一种灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法

摘要

本发明提供了一种灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法，属于疫苗免疫技术领域，是应用大鼠作为实验动物，将含CA16抗原的灭活疫苗免疫大鼠，通过测定大鼠血清的中和抗体效价来评价CA16病毒灭活疫苗免疫原性。本发明方法具有敏感性强、可多次免疫、可持续观察免疫后抗体消长趋势的优点，在CA16病毒灭活疫苗免疫原性的评价上具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗免疫技术领域，具体地说，涉及一种灭活疫苗 中CA16抗原免疫原性的检测方法。

背景技术

手足口病是由肠道病毒引起的传染病，世界大部分地区均有此 病流行的报导。肠道病毒EV71和柯萨奇病毒Cox A16（简称CA16） 感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。

近年来，我国手足口病疫情日益严重，发病、重症和死亡病例 呈逐年上升趋势，2008年全国共报道手足口病例489,073例，死亡 126例；2009年报告发病1,155,525例，死亡353例；2010年报告发 病1,774,669例，死亡905例；2011年报告发病1,638,743例，死亡 506例。其中重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，死者年龄 通常为0.5-3岁，病程仅2天。该病已严重危及我国人民，特别是婴 幼儿人群的健康和生命，给社会带来了巨大的疾病负担，我国于2008 年5月2日将其列入丙类传染病。

虽然重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，但值得关注 的是CA16与心肌炎、心包炎、难治性休克等综合性疾病相关，且 在部分地区成为手足口病优势病原。此外，卫生部相关数据显示， 上一年流行CA16的地区，第二年流行EV71时的报告病例数、重症 和死亡病例数均明显增加，提示二者可能存在协同关系。柯萨奇病 毒(Coxasckie virus)A16型(Cox A16,CA16)是小RNA病毒科的单 股正链RNA病毒，呈20面立体对称球形，直径约23-30nm。主要 经粪-口、呼吸道和密切接触传播，可通过胎盘传给胎儿引起宫内感 染。早期发现的手足口病的病原体主要为Cox A16型，20世纪70 年代后，与EV71感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。我 国北京、福建、天津、吉林、山东、广东、深圳、浙江、四川、安 徽等多个省份均有报道。目前尚无CA16病毒疫苗的报道，因此开 展CAl6病毒灭活疫苗的临床前研究并有效评价其免疫原性是十分 必要的，但如何有效地评价CAl6病毒灭活疫苗的免疫原性，至今未 有其方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检 测方法。

本发明提供的灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法，是 将含CA16抗原的灭活疫苗免疫大鼠，通过测定大鼠血清的中和抗 体效价来检测CA16病毒灭活疫苗免疫原性。

所述大鼠为Wistar大鼠、SD大鼠或Brown Norway大鼠。

本发明方法中，免疫途径为腹腔注射、肌肉注射或皮下注射。 其中，免疫剂量为每次每只大鼠注射含25~1600UCA16抗原的灭活 疫苗。

其中，免疫程序为0天、14天分别免疫2次，第28天采血，分 离血清，采用常规的微量中和法测定血清的中和抗体效价。

具体步骤如下：将血清倍比稀释，CA16病毒（购自ATCC，100 CCID₅₀/0.05ml）与不同稀释度的血清于37℃中和反应后接种敏感细 胞（Vero/RD细胞，来源于ATCC），根据细胞的感染情况判定血清 中和抗体的效价，计算各组血清的GMT（几何平均值）。

本发明方法也可选用以下免疫程序：免疫程序为0天、14天、 28天分别免疫3次，第42天采血，测定血清的中和抗体效价。

本发明所述的灭活疫苗，其佐剂为氢氧化铝。

进一步地，本发明提供了CA16病毒灭活疫苗免疫原性的检测 方法，将CA16病毒灭活疫苗免疫Wistar大鼠、SD大鼠或Brown Norway大鼠，免疫途径为腹腔注射、肌肉注射或皮下注射，免疫剂 量为每次每只大鼠注射含25~1600U CA16抗原的灭活疫苗；免疫程 序为0天、14天分别免疫2次，第28天采血，或0天、14天、28 天分别免疫3次，第42天采血，测血清的中和抗体效价。

本发明还提供了一种CA16病毒免疫原性的检测方法，将CA16 病毒接种大鼠，通过测定大鼠血清的中和抗体效价来检测CA16病 毒的免疫原性。

进一步地，检测CA16病毒免疫原性的方法为将CA16病毒接 种Wistar大鼠、SD大鼠或Brown Norway大鼠，接种途径为腹腔注 射、肌肉注射或皮下注射；免疫程序为0天、14天分别免疫2次， 第28天采血，或，在第0天、14天、28天分别免疫3次，第42天 采血，测血清的中和抗体效价。

