些位置上一个或多个(如1-5个；较佳地1-3个；更佳地1-2个)碱基被替换的变异体也被包含在本发明中。本领域公知，niRNA与靶序列的结合以及发挥下调作用，关键在于种子区域的序列。

在得知了所述Hsa-miR-127-3p的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的Hsa-miR-127-3p或其前体的编码基因、或药物组合物给药于需要治疗的受试者(如SLE患者)。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将Hsa-miR-127-3p或其前体、上调剂、类似物或它们的变异体通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带Hsa-miR-127-3p或其前体、上调剂、类似物或它们的变异体的表达单位递送到靶点上，并使之表达Hsa-miR-127-3p，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明的Hsa-miR-127-3p或其前体、上调剂、类似物或它们的变异体，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌注、静脉、或皮下给药。

所述的Hsa-miR-127-3p或其前体、上调剂、类似物或它们的变异体可直接用于疾病治疗，例如，用于系统性红斑狼疮的治疗。在使用本发明的Hsa-miR-127-3p或其前体、上调剂、类似物或它们的变异体时，还可同时使用其他治疗系统性红斑狼疮的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的Hsa-miR-127-3p或其前体、上调剂、类似物或它们的变异体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。

使用药物组合物时，是将安全有效量的所述Hsa-miR-127-3p或其前体、上调剂、类似物或它们的变异体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

通过给予受试者所述的Hsa-miR-127-3p或其前体、上调剂、类似物或它们的变异体，可提高受试者中该小核糖核酸的含量、表达，从而预防或治疗该小核糖核酸降低相关的疾病，如干扰素通路异常激活相关疾病。已有研究显示，I型干扰素通路的异常激活在狼疮发病中发挥着关键的作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料和方法

1、细胞培养

Hela细胞来源于美国菌种保藏中心(ATCC)。培养于DMEM(加10%小牛血清，加100U/ml青霉素-链霉素)培养基中，37℃5%CO₂。

2、荧光素酶报告基因实验

Hela细胞培养于96孔板，细胞50-60%融合时，用Lipofectaminea^TM2000脂质体转染方法共转染ISRE报告基因载体(购自Clonetech，全名p-ISRE-luc)或GAS报告基因载体(购自Clonetech，全名p-GAS-luc)(100ng/孔)和Hsa-miR-127-3p(100nM/孔)成熟体mimics(购自上海吉玛公司)或阴性对照mimics(NC)(购自上海吉玛公司)，4hr后换液，24hr后加入Type I IFN(1000u/ml，PBL公司)刺激(经过刺激后的以IFN1000表示)，刺激6hr后，除去上清，加入30uL/孔裂解液(Promega公司)，150转室温摇30分钟，收集蛋白，取5uL上机检测，底物购自Promega，Firefly和Renilla底物各60uL/孔。

Hsa-miR-127-3p mimics序列：5’UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU3’；

阴性对照mimics序列：5’UUCUCCGAACGUGUCACGU3’(SEQ ID NO:3)；

上述序列被用于直接转细胞。

3、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

Hela细胞培养于24孔，用Lipofectaminea^TM2000脂质体转染方法转染Hsa-miR-127-3p(100nM/孔)及阴性对照(NC)的成熟体mimics，4hr后换液，24hr后加入Type I IFN(1000u/ml，PBL公司)刺激，刺激6hr后，除去上清，使用酚氯仿法抽提，每孔细胞使用0.5mLTrizol(Invitrogen公司)收集RNA，加入100uL氯仿混匀后静置3分钟，12000g4℃离心15分钟，吸取上清并加入300uL异丙醇混匀后静置10分钟，12000g4℃离心10分钟，除去上清，用500uL的75%的乙醇洗涤两次，每次7500g4℃离心5分钟。使用Nanodrop测定其浓度。然后，经TaKaRa PrimeScript RT reagent kit逆转录，加样体系为10ul，逆转录反应条件为37℃、15min85℃、5s。逆转录后的cDNA，采用TaKaRa SYBR PremixEx Taq，加样体系为5ul，进行实时荧光定量PCR。在Applied Biosystems7900HTFast Real-Time PCR System上进行检测。

实时定量引物如表1。

表1

4、免疫印迹实验(Western Blot)

