一种霍乱弧菌分析分型试剂盒

摘要

本发明涉及一种霍乱弧菌分子分型试剂盒，用荧光标记复合引物分别扩增霍乱弧菌6个VNTR基因座。本发明将6个基因座分为3组，共涉及4中荧光标记；经毛细管电泳检测之后，与等位基因分型标准物比对，可快速准确的得出霍乱弧菌的分型。

说明书

技术领域

本发明涉及一种霍乱弧菌分子分型检测试剂盒，具体是涉及一种同时分析6个霍乱弧菌 VNTR基因座的荧光标记复合扩增系统及等位基因分型标准物，该系统可以应用于霍乱弧菌 的溯源。

背景技术

细菌性疾病一直危害着人类健康和畜牧业的健康发展，随着生活水平的提高、人口流动 的日渐频繁，食源性细菌引起的食品安全问题已成为全球共同面对的社会公共卫生问题。而 人口的增长、科技飞速发展、介入性医疗器械的普及等因素使得院内感染发生率持高不下， 成为目前临床最为棘手的难题。

细菌的鉴定、分型技术能够根据细菌的生化特征或基因组成，分析不同来源菌株间的关 系。它在了解细菌在人群中的传播动力学、查找食物中毒的感染源，以及判定院内感染的暴 发、寻找感染源和识别一些特殊的致病菌等方面有着重要的作用，所以成为流行病学调查的 有力工具。

霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病 之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属 于国际检疫传染病。霍乱弧菌分型检测的技术有很多，目前使用最多的检测技术是脉冲场凝 胶电泳检测（pulsed field gel electrophoresis，PFGE)，这种检测方法对操作人员要求极高， 操作繁琐，做不到自动化、高通量检测，所以推广不易，只有省级疾病预防控制中心区域中 心实验室的具分型监测能力。Heidelberg JF等在2000年，以菌株N16961为模板，完成了霍 乱弧菌全序列的测定，基因组序列Vibrio cholerae O1biovar El Tor str.N16961RefSeq Genome （Heidelberg JF,et al.DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio  cholerae.Nature2000Aug3），。

Jaran S.Olsen等(Olsen et al.Journal of Microbiological Methods78(2009)271–285)用 两个复合扩增体系扩增6个霍乱弧菌VNTR基因座，通过ABI310自动测序仪，对扩增结果 进行检测。数据分析结果表明，6个VNTR基因座分型结果与PFGE分型结果类似，具很好 的分型能力，并且操作更简便、快捷。多个VNTR复合扩增检测英文缩写为MLVA（multiple  locus VNTR analysis，MLVA）。

Yael Danin-Poleg等（Yael Danin-Poleg et al.Vibrio cholerae Strain Typing and Phylogeny Study Based on Simple Sequence Repeats Journal of Clinical Microbiology,Mar.2007,p.736– 746）对霍乱弧菌基因组的VNTR基因座进行了分析，其中9个VNTR基因座具多态性。

表1Yael Danin-Poleg等统计的霍乱弧菌VNTR基因座及多态性

通过网上比对及实际样本测试，发现Yael Danin-Poleg等确定的等位基因范围偏小，利用 原范围设计复合扩增体系，可能导致扩增产物大小的重叠，造成结果误判。

发明内容

本发明目的是提供一种利用VNTR基因座对霍乱弧菌进行荧光标记复合扩增并进行分型 的试剂盒，并解决现有技术中霍乱弧菌VNTR基因座等位基因范围偏小导致的扩增产物重叠 而会引起误判的问题。本发明选择了9个基因座中，多态性最高的6个VNTR基因座，根据 各基因座的等位基因序列，设计引物，从而使试剂盒具有良好的分型能力。技术方案是：

一种霍乱弧菌分析分型试剂盒，包括有如下霍乱弧菌的VNTR基因座所设计的引物： VC1650、VC0437、VC0147、VCA0171、VCA0283和VC1457。

