一种提高胞壁结合型生物破乳剂破乳性能的方法

摘要

本发明涉及一种提高胞壁结合型生物破乳剂破乳性能的方法，该方法包括以下步骤：将胞壁结合型生物破乳剂进行冷冻干燥，得到生物破乳剂干粉，然后将生物破乳剂干粉与一定比例的甲醇和盐酸混合溶液混合搅拌进行甲酯化反应，最后经过旋转蒸发、烘干后，得到破乳性能提高的胞壁结合型生物破乳剂。与现有技术相比，本发明方法工艺简单，成本较低，胞壁结合型生物破乳剂的破乳性能提高明显，易于大规模应用。

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，尤其是涉及一种提高胞壁结合型生物破乳 剂破乳性能的方法。

背景技术

生物破乳剂是生物表面活性剂的一种，是一类能够使乳状液油水分离的新型 破乳剂。与传统化学破乳剂相比，生物破乳剂具有高效低毒、可生物降解、在极端 条件下发挥活性等优点，在原油开采、含油土壤修复等领域具有较大的应用前景。

生物破乳剂是由菌体产生的，在提取生物破乳剂时需要将生物破乳剂从菌体上 分离下来。

目前制约生物破乳剂应用的瓶颈主要是生产成本过高。解决这一问题可以有两 种途径：第一，在培养阶段通过优化培养基组分和培养条件等提高生物破乳剂的产 量；第二，在后处理阶段，通过生物破乳剂结构的优化，提高生物破乳剂的性能。 目前国内外的研究主要集中在上游培养阶段提高破乳剂的产量，几乎没有涉及到下 游生物破乳剂性能优化的研究。因此迫切需要一种提高成品生物破乳剂的破乳性能 的方法。胞壁结合型生物破乳剂表面含有丰富的物质，有效物质位于细胞表面，通 过对细胞表面物质或基团进行修饰，可以改变细胞表面的性质，从而对生物破乳剂 的破乳性能产生影响。

中国专利CN102286536A公布了一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，该 方法包括以下步骤：将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉经过预处理，然 后与碱液混合搅拌，经离心、中和、浓缩和冷冻干燥，得到胞壁结合型生物破乳剂。

中国专利CN102350261A公布了一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，该 方法包括以下步骤：将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉与碱液混合搅 拌，经离心、中和、浓缩、透析除盐和冷冻干燥，得到胞壁结合型生物破乳剂。

上面两篇专利均是集中在胞壁结合型生物破乳剂的提取，既没有涉及到上游 培养阶段提高其产量，也没有涉及到下游生物破乳剂性能优化。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种提高胞壁结 合型生物破乳剂破乳性能的方法，该方法工艺简单、成本较低、破乳性能提高明显， 易于大规模应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种提高胞壁结合型生物破乳剂破乳性能的方法，该方法包括以下步骤：将胞 壁结合型生物破乳剂冷冻干燥，得到生物破乳剂干粉，然后将生物破乳剂干粉与一 定比例的甲醇和盐酸混合溶液混合搅拌进行甲酯化反应，最后经过旋转蒸发、烘干 后，得到破乳性能提高的胞壁结合型生物破乳剂。

产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌选自产碱杆菌。

所述的产碱杆菌为产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1。

所述的甲酯化反应具体工艺为：将生物破乳剂干粉加入到甲醇和盐酸体积比为 50∶1～150∶1的混合溶液中，生物破乳剂干粉与混合溶液的料液比控制在0.005～0.02g 干粉/mL混合溶液，生物破乳剂表面的羧基官能团在酸性条件下与甲醇发生酯化反 应。

进行甲酯化反应的温度为20～25℃，在进行甲酯化反应过程中持续搅拌，搅拌 的转速为250～500rpm，搅拌的时间为12～24h。

所述的旋转蒸发为在40～45℃下，减压旋转蒸发至有机溶剂挥发完全。

所述的烘干的温度为60～80℃，烘干的时间为12～24h。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1.本发明使用材料简单，仅用到甲醇和盐酸，成本低廉。

2.本发明采用的技术方案能够将胞壁结合型生物破乳剂表面的羧基经甲酯化 反应后转变为酯类物质，使得生物破乳剂的疏水性增强，利于生物破乳剂在W/O 乳状液中的分散，从而显著提高生物破乳剂的破乳性能。

