一种植物组培外植体抗褐化消毒剂

摘要

本发明公开了一种植物组培外植体抗褐化消毒剂，属于农林领域的植物组织培养技术。包括以还原性杀菌剂代替常规的氯化汞或次氯酸钠进行外植体表面消毒的方法。组培外植体经流水冲洗后，乙醇溶液瞬间消毒，然后分别以四羟甲基硫酸磷和2-苄基-4-氯苯酚溶液先后浸泡外植体。较之传统的外植体消毒剂，本发明采用的还原性杀菌剂高效广谱，对植物细胞作用温和，对外植体消毒同时抑制褐化，提高外植体预处理效率，降低组培外植体死亡率，操作简便，对人安全，环境友好，便于推广应用。

说明书

技术领域

本发明属农林领域的植物组织培养技术，具体涉及组培外植体消毒与抗褐化方法。

技术背景

植物组织培养技术种苗生产、脱除病毒、种质改良等具有广阔的市场前景。目前植物 组织培养技术环节还存在不少问题，外植体污染的防治是组织培养成功的主要难点。常规 的外植体消毒方法是先用70％酒精浸泡10-30s，以无菌水冲洗2-3次，0.1％氯化汞浸 8-12min或用2％次氯酸钠(饱和次氯酸钙溶液)浸泡15-20min。氯化汞虽然消毒效果好， 但常温下微量挥发，可渗透皮肤，对人毒性极强，致死量为0.05克，对环境危害大，2013 年10月中国签署《水俣汞污染防治公约》，汞制剂的生产应用将更加严厉控制。次氯酸钠 (钙)放出活性氯离子从而杀死菌体，消毒效果较氯化汞差，产生的氯气对人体刺激大， 有毒，次氯酸钠溶液氧化性很强，对植物材料有较大的破坏致死作用。此外，使用抗生素 消毒，杀菌范围窄，抗生素溶液需过滤除菌，植物易产生抗药性，也易引起材料生理变异。

目前组培外植体消毒仍然首选氯化汞和次氯酸钠。不含汞或次氯酸钠(钙)的外植 体消毒剂专利《苔藓植物作为植物外植体消毒剂的用途、及该消毒剂组合物及其制备方法 和使用方法》(公布号：101632392)，消毒剂成分为苔藓植物提取液，还包括渗透剂、稳 定剂和助溶剂，但消毒剂原材料并不普及，提取程序繁琐，成本高，可能将限制该发明的 广泛推广应用。专利《外植体的表面灭菌方法》(公布号：101461329)用酒精、溴水前后 消毒外植体，溴水对植物有较强氧化损伤，消毒效果一般，并非首选消毒剂。而其他关于 外植体消毒剂专利仍使用氯化汞或次氯酸钠，如公布号1628507A、101138317A、102326514 A、101946809A。

外植体褐化也是组织培养成功的三大障碍之一，克服外植体褐化的方法主要有：(1) 选择适当的外植体采集季节和部位。(2)抗氧化剂浸泡外植体。(3)培养基添加抗氧化剂、 抗氧化酶活性促进剂和酚类(色素)物质吸附剂。(4)培养物多次转移到新鲜培养基。其 中(2)和(3)普遍采用的抗氧化剂主要有抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸、亚硫酸盐。增 强植物外植体内抗氧化酶活性的物质油菜素内酯，酚类(色素)物质吸附剂有聚乙烯吡咯 烷酮或活性炭。如专利公布号CN103250645A、CN102986534、CN102986533、CN103004754 A、CN102805032A、CN102823490A、CN102577953A、CN103125380A、CN102318560 A、CN102860255A、CN102115727A。