上述免疫剂量，本领域技术人员可根据实验大鼠的性别、重量、 日龄结合现有技术进行常规选择。

对于血清中和抗体效价，通常情况下本领域技术人员认为抗体 水平不低于1:40则认为产生有保护性的抗体，也即免疫原具有较好 的免疫原性。

本发明利用实验大鼠开展对含CA16抗原的灭活疫苗免疫原性 进行评价研究，前期研究结果表明应用小鼠、兔、羊评价CA16疫 苗的免疫原性效果均不理想，而应用大鼠作为模型评价CA16疫苗 的免疫原性相对较敏感，且具有可多次免疫、可持续观察免疫后抗 体消长趋势的优点。本发明方法在CA16病毒灭活疫苗免疫原性的 检测上具有良好的应用前景。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市 售。本发明使用的的CA16病毒株（毒株保藏号为：CGMCC No.5373） 已在中国专利CN102559606A中公开。实施例中涉及的CA16灭活 疫苗和EV71-CA16灭活疫苗均由北京科兴生物制品有限公司生产。

实施例1免疫原性方法的建立与验证

本发明将三批CA16灭活疫苗同时免疫了大鼠、小鼠、羊、兔子 等实验动物，且结合细胞水平的血清中和抗体检测方法进行评价抗体 水平，具体实施如下所示：

1、应用小鼠为实验动物检测CA16灭活疫苗免疫原性

实验动物：ICR小鼠、B/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术 有限公司。

佐剂类型：氢氧化铝佐剂

免疫方式：腹腔注射

免疫程序：0天、14天两针免疫，28天采血，测量血清效价。

免疫剂量：0.5ml/只/次，0.5ml疫苗中含CA16抗原400U。试验结 果见表1：

表1CA16灭活疫苗免疫小鼠后的血清中和抗体效价

结果发现，应用小鼠（ICR、B/c）评价CA16疫苗免疫原性，两 针免疫，28天采血分离血清，测定血液的中和抗体，将血清倍比稀释， CA16病毒（100CCID₅₀/0.05ml）与不同稀释度的血清于37℃中和反应 后接种敏感细胞（Vero/RD细胞，来源于ATCC），根据细胞的感染情 况判定血清中和抗体的效价，计算各组血清的GMT（几何平均值）。 本领域内，通常认为中和抗体水平大于等于1：8为抗体阳性，大于等 于1：40为有抗体保护，本次应用两个品系小鼠评价CA16疫苗的免疫 原性所测定的中和抗体总体水平均小于1：40，在本次试验表明小鼠 不适宜作为CA16疫苗免疫原性评价的动物模型。

2、应用新西兰兔为实验动物检测CA16疫苗免疫原性

实验动物：新西兰兔，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

佐剂类型：氢氧化铝佐剂

免疫方式：颈背部皮下多点注射

免疫程序：0天、14天两针免疫，28天采血，测量血清效价。

免疫剂量：2ml/只/次，2ml CA16灭活疫苗中含CA16抗原1600U。

试验结果见表2：

表2CA16疫苗免疫新西兰兔后的血清效价

结果发现：应用新西兰兔评价3批CA16疫苗免疫原性，两针免疫， 28天采血测定中和抗体效价方法同上述1、应用小鼠评价CA16疫苗免 疫原性本次应用新西兰兔评价CA16疫苗的免疫原性所测定的中和抗 体均小于等于1：40，总体GMT水平不高，本次试验表明新西兰兔对 CA16疫苗的敏感性较差，同时兔子个体较大，成本较高，不适宜作 为CA16疫苗免疫原性评价的实验动物。

3、应用羊为实验动物检测CA16疫苗免疫原性

实验动物：绵羊，雌性，约20kg，农贸市场购买。

佐剂类型：氢氧化铝佐剂

免疫方式：肌肉注射

免疫程序：0天、14天两针免疫，28天采血，测量血清效价。

免疫剂量：2ml/只/次，2ml CA16灭活疫苗中含CA16抗原1600U。

试验结果见表3：

表3CA16疫苗免疫羊后的血清中和抗体效价

研究结果发现：应用羊评价3批CA16疫苗免疫原性，两针免疫， 28天测定中和抗体，总体中和抗体水平均均小于等于1：40，表现出 对CA16疫苗的敏感性不够，同时羊属于大个体动物，成本较高，不 适宜作为CA16疫苗免疫原性评价的实验动物。