3.本发明方法操作简便，易于大规模的产业应用。

4.本发明对于今后揭示胞壁结合型生物破乳剂的破乳机理提供了一条新的思 路，为探究生物破乳剂的破乳机制找到了一个突破口。

附图说明

图1为实施例1中，以菜籽油为碳源培养的初始生物破乳剂和经甲酯化处理的 生物破乳剂的红外图谱；

图2为实施例1中，以菜籽油为碳源培养的初始生物破乳剂和经甲酯化处理的 生物破乳剂24h的破乳曲线；

图2中代表初始生物破乳剂破乳率随时间的变化，代表经甲酯 化处理后生物破乳剂破乳率随时间的变化；

图3为实施例2中，以石蜡为碳源培养的初始生物破乳剂和经甲酯化处理的生 物破乳剂的红外图谱；

图4为实施例2中，以石蜡为碳源培养的初始生物破乳剂和经甲酯化处理的生 物破乳剂24h的破乳曲线。

图4中代表初始生物破乳剂破乳率随时间的变化，代表经甲酯 化处理后生物破乳剂破乳率随时间的变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明的方法特别适用于专利号为ZL200710046963.5的中国专利中的破乳 菌：生物破乳剂产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1，以下将以此菌株为实施对象进行 描述。

高效生物破乳剂产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1取自克拉玛依油田某站采油井 井口1m处长期受石油污染的土壤，于-4℃保存在斜面培养基上。生物破乳剂产碱 杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏日期为2007年8月24日，保藏编号为2142。将保藏菌种活化后接种至 100mL肉汤培养基富集培养72h，再将10mL培养液接入100mL发酵培养基中 培养7d。培养后将菌株的全培养液在10000rpm高速离心10min，获得湿菌，使 用正己烷洗提离心三次，-50℃冷冻干燥24h得到胞壁结合型生物破乳剂干粉，为 以下实施例所用原料。

高效生物破乳剂产碱杆菌Alcaligenessp.S-XJ-1所用的肉汤培养基(1L)组成 为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl25g，pH＝7.0。发酵培养基(1L)组成为： NH₄NO₃4.0g，K₂HPO₄4.0g，KH₂PO₄6.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，微量元素溶液1mL， NaCl25g。碳源为菜籽油或液体石蜡4％(V/V)。其中微量元素溶液(1L)包含 CaCl₂·2H₂O1000mg，FeSO₄·7H₂O1000mg，EDTA1400mg。用6mol/L HCl和6 mol/LNaOH调节发酵培养基初始pH＝9.0。培养基使用前，使用高压蒸气灭菌，灭 菌条件为：1×10⁵Pa灭菌20min。培养条件为：35℃，130rpm。

本发明中模型乳状液配制方法如下：用煤油和水配制油包水型(W/O)模型乳状 液，在250mL高脚烧杯中，加入80mL溶有1.526g Span80和0.074g TweenS0的 煤油溶液，然后加入120mL蒸馏水，用高速搅拌乳化机搅拌3.5min，转速10000 rpm。

全培养液的破乳试验采用瓶试法进行，并在此基础上进行改进。具体操作过程 为：在20mL具塞刻度试管内，加入18mL乳状液，再加入2mL配置的10g/L的 菌悬液，手摇120下使其均匀混和，置于35℃水浴锅内，以一定时间间隔记录上 层油、中层乳状液和下层水的体积变化，破乳监测时间为24h。乳状液脱除率按下 式计算：

实施例1

1.将菜籽油为碳源培养的产碱杆菌Alcaligenessp.S-XJ-1所产生的胞壁结合型 生物破乳剂干粉0.5g加入装有50mLCH₃OH和0.42mLHCl的锥形瓶中。

2.将装有胞壁结合型生物破乳剂和试剂的锥形瓶置于磁力搅拌器上，加入磁力 搅拌子，温度调至25℃，转速设置为500rpm，搅拌反应24h。

3.对所得的混合物进行旋转蒸发，旋转蒸发温度设置为40℃。时间为15-20min。

4.将所得生物破乳剂放置于温度为80℃的烘箱中烘干，时间为24h，收集所得 生物破乳剂。

5.称取一定量的生物破乳剂，加水溶解配成10g/L溶液，取2mL加入破乳管， 再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅24h，观察破乳效果。