较有特色的抑制褐化专利有：公布号CN103202233A《一种蝴蝶兰防褐化组培方法 及防褐化培养基》在初代培养和增殖分化培养中将金盏花、柠檬、西红柿、迷迭香等提取 液添加到相应的培养基中。CN103004602A《一种抑制山核桃外植体褐化的方法》儿茶素 应用到培养基中。CN102870677A《一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化 的方法》培养基应用稀土化合物包括镧、铈、钕、镨、钐的硝酸盐和氧化物。CN101148653 《抑制兰属植物组织培养褐变发生的方法》将外植体消毒后用赤霉素和／生长素浸泡，诱 导不定芽在培养基加入6-BA，4-PU或TDZ.CN1737142《一种防止植物愈伤组织褐化现 象产生的方法》在继代培养基添加多胺(精胺或亚精胺)，黑暗培养，培养瓶定期气体交 换。CN1742564《一种牡丹组培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法》采用的MS培养基取 1／2-1／3微量元素，Ca²⁺加倍，CaCl₂与CaNO₃的摩尔比为1∶1。

目前植物组培外置体消毒首选氯化汞或次氯酸钠(钙)，对外植体有较大毒副作用， 对人体有毒，危害环境，外植体消毒杀菌和抗褐化是分步进行的，效率低下。急需研发杀 菌广谱高效，对植物药害小，对人体安全，环境友好，操作方便，价格便宜的新型消毒剂。

发明内容

本发明解决的是目前植物组织培养外植体消毒剂对人体有毒，严重污染环境及对植物 培养物伤害大的技术问题。由于还原性物质对植物细胞作用温和，损伤小，还能抑制外植 体切口酚类物质被氧化成有毒物质(醌类)，从而保护植物细胞，所以采用还原性高效杀 菌剂具有对组培外植体消毒的同时抑制褐化，提高成活率的双重功效。本发明公布了抗褐 化消毒剂的成分、配制方法和使用方法。

一种植物组培外植体抗褐化消毒剂及消毒方法，其特征在于，所采用的抗褐化消毒 剂四羟甲基硫酸磷(THPS)，分子式[P(CH2OH)₄]₂SO₄，能较快杀灭病原(细)菌，为环保 型室内空气消毒、水处理杀菌剂，而且其具有较强的还原性，在环境中能很快地被氧化成 毒性极低的THPO，可直接排放(张静，黄种买.一种新型环境友好杀生剂-四羟甲基硫酸磷. 工业水处理，2004，24(11)：13-15；智建辉，汤斌，李莉芳等.四羟甲基硫酸膦的室内 空气消毒效果与毒性.环境与健康杂志，2007，24(3)：156-158；杨文忠，绿色水处理化 学品.精细与专用化学品2007.15(23)：17-19；扬巍编译.新型环境友好杀菌剂四羟甲基 硫酸鳞(THPS).磷酸盐工业，2003(2)10-7)。

本发明公布的另一抗褐化消毒剂2-苄基-4-氯苯酚，C13H11ClO，酚类消毒剂，还 原性强，对真菌、细菌有较好灭杀作用，可用作农药、医药中间体。是美国环保署通告允 许可用于与食品接触表面清洁剂的组分，也是美国FDA批准可用于食品加工机械和容器消 毒的组分，环境友好，在水中降解性达到94％以上(韩海军，焦家俊.2-苄基-4-氯-苯 酚的合成工艺研究.甘肃石油和化工，2006(2)：15-18；马忠华，张佳燕，聂进.三 氟甲基磺酸锌催化选择性合成2-苄基-4-氯苯酚.应用化学，2010，27(3)：304-307)。

本发明提供的技术方案如下：

所述的抗褐化消毒剂四羟甲基硫酸磷直接溶解于水，配成浓度0.5-1.0％水溶液。2- 苄基-4-氯苯酚溶解于无水乙醇和吐温-20，与乙醇、吐温-20重量(g)体积(ml)比为1∶ 3∶5，然后溶解于水，2-苄基-4-氯苯酚使用浓度0.5％。