进一步，为了使分型的结果不易出现误判，使各个基因座对应的等位基因都可以准确地 被检出，最好是要对各个基因座的引物进行分组标记，分组是：第1组，VC1650、VC0437； 第2组，VC0147、VCA0171；第3组，VCA0283、VC1457。

进一步，所述的各组使用不同的荧光色进行标记，更优是第1组用FAM标记，第2组用 HEX标记，第3组用TAMRA标记。

进一步，以上各基因座所对应的等位基因范围较大，为了避免在分型检测过程中的误判 断、提高准确率，需要优化设计引物。同种荧光标记的引物之间留有20多个碱基以上的间隔， 避免未知大小等位基因造成的扩增越界。优选的引物序列如下：

表2霍乱弧菌复合扩增引物，等位基因范围及产物范围

进一步，上述各个引物在最终的扩增体系中的最优选浓度是：

表3各个引物的优选浓度

进一步，所述的试剂盒中还包括有等位基因分型标准物。在本发明的试剂盒中，所述等 位基因分型标准物是由各个基因座的等位基因分型标准物混合而成；等位基因分型标准物是 指用于基因分型的已知序列的DNA片段群，是进行结果检测时分型的对照物，只要将等位 基因分型标准物与样本PCR扩增产物同步电泳，不同的实验室，不同的设备，不同的电泳方 法，均可得到一致的可重复性结果。在本发明试剂盒中，按各基因座分组的情况制备等位基 因分型标准物，利用各引物对该基因座对各等位基因进行扩增；PCR产物克隆；DNA测序证 实插入片段的大小和结构；按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后；混合并 调平衡所有的等位基因，使制备出的各个基因座的等位基因分型标准物等量，即各个基因座 的等位基因分型标准物的克分子量均相等，上述制备等位基因分型标准物的方法为本领域技 术人员所习知。

进一步，试剂盒中还包括有反应混合物10.0μL、热启动Taq酶0.5μL、sdH₂O补足至 25.0μL；所述的反应混合物中包括有：MgCl₂7.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM， dNTPs7.5mM，BSA2mg/ml。

有益效果

1、用一个体系同时检测6个霍乱弧菌VNTR基因座，分型效果与PFGE一致。

2、实验操作简便，结合自动化测序仪，可实现霍乱弧菌分型检测的自动化、高通量。

3、把发明首次提出了在细菌分型中使用等位基因分型标准物，利用软件，分型更简便、准确。

附图说明

图1是基因分型标准物的电泳图，各基因座等位基因对应表8的信息。

图2是霍乱弧菌菌株N16961的分型结果图。

图3实施例1中VCA0171之3号引物扩增失败样本测序结果（部分），划线区为非标记下游 引物的结合区域，其中用点标注的两个碱基为与引物不同的突变碱基。

具体实施方式

实施例1试剂盒的设计及扩增条件的确定

1.基因座的选择

选取多态性高的6个霍乱弧菌VNTR基因座，其等位基因的相关信息见表3。模板序列 下载，从NCBI genebank上下载了基因座序列，确定了序列重复区的位置。通过比对Genebank 中霍乱弧菌的相同基因座不同菌株的序列，确定了等位基因范围。结果如下：

表4基因座及等位基因信息

基因座 序列Genebank号 重复区位置 等位基因范围 VC1650 CP002555.1 1646667-1646729 2-14 VC0437 CP003330.1 466934-467328 2-24 VC0147 CP003330.1 137105-137159 2-17 VCA0171 CP003331.1 187738-187875 6-26 VCA0283 CP003331.1 303918-303989 3-30 VC1457 KF664581.1 2702-5730 2-15

2.复合扩增引物的设计

6个基因座分三组，每组两个基因座，一个重复区大的基因座与一个重复区小的基因座。 VCA1650与VC0437，VC0147与VCA0171，VCA0283与VC1457分别为一组。一大一小搭 配，分成三种荧光标记，使每种颜色的片段尽可能小。