图1是初始生物破乳剂和甲酯化生物破乳剂的红外图谱，在1740cm-1附近为 酯键的吸收峰，可以明显看出此吸收峰的增强，说明甲酯化修饰反应的发生。图2 为初始生物破乳剂和甲酯化生物破乳剂24h的破乳曲线，经过甲酯化修饰的生物破 乳剂破乳率要明显高于初始生物破乳剂，破乳时间为24h时，甲酯化生物破乳剂的 破乳率要高出初始生物破乳剂36.5％。

实施例2

1.将石蜡为碳源培养的产碱杆菌Alcaligenessp.S-XJ-1所产的胞壁结合型生物 破乳剂0.5g加入装有50mLCH₃OH和0.42mLHCL的锥形瓶中。

2.将装有胞壁结合型生物破乳剂和试剂的锥形瓶置于磁力搅拌器上，加入磁力 搅拌子，温度调至25℃，转速设置为500rpm，搅拌反应24h。

3.对所得的混合物进行旋转蒸发，旋转蒸发温度设置为40℃。时间为15-20min。

4.将所得生物破乳剂放置于温度为80℃的烘箱中烘干，时间为24h，收集所得 生物破乳剂。

5.称取一定量的生物破乳剂，加水溶解配成10g/L溶液，取2mL加入破乳管， 再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅24h，观察破乳效果。

图3是初始生物破乳剂和甲酯化生物破乳剂的红外图谱，在1740cm^-1附近为 酯键的吸收峰，可以明显看出甲酯化反应的发生。图4为初始生物破乳剂和甲酯化 生物破乳剂24h的破乳曲线，经过甲酯化修饰的生物破乳剂破乳率要明显高于初始 生物破乳剂，破乳时间为24h时，甲酯化生物破乳剂的破乳率要高出初始生物破乳 剂10％。

实施例3

一种提高胞壁结合型生物破乳剂破乳性能的方法，该方法包括以下步骤：将胞 壁结合型生物破乳剂干粉(由产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1所生成)进行冷冻干 燥，得到生物破乳剂干粉，然后将生物破乳剂干粉与一定比例的甲醇和盐酸混合溶 液混合搅拌进行甲酯化反应，最后经过旋转蒸发、烘干后，得到破乳性能提高的胞 壁结合型生物破乳剂。

甲酯化反应具体工艺为：将生物破乳剂干粉加入到甲醇和盐酸体积比为50∶1 的混合溶液中，生物破乳剂干粉与混合溶液的料液比控制在0.005g干粉/mL混合 溶液，生物破乳剂表面的羧基官能团在酸性条件下与甲醇发生酯化反应。进行甲酯 化反应的温度为20℃，在进行甲酯化反应过程中持续搅拌，搅拌的转速为250rpm， 搅拌的时间为12h。旋转蒸发为在45℃下，减压旋转蒸发至有机溶剂挥发完全。 烘干的温度为60℃，烘干的时间为12h。

实施例4

一种提高胞壁结合型生物破乳剂破乳性能的方法，该方法包括以下步骤：将胞 壁结合型生物破乳剂干粉(由产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1所生成)进行冷冻干 燥，得到生物破乳剂干粉，然后将生物破乳剂干粉与一定比例的甲醇和盐酸混合溶 液混合搅拌进行甲酯化反应，最后经过旋转蒸发、烘干后，得到破乳性能提高的胞 壁结合型生物破乳剂。

甲酯化反应具体工艺为：将生物破乳剂干粉加入到甲醇和盐酸体积比为150∶1 的混合溶液中，生物破乳剂干粉与混合溶液的料液比控制在0.02g干粉/mL混合溶 液，生物破乳剂表面的羧基官能团在酸性条件下与甲醇发生酯化反应。进行甲酯化 反应的温度为23℃，在进行甲酯化反应过程中持续搅拌，搅拌的转速为400rpm， 搅拌的时间为20h。旋转蒸发为在42℃下，减压旋转蒸发至有机溶剂挥发完全。 烘干的温度为70℃，烘干的时间为18h。