一种铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液及在ELISA中的应用

摘要

本发明涉及一种铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液及在ELISA中的应用。所述铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液，含有由圆柱状金纳米棒内核、包覆于所述圆柱状金纳米棒内核外表面的岛状铂基合金结构及包被于所述圆柱状金纳米棒内核外表面的抗体或抗原构成的金核-铂基合金-抗体或抗原复合结构。本发明的铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液应用于ELISA对抗体或抗原的检测响应范围宽、灵敏度高，检测限能够达到pg/mL的水平。尤其是使用金核/铜铂合金壳纳米棒时，可以实现结合位点与催化位点的分离，共存的蛋白对纳米结构的催化活性没有明显的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及铂基合金结构的纳米棒及其应用，尤其涉及一种铂基合金结构 的纳米棒模拟酶溶液及在ELISA中的应用。

背景技术

酶联免疫分析（ELISA）是一种被广泛认可的强有力的检测蛋白的方法。该 方法具有高灵敏度及标准的操作程序，通常使用辣根过氧化物酶（HRP）标记 的免疫试剂产生信号来检测目标分子。尽管具有方法多样及灵敏度较高等优点， 但其也有一些缺点。比如需要大量昂贵的蛋白、对扩散控制的反应需要很多步 孵化及需要很多清洗步骤等。过去的这些年里，人们主要致力于ELISA如何提 高检测范围，增加灵敏度及特异性识别等的研究。

纳米颗粒参与的ELISA有以下几种方式。纳米颗粒连接生物分子后可以为 传统的ELISA提供更有趣的工具。一方面，由于纳米颗粒的比表面积较大，可 以为识别抗体或者HRP提供更多的连接位点，从而实现信号的放大（Anal.Chem. 2013,85,6228-6232）。另一方面，在等离激元ELISA中，纳米颗粒可以作为显 色底物。这主要是由于等离激元纳米颗粒的尺寸变化（包括团聚）会带来颜色 的改变，基于这一理念，前列腺特异抗原（prostate specific antigen，PSA）和 HIV-1衣壳抗原p24在全血中的检测限可低至1×10^-18g·mL^-1（Nat.Chem.2012,7, 821-824）。另外，纳米颗粒自身具有类过氧化物酶活性，可以直接取代传统ELISA 中的HRP。

近些年来，Fe₃O₄、CeO₂和Pt等纳米颗粒相继发现具有类氧化物酶和类过 氧化物酶活性，可以取代传统ELISA中的HRP，实现对目标分子的高灵敏度检 测。如利用Fe₃O₄的类过氧化物酶活性设计的多种免疫检测方法，可以实现对乙 肝病毒表面抗原和肌钙蛋白的检测（Nat.Nanotechnol.2007,2,577-583）。在前期， 对金核/铂壳纳米结构（AuPt）类过氧化物酶活性的研究发现，其可以取代传 统ELISA中HRP实现对小鼠白介素高灵敏度的检测（Biomaterials,2011,32, 1139-1147）。

然而，目前对铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液作为类过氧化物酶取代 HRP在ELISA中的检测尚缺乏深入研究和报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液及在ELISA 中的应用，所述铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液对抗体或抗原的检测响应范 围宽、灵敏度高，检测限能够达到pg/mL的水平。

为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

在第一方面，本发明提供一种铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液，含有由 圆柱状金纳米棒内核、包覆于所述圆柱状金纳米棒内核外表面的岛状铂基合金 结构及包被于所述圆柱状金纳米棒内核外表面的抗体或抗原构成的金核-铂基合 金-抗体或抗原复合结构。

本发明的铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液中含有的金核-铂基合金-抗体 或抗原复合结构含有三部分结构：作为内核的圆柱状金纳米棒；作为催化中心 的岛状铂基合金结构，其包覆于所述圆柱状金纳米棒内核外表面，尤其是所述 圆柱状金纳米棒内核外表面的头部部分；和作为免疫结合位点的抗体或抗原， 其包被于所述圆柱状金纳米棒内核外表面。上述结构的复合结构由于圆柱状金 纳米棒内核的比表面积大，为免疫反应提供更多的结合位点，因此信号的放大 效应明显；岛状铂基合金结构具有类似于HRP等的酶促活性，能够实现模拟酶 特性的ELISA反应。

作为本发明的优选，所述铂基合金结构的纳米棒选自金核/铂壳纳米棒、金 核/铜铂合金壳纳米棒、金核/铂钯合金壳纳米棒和金核/银铂合金壳纳米棒中的 一种或多种；更优选为金核/铜铂合金壳纳米棒，其中铜铂主要在圆柱状金纳米 棒内核的两端呈岛状沉积，而抗体或抗原主要包被于所述圆柱状金纳米棒内核 两端之间的棒体外表面。

本文中，其它部分金核/铂壳纳米棒又称作“金核/铂纳米岛壳结构的纳米 棒”，金核/铜铂合金壳纳米棒又称作“金核/铜铂合金纳米岛壳结构的纳米棒”， 本领域的技术人员能够理解其含义是相同的。

当使用金核/铜铂合金壳纳米棒时，可以实现结合位点与催化位点的分离，共 存的蛋白对纳米结构的催化活性没有明显的影响。

在第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的铂基合金结构的纳米棒 模拟酶溶液的方法，包括：

（1）将铂基合金结构的纳米棒溶液与表面活性剂混合摇匀，放置至少3小 时后离心，得到表面带负电的铂基合金结构的纳米棒沉淀，弃上清并重悬；

（2）在步骤（1）重悬所得的溶液中加入包被缓冲液及抗体或抗原，混合 均匀后恒温孵育，然后离心去除游离的抗体或抗原，得到抗体或抗原修饰的铂 基合金结构的纳米棒，重悬得到所述铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液。