Hela细胞培养于6孔板，用Lipofectaminea^TM2000脂质体转染方法转染Hsa-miR-127-3p(100nM/孔)及阴性对照(NC)的成熟体mimics，4hr后换液，24hr后加入Type I IFN(1000u/ml，PBL公司)刺激，刺激6hr后，除去上清，应用RIPA Buffer(Thermo公司产品)裂解法抽提总蛋白，得到的蛋白用5×SDS-PAGE缓冲液(Beyotime公司产品)稀释，并对其进行蛋白变性。采用Bio-Rad垂直电泳系统进行蛋白电泳，随后采用Bio-Rad湿式转移系统和PVDF膜进行蛋白转移，随后PVDF膜采用Blocking Buffer(Thermo公司产品)封闭，一抗4℃孵育过夜，PBST洗涤，二抗室温孵育1h，PBST洗涤，采用Pierce ECL WesternBlotting Substrate(Thermo公司产品)显影，并使用X射线胶片(柯达公司产品)冲片。

5、酶联免疫吸附实验(ELISA)

Hela细胞培养于24孔，用Lipofectaminea^TM2000脂质体转染方法转染Hsa-miR-127-3p(100nM/孔)及阴性对照(NC)的成熟体mimics，4hr后换液，24hr后加入Type I IFN(1000u/ml，PBL公司)刺激，刺激6hr后，吸取上清，用人的CCL2和CXCL-10ELISA kit(Biotechnology Systems)检测细胞上清CCL2和CXCL-10水平。

6、Pristane诱导的小鼠系统性红斑狼疮相关的肺出血

C57小鼠(上海斯莱克)，Hsa-miR-127-3p类似物(agomir-127-3p)(购自广州锐博公司，序列同Hsa-miR-127-3p mimics，但适用于体内实验)，PBS缓冲液(LifeTechnology)，Pristane(Sigma公司)。

C57小鼠，连续三天经尾静脉注射Hsa-miR-127-3p类似物(agomir-127-3p)(50nmol/只/天)或PBS缓冲液后，再经腹腔注射Pristane(0.5mL/只)来诱导小鼠系统性红斑狼疮相关的肺出血。14天后，取出实验组和对照组小鼠的肺，观察肺出血的发生率，并通过H&E染色观察肺组织的损伤情况。

Hsa-miR-127-3p类似物序列：5’UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU3’。

实施例1、Hsa-miR-127-3p能显著抑制Type I IFN诱导的ISRE/GAS-luciferase(荧光素酶)活性

本发明人在Hela细胞中共转染ISRE或GAS报告基因载体和Hsa-miR-127-3p mimics或阴性对照(NC)mimics，Type I IFN刺激6hr后，用双荧光素酶报告基因分析系统检测荧光素酶活性，发现Hsa-miR-127-3p可以抑制Type I IFN诱导的ISRE-Luciferase(荧光素酶)活性(图1A)或GAS-Luciferase(荧光素酶)活性(图1B)。

该结果表明，Hsa-miR-127-3p可以抑制Type I IFN通路。

microRNA发挥功能主要依赖于它的种子区域的序列，于是本发明人设计了hsa-miR-127-3p种子区域序列的突变体seedmut1和seedmut2。序列如下(其中下划线表示了修改后的碱基)：

hsa-miR-127-3p seed mut1(SEQ ID NO:10)：

5’UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU3’(SEQ ID NO:1)；

5’UGCCUAGCGUCUGAGCUUGGCU3’(SEQ ID NO:10)；

hsa-miR-127-3p seed mut2(SEQ ID NO:11)：

5’UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU3’(SEQ ID NO:1)；

5’UGGCAACCGUCUGAGCUUGGCU3’(SEQ ID NO:11)。

为了证明hsa-miR-127-3p的功能依赖于种子区域序列，本发明人以ISRE报告基因为例，在Hela细胞中共转染ISRE报告基因载体和Hsa-miR-127-3pmimics或阴性对照(NC)mimics或hsa-miR-127-3p seed mut1或hsa-miR-127-3pseed mut2。Type I IFN刺激6hr后，用双荧光素酶报告基因分析系统检测荧光素酶活性，发现Hsa-miR-127-3p可以抑制Type I IFN诱导的ISRE-Luciferase(荧光素酶)活性(图1C)，而hsa-miR-127-3p seed mut1和hsa-miR-127-3p seed mut2不能抑制。

该结果表明，Hsa-miR-127-3p可以抑制Type I IFN通路，依赖于其种子区序列CGGAUC，三个碱基的改变(如红色部分：GGCAAC)就会影响其抑制效果。