在引物的设计的过程中，主要的原则是长度一般20-30bp，在oligo6软件中，Tm值在68～ 72℃之间，错配引发率小于150。引物自身避免形成二级结构发夹结构，标记设置在引物5’ 端等引物设计常规要求。

以VCA0171基因座为例，以OLIGO6软件自动搜索引物，设置搜索范围，Tm值范围在 68～72℃，从中选择错配引发率小、二聚体少的8对引物。经NCBI primer blast比对，剔除 引物结合区有突变的引物，余下3对引物，如下表：

表5VCA0171基因座的引物设计

引物由上海生工合成，单对引物做退火温度梯度扩增。

3.扩增参数的确定

扩增体系如下：

表6扩增体系组成

其中所述的Reaction Mix为MgCl₂7.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM， dNTPs7.5mM，BSA2mg/ml。

扩增热循环

（l）将PCR扩增管置于热循环仪上；

（2）选择下面推荐的程序进行扩增；

（3）扩增后的样品应避光保存；

表7扩增程序

同一样本，配置18管相同的扩增体系，分6组退火程序扩增，每组3管重复。其中退火 温度分别为54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃，其余步骤温度相同，做梯度测试。选择 从54℃～64℃扩增特异性、扩增效率都好的引物。其中1号引物对低温54～56℃会出现非特 异扩增。2号引物对虽然无非特异扩增，但是62℃以上会出现扩增峰变低，64℃扩增丢失。3、 4号引物温度梯度测试复合要求。进一步做更多样本测试时，3号引物对部分样本会出现扩增 丢失，经测序证明是模板在下游引物结合区有两个碱基突变，引物结合能力下降，导致扩增 丢失，测序结果见附图3。

重新进行引物设计，经过大量反复试验，找到如下4号引物，经温度梯度测试及大样本 测试，没有出现扩增丢失及非特异扩增。

表8VCA0171基因座的引物设计

其余5对引物设计及引物筛选如VCA0171的步骤。按单扩测试的引物浓度，配置成复合 扩增引物测试，最终确定了6对引物，退火温度容忍度、特异性均良好，并且相互间无非特 异扩增。在引物测试过程中，由于复合扩增体系中基因座数目较多，相互之间会有竞争影响， 因此各基因座的相对平衡控制难度加大，通过多次反复实验，调节引物浓度与配比，终达到 平衡，最终确定了各引物浓度。

各基因座序列及引物浓度如下：

表9各基因座对应的引物

同时合成了不带荧光标记的引物，用于产物测序验证。引物由上海生工合成。 按上述浓度，配置5×复合扩增引物，做温度梯度测试，扩增体系及扩增程序如下所示：

扩增体系加样：

表10扩增体系组成

组分 体积 Reaction Mix 10.0μL 基因组DNA 0.1～10μl含量为0.125～5ng 引物混合物 5.0μL 热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL sdH₂O 补足至25.0μL

扩增程序：

表11扩增程序

同一样本，配置18管相同的扩增体系，分6组退火程序扩增，每组3管重复。其中退火 温度分别为54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃，其余步骤温度相同，做梯度测试。测试 结果表明，在58～62℃退火时，扩增峰高最好，考虑各PCR仪控温温差，推荐用60℃退火。

优选的扩增参数和试剂盒组成分别如下所示：

表12试剂盒配配置组成

组分 体积 Reaction Mix 10.0μL 基因组DNA 0.1～10μl含量为0.125～5ng 引物混合物 5.0μL 热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL sdH₂O 补足至25.0μL

其中所述的Reaction Mix为MgCl₂7.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM，dNTPs 7.5mM，BSA2mg/ml。其中基因组DNA样品可以是菌液，也可以是提取DNA。

分型检测的步骤是：

（l）将PCR扩增管置于热循环仪上；

（2）选择表13的程序进行扩增；

表13热循环仪的扩增程序

（3）扩增后的样品应避光保存；

（4）扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔（0.5μl AGCU Marker SIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样数）＋（12μl去离子甲 酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与PCR产物，避免产生气泡。95℃变性3分钟， 冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；