本发明提供的技术方案还包括消毒剂组合应用于外植体消毒的使用方法。常规方法 取得外植体，经流水冲洗后，75％乙醇液浸泡10-60秒，经本发明的四羟甲基硫酸磷浸泡 60-90分钟，期间多次搅拌或震荡，无菌水漂洗3次，2-苄基-4-氯苯酚溶液浸泡30-60 分钟，期间多次搅拌或震荡，无需无菌水漂洗，使残留在外植体的药剂可继续发挥作用， 只用滤纸吸干外植体表面溶液，就可常规接种。

本发明的有益效果在于：以还原性高效杀菌剂浸泡外植体，对真菌、细菌有较快杀灭 作用，可降低外植体污染率，也可降低褐化率，提高成活率，该药剂使用浓度下无气味， 对人体无害，环境友好，成本低廉，适宜在植物组织培养技术领域推广。

具体实施方式

实施例一

蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)叶切块流水30冲洗分钟以上，75％乙醇30秒钟，无 菌水洗涤2次，分别用以下方法浸泡消毒(1)2％次氯酸钠浸泡30分钟，无菌水漂洗3次。 (2)0.1％氯化汞浸泡8分钟，无菌水漂洗5次。(3)0.5％四羟甲基硫酸磷溶液浸泡60分钟， 无菌水漂洗3次后，0.5％的2-苄基-4-氯苯酚溶液浸泡30分钟，无需无菌水漂洗，滤纸 吸干表面溶液，直接接种。培养基成分1／2MS+6-BA5mg/L+NAA0.2mg/L+椰子汁20％ (V／V)。每瓶接种6个外植体，每次5瓶，重复3次。接种后在25℃、1500lux光下培养， 光照12h／d。

蝴蝶兰外植体培养29天后，以本发明消毒剂和0.1％氯化汞消毒污染率最低，都为0， 次氯酸钠消毒的有少量污染。本发明消毒剂处理的褐化率比次氯酸钠消毒的低，比用氯化 汞低很多，见表1，所以本发明消毒剂在蝴蝶兰叶片消毒有应用优势，是适宜消毒剂。

表1蝴蝶兰叶切块外植体各消毒方法效果观察*

*褐化的外植体指褐化面积超过外植体面积一半以上的外植体。褐化率以未污染外植体观测统计。

实施例二

米兰(Aglaia odorata)有节茎段，流水冲洗2小时，75％乙醇30秒钟，无菌水洗涤 2次，分别用以下方法浸泡消毒(1)2％次氯酸钠浸泡30分钟，无菌水漂洗3次。(2)0.1％ 氯化汞浸泡12分钟，无菌水漂洗5次。(3)1％四羟甲基硫酸磷溶液浸泡60分钟，无菌水 漂洗3次，0.5％的2-苄基-4-氯苯酚溶液浸泡60分钟，无需无菌水漂洗，滤纸吸干表面 溶液，直接接种。(4)0.5％四羟甲基硫酸磷溶液浸泡60分钟，无菌水漂洗3次，0.5％的 2-苄基-4-氯苯酚溶液浸泡40分钟，无需无菌水漂洗，滤纸吸干表面溶液，直接接种。

外植体接种培养基成分MS+6-BA2mg／L+NAA0.2mg／L。每瓶接种6个外植体，每次 5瓶，重复3次。接种后在25℃、1500lux光下培养，光照12h／d，结果见表2。

表2米兰有节茎段外植体各消毒方法效果观察*

*褐化的外植体指褐化面积超过外植体面积一半以上的外植体。褐化率以未污染外植体观测统计。

米兰外植体培养30天后，1.0％四羟甲基硫酸磷+0.5％2-苄基-4-氯苯酚处理污染率比 氯化汞稍低，褐化率显著降低，优于氯化汞使用效果，推荐使用。次氯酸钠、0.5％四羟 甲基硫酸磷+0.5％2-苄基-4-氯苯酚处理污染率太高，不以推荐。