实施例2、Hsa-miR-127-3p能显著抑制Type I IFN诱导的下游基因的表达

为了进一步验证Hsa-miR-127-3p在Type I IFN通路中的功能，本发明人将Hsa-miR-127-3p mimics转入Hela细胞中，Type I IFN刺激6hr后，检测Type IIFN诱导的下游基因表达，与对照相比，Hsa-miR-127-3p mimics可以显著抑制Type I IFN诱导的下游基因表达如CCL2、CXCL10和IFIT3(图2A)。

刺激后检测上清中CCL2、CXCL10的蛋白表达水平。结果显示，Hsa-miR-127-3p能显著抑制CCL2、CXCL10的表达(图2B)。这说明Hsa-miR-127-3p确实能够负向调控Type I IFN通路下游基因的表达。

实施例3、Hsa-miR-127-3p通过抑制STAT1和STAT2磷酸化来参与负向调控Type I IFN通路

有文章已报道在Type I IFN通路中，Type I IFN与其受体相结合后，激活下游的磷酸激酶，进一步磷酸化STAT1和STAT2，使其被激活，磷酸化的STAT1和STAT2进入核内，激活Type I IFN诱导的基因表达[Platanias,L.C.Mechanisms of type-I-and type-II-interferon-mediated signalling.NatureReviews Immunology.2005.5(5):375-386]。其中磷酸化的STAT1和STAT2在整个Type I IFN通路活化过程中起着重要作用，所以本发明人怀疑Hsa-miR-127-3p是否可以通过影响STAT1和STAT2的磷酸化来参与调控Type I IFN通路。本发明人将Hsa-miR-127-3p mimics转入Hela细胞中，TypeI IFN刺激6hr后，通过Western Blot本发明人发现：对照相比，Hsa-miR-127-3p能够显著抑制STAT1和STAT2磷酸化，而对STAT1和STAT2蛋白表达无明显影响(图3A和图3B)。

该结果表明，Hsa-miR-127-3p可以通过抑制STAT1和STAT2磷酸化来参与负向调控Type I IFN通路。

实施例4、Hsa-miR-127-3p能够减轻Pristane诱导的小鼠系统性红斑狼疮相关的肺出血

结合前面所述的Hsa-miR-127-3p能够抑制I型干扰素通路，本发明人推测过表达Hsa-miR-127-3p能够通过抑制I型干扰素通路来抑制Pristane诱导的小鼠系统性红斑狼疮的相关症状(这里即为肺出血)。

为了观察Hsa-miR-127-3p在体内的作用，本发明人选择了Pristane诱导的小鼠系统性红斑狼疮相关的肺出血模型。Pristane诱导的小鼠系统性红斑狼疮是典型的一型干扰素相关的疾病模型，I型干扰素是其发病原因之一。

结果如图4。图4A显示的是PBS缓冲液对照组的肺组织H&E染色切片，图中可以看出大量的炎症细胞浸润。图4B显示的是Hsa-miR-127-3p类似物实验组的肺组织H&E染色切片，图中可以看出肺部的组织结构正常没有炎症细胞浸润。图4C总结了肺出血的发生率，可以看出PBS缓冲液对照组有50%的小鼠发生了肺出血，而Hsa-miR-127-3p类似物很好地保护了该组小鼠。

实施例5、筛选方法

设置：

测试组：Hela细胞(其中内源表达Hsa-miR-127-3p)，并给予候选物质；

对照组：Hela细胞(其中内源表达Hsa-miR-127-3p)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中Hsa-miR-127-3p的表达情况，并进行比较。如果测试组中Hsa-miR-127-3p的表达在统计学上低于(如低30%或更低)对照组，就表明该候选物是抑制I型干扰素通路异常活化相关疾病的潜在物质。

讨论

通过研究在Type I IFN通路中有功能的miRNAs，本发明人发现Hsa-miR-127-3p负向调控Type I IFN通路，并进一步证明了Hsa-miR-127-3p可以通过抑制STAT1和STAT2的磷酸化显著抑制Type I IFN通路活化。

I型干扰素是一类广泛表达的细胞因子，通过激活下游多个信号通路如JAK-STAT和p38信号通路等[Platanias,L.C.Mechanisms of type-I-andtype-II-interferon-mediated signalling.Nature Reviews Immunology.2005.5(5):375-386]，在肿瘤、病毒感染和自身免疫性疾病过程中均发挥十分重要的功能[JE Craft.Dissecting the immune cell mayhem that drives lupus pathogenesis.Science Translational Medicine.2011]。