（5）用片段分析软件GeneMapper分析步骤（4）中遗传分析仪检测收集的数据。电泳采用 多道或单道毛细管电泳。

根据以上引物设计、试剂盒组成以及扩增条件，对菌株N16961的检测。

霍乱标准菌株N16961购自美国菌种保藏中心（ATCC），菌液100℃沸水煮20分钟之后， 取1μl作为模板，用于扩增。

用片段分析软件GeneMapper分析步骤（4）中遗传分析仪检测收集的数据。扩增结果如 附图2。

对N16961菌株，分别用6对序列相同、不带标记的引物扩增，PCR产物送生工测序。 测序结果与N16961基因组序列(Vibrio cholerae O1biovar El Tor str.N16961RefSeq Genome) 结果一致，证明了结果的可靠性。

实施例2等位基因分型标准物的制备

对浙江省疾控收藏的霍乱弧菌菌株进行检测，挑选同一基因座，等位基因不同大小的样 本，下表为各基因座等位基因的组成：

表14等位基因信息

分别用VC1650,VC0437，VC0147,VCA0171,VCA0283和VC1457单基因座扩增引物（引 物浓度10μM）扩增。其中基因组DNA样品可以是菌液，也可以是提取DNA。

引物序列如下：

表15引物序列

A、扩增体系如下：

表16试剂盒配置组成

其中所述的Reaction Mix为MgCl₂7.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM，dNTPs 7.5mM，BSA2mg/ml。

B、扩增热循环

表17热循环仪的扩增程序

C、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔（0.5μl AGCU Marker SIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样数）＋（12μl去离子甲 酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与PCR产物，避免产生气泡。95℃变性3分钟， 冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；

D、分型分析

用片段分析软件GeneMapper分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据。

电泳采用多道或单道毛细管电泳。

E、根据检测峰高比例，峰高的少加，峰低的多加，把各等位基因扩增产物混合，组成等位基 因分型标准物。再次电泳检测，检测图如附图1。

F、每个等位基因的用相应的不带标记PCR引物扩增，扩增程序与表11相同，PCR产物送上 海生工测序，根据测序结果，确定等位基因重复数。

附图每个基因座下面所出的峰对应表14中的等位基因信息，不同基因座的等位基因无重 叠。

实施例3：19株菌株MLVA检测

菌株来源于浙江省疾控中心保存的霍乱弧菌菌种，随机抽取了不同时间收集的19株菌 株。这些样本，疾控中心以经典的PFGE方法分型，分成12种型，10-14号为同一种型，15、 16、17、19号为同一种型，其他的菌种为唯一型。

按实施例1的实验体系、扩增程序，检测方法检测，19株菌株分型结果如下：

表18菌株分型结果

从表中结果可见，19株菌分成17种型，其中实验编号12与13，17与19分别为相同的 型，显示了较好的分型能力。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  无锡中德美联生物技术有限公司

       浙江省疾病预防控制中心

<120>  一种霍乱弧菌分析分型试剂盒

<130>  无

<160>  12   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

gttttcggca tggctggata c                                                 21

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ctgagtgact gcattgggtt ct                                                22

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

cgttagcatc gaaactgctg                                                   20

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

tcacgccaga agctcacaac                                                   20

<210>  5

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

acgtgcaggt tcaaccgtg                                                    19

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

ggatactcaa acgcaggatg aac                                               23

<210>  7

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

atttgaggga tttgctgatg ag                                                22

<210>  8

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

tcgttactat gccaaagatt acca                                              24

<210>  9

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

gaaatatctg tagcctcctc agaagt                                            26

<210>  10

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  10

tttgtgtacc atcttgagtt tctttg                                            26

<210>  11

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

ataatgctcc ctttgtttaa cagaa                                             25

<210>  12

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  12

ggtttaccga taaaaacaga aaatgata                                          28