4、应用大鼠为实验动物检测CA16灭活疫苗免疫原性

实验动物：Wistar大鼠和SD大鼠，购自北京维通利华实验动物技 术有限公司。

佐剂类型：氢氧化铝佐剂

免疫方式：腹腔注射

免疫程序：0天、14天两针免疫，28天采血，测量血清效价。

免疫剂量：0.5ml/只/次，0.5ml CA16灭活疫苗含CA16抗原400U。

试验结果见表4：

表4CA16疫苗免疫大鼠后的血清效价

结果发现：应用大鼠评价多批CA16疫苗免疫原性，分别测定中 和抗体效价，结果表明总体中和抗体水平均大于等于1：40，表现出 对CA16疫苗的敏感性较好，同时大鼠个体适中，成本较低，且适于 多次免疫，可观察动态抗体消长趋势，是CA16疫苗免疫原性评价理 想的实验动物。

实施例2应用大鼠检测CA16病毒灭活疫苗免疫原性的方法

试验动物：Wistar

疫苗种类：CA16病毒灭活疫苗，其佐剂为氢氧化铝，由北京科 兴生物制品有限公司生产。

免疫方式：腹腔注射

免疫程序：0天一针免疫，14天采血，测量血清效价；0天、14 天两针免疫，28天采血，测量血清效价；0天、14天、28天三针免疫， 42天采血，测定血清的中和抗体效价。

免疫剂量：0.5ml/只/次，0.5ml CA16灭活疫苗中含CA16抗原量 及试验结果见表5：

表5CA16病毒灭活疫苗免疫大鼠后的血清效价的GMT

结果说明：应用大鼠评价不同免疫程序下的CA16灭活疫苗免疫 原性，采用三种免疫程序，分别测定中和抗体，同等剂量相同免疫程 序下中和抗体水平较小鼠、羊、兔子高，且与免疫剂量呈现良好的量 效关系。表现出对CA16疫苗的敏感性较好，同时大鼠个体适中，成 本较低，且适于多次免疫，可观察动态抗体消长趋势，说明大鼠是 CA16疫苗免疫原性评价理想的实验动物。

实施例3应用小鼠、兔子检测EV71-CA16灭活疫苗中CA16抗原 的免疫原性

试验动物：ICR小鼠、新西兰兔，均购自北京维通利华实验动物 技术有限公司。

佐剂类型：氢氧化铝佐剂

免疫方式：小鼠采用腹腔注射，新西兰兔采用颈背部皮下多点注 射

免疫程序：0天、14天两针免疫，28天采血，测定血清的中和抗 体效价。

免疫剂量：小鼠0.5ml/只/次，新西兰兔2ml/只/次，每0.5ml CA16 灭活疫苗中含CA16抗原及血清效价几何平均值见表6：

表6EV71-CA16灭活疫苗免疫ICR小鼠、新西兰兔后的针对CA16 抗原的血清效价的GMT

结果表明：应用ICR小鼠及新西兰兔评价EV71-CA16二联灭活疫苗 中CA16的免疫原性，总体中和抗体水平均均小于等于1：40，同样 表现出对CA16抗原免疫原性检测的敏感性不够，再次证实小鼠、 新西兰兔不适合作为CA16灭活疫苗或EV71-CA16二联灭活疫苗中 CA16免疫原性评价的试验动物。

实施例4应用大鼠检测EV71-CA16灭活疫苗中CA16抗原的免疫 原性

试验动物：SD大鼠

佐剂类型：氢氧化铝佐剂

免疫方式：腹腔注射

免疫程序：0天、14天两针免疫，28天采血，测量血清中和抗体 效价。

免疫剂量：0.5ml/只/次，0.5ml含CA16抗原400U。免疫剂量与血 清效价几何平均值见表7。

表7EV71-CA16灭活疫苗免疫大鼠后的针对CA16抗原的血清效价 的GMT

结果表明：应用大鼠评价EV71-CA16二联灭活疫苗中CA16的 免疫原性，相较于小鼠和新西兰兔，有较高的敏感性。本方法可以 特异的检测到针对CA16的中和抗体，抗体水平与免疫剂量呈现相 关的量效关系，且与CA16疫苗同等剂量相同免疫程序下产生的抗 体水平相当。可以用于评价EV71-CA16二联灭活疫苗中CA16的免 疫原性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还 可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护 范围。