研究表明，不同的病毒在初次感染机体时，一般都可诱导pDC产生I型干扰素来抵抗病毒感染[LarsT he Natural Interferon-a ProducingCells in Systemic Lupus Erythematosus.Human immunology.2002]。在pDC中模式识别受体(PRR)识别并结合病毒成分而激活下游的信号通路，诱导I型干扰素产生[Smith,P.L.,G.Lombardi,et al.Type I interferons and the innateimmune response—more than just antiviral cytokines.Molecular Immunology.2005.42(8):869-877]。I型干扰素通过自分泌或旁分泌方式与其受体(IFNR)相结合，进一步激活多条信号途径如JAK-STAT和p38信号通路，从而诱导下游基因表达，参与到机体抗病毒的过程。体内研究证实HIV感染者和艾滋病人外周血中I型干扰素表达降低，而I型干扰素参与到抑制HIV的复制过程。与此同时，进一步研究发现，I型干扰素表达降低与多种病毒诱发的疾病发生相关。因此，增强I型干扰素表达和激活I型干扰素通路的试剂可以为有效治疗免疫功能低下所导致的病毒长期感染提供新的途径。

研究表明，由于I型干扰素在天然免疫和适应免疫中的调节作用，使得I型干扰素成为治疗肿瘤的有效途径。有研究表明CpG-ODN诱导刺激外周血中的pDC产生的I型干扰素可以促进单核细胞、NK细胞和T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。因此，I型干扰素通路的激活也可以用来抗肿瘤[Kemp TJ，Elzey BD，Griffith Ts.Hasmacytoid dendritic celderived IFN-alpha induces TNF-relatedapoptosis-inducing ligand／APO-2L-mediated antitumor activity by humanmonocytes folowing CpG oligodeoxynucleotide stimulation[J].J Immunol.2003]。

近来研究发现I型干扰素通路的异常可引起自身免疫性疾病。许多研究表明I型干扰素在SLE的发病中起了重要的作用。在活动期SLE病人的外周血中发现了异常活化的I型干扰素通路[LType I Interferon inSystemic Lupus Erythematosus.Arthritis & Rheumatism.2006]。在SLE的发病机制中，SLE病人组织损伤产生的凋亡细胞和血清中的自身抗体结合后，形成免疫复合物[JE Craft.Dissecting the immune cell mayhem that drives lupuspathogenesis.Science Translational Medicine.2011；Fairhurst,A.M.,A.E.Wandstrat,et al.Systemic Lupus Erythematosus:Multiple ImmunologicalPhenotypes in a Complex Genetic Disease.2006.92:1-69]。刺激pDC产生大量的I型干扰素，而分泌的I型干扰素可促进自身反应性B细胞的增殖，同时可诱导单核细胞向MoDC分化，MoDC摄取凋亡细胞后递呈自身抗原给自身反应性T细胞，这些导致机体大量产生自身抗体，自身抗体的产生又加剧了组织的损伤，形成了一个恶性的循环。因此抑制异常活化的I型干扰素通路，可以有效治疗和缓解SLE疾病的发生和进行。

除了SLE，I型干扰素通路的异常还与其他多种自身免疫性疾病相关，如I型糖尿病、干燥综合症、肌炎、系统性硬皮病、风湿性关节炎、HIV相关认知障碍、脑炎、Aicardi-Goutières综合症等(Upsala Journal of Medical Sciences,v116:227-237;Cytokine & Growth Factor Reviews,v23:7–14;Immunity,v36:166)。

miRNA作为一种调控分子，在人类多种疾病的发生和发展过程都有着重要作用。不同于以往的有或无的调节特点，miRNA主要是在数量上对靶基因进行调节。这一特点是一些分子的拮抗剂和激动剂所无法比拟的，这展示了miRNA在临床应用方面的巨大前景。本研究发现Hsa-miR-127-3p可以显著负向调控Type I IFN通路。因此Hsa-miR-127-3p可能作为一个新的药物干预靶点，过表达Hsa-miR-127-3p可以负向调控Type I IFN通路，而抑制其功能可以正向调控Type I IFN通路，进而调节机体免疫反应，为治疗包括病毒感染、肿瘤、免疫排斥、系统性红斑狼疮等疾病带来新的希望。

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