其中，步骤（1）中用表面活性剂处理主要是为增加纳米棒在缓冲溶液中的 稳定性，也为降低生物毒性。所述表面活性剂溶液可以是聚苯乙烯磺酸钠 （PSS）、聚乙烯亚胺（PEI）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚二烯丙基二甲基 氯化铵（PDDAC）中的一种或多种，优选为聚苯乙烯磺酸钠（PSS）。

其中，所述步骤（1）中可以用去离子水或包被缓冲液重悬沉淀，优选用去 离子水重悬沉淀。

优选地，所述步骤（1）中重悬所得的溶液中表面带负电的铂基合金结构的 纳米棒浓度为0.1-5nM，例如0.2nM、0.3nM、0.5nM、0.8nM、1nM、2nM、 3nM、4nM或5nM，更优选为2nM。

优选地，所述步骤（2）中包被缓冲液选自含牛血清蛋白（BSA）的缓冲溶 液；其中，缓冲溶液可以是三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫 磺酸（HEPES）缓冲液和磷酸（PBS）缓冲液中的一种或者多种，更优选为三羟 甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。

优选地，所述步骤（2）中恒温孵育的温度为37℃，当然也可以是其它适合 温度，比如25℃、30℃、35℃、40℃、35-39℃或33-38℃等。

优选地，所述步骤（2）中恒温孵育的时间为15-120min，例如18min、 20min、25min、30min、45min、60min、80min、100min或110min，更优选为 30min。

优选地，所述步骤（2）中抗体为羊抗人IgG、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG和 小鼠白介素抗体中的一种或者多种，更优选为羊抗人IgG。

优选地，所述步骤（2）中相对于0.1-5pmol表面带负电的铂基合金结构的 纳米棒，抗体的加入量为0.5-10μg。其中，表面带负电的铂基合金结构的纳米 棒可以从0.1-5pmol，例如0.2pmol、0.5pmol、0.8pmol、1pmol、1.2pmol、 2pmol、3pmol、3.2pmol、3.8pmol、4.5pmol或4.8pmol中选择；抗体可以从 0.5-10μg，例如0.5μg、0.7μg、0.9μg、1.2μg、1.5μg、2μg、4μg、6μg、8μg或 9μg中选择。当然，本领域的技术人员能够理解表面带负电的铂基合金结构的 纳米棒和抗体的用量并非仅限于上述数值范围，也可以在上述比例的基础上适 当扩大或者缩小。

更优选地，所述步骤（2）中相对于2pmol表面带负电的铂基合金结构的纳 米棒，抗体的加入量为5μg。

在第三方面，本发明提供一种使用如第一方面所述的铂基合金结构的纳米 棒模拟酶溶液检测抗原或者抗体的方法，包括：

（1）将抗体或抗原包被的铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液加入抗原或抗 体包被的微孔板中，孵育后用缓冲溶液进行清洗；

（2）然后加入含有显色底物的磷酸-柠檬酸缓冲溶液进行反应；

（3）最后加入终止液终止反应，并使用酶标仪监测其吸光度的变化。

优选地，所述步骤（1）中的微孔板为96孔的微孔板；96孔的微孔板是 ELISA中最常用的微孔板，但是也不排除其它微孔板用于本发明的情况。

优选地，所述微孔板上的抗原选自能与所述铂基合金结构的纳米棒上的抗 体免疫识别的人IgG、鼠IgG、兔IgG和小鼠白介素抗原中的一种或者多种，更 优选为人IgG。

优选地，所述步骤（1）中孵育的温度为4-44℃，例如5℃、7℃、9℃、 10℃、12℃、13℃、15℃、20℃、25℃、28℃、32℃、35℃、40℃、42℃或 43℃，更优选为37℃。

优选地，所述步骤（1）中孵育的时间为30-360min，例如40min、60min、 100min、150min、180min、210min、240min、280min、300min、320min、40-120min、 50-300min或120-280min，更优选为240min。

优选地，所述步骤（1）中模拟酶溶液的加入量为75-200μL，例如80μL、 90μL、100μL、120μL、130μL、150μL、170μL或190μL，更优选为100μL。

优选地，所述步骤（2）中显色底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、2,2’- 联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）或邻苯二胺（OPD），更 优选为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）或2,2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸）二胺盐（ABTS）。

优选地，所述步骤（2）中磷酸-柠檬酸缓冲溶液的pH为3-6，例如3.2、3.5、 3.7、3.9、4.2、4.5、4.8、5.2、5.4、5.6、5.8、3.5-5或3.8-5.5，更优选为4.2。

优选地，所述步骤（2）中反应的时间为10-30min，例如12min、15min、 18min、21min、24min、26min或28min，更优选为20min。

优选地，所述步骤（2）中终止液为硫酸溶液或十二烷基磺酸钠（SDS）溶 液，其中硫酸溶液的浓度可以是1.5M、2M或3M，十二烷基磺酸钠溶液的质量 浓度可以是0.1%、0.5%、1%或2%。

在第四方面，本发明提供如第一方面所述的铂基合金结构的纳米棒模拟酶 溶液在酶联免疫分析中的应用。

作为本发明的优选，所述铂基合金结构的纳米棒为金核/铜铂合金壳纳米 棒，其中铜铂主要在圆柱状金纳米棒内核的两端呈岛状沉积，而抗体或抗原主 要包被于所述圆柱状金纳米棒内核两端之间的棒体外表面。

本发明的有益效果为：本发明的铂基合金结构的纳米棒模拟酶溶液中含有 金核-铂基合金-抗体或抗原复合结构，其中铂基合金作为催化中心类似于HRP 酶；本发明的模拟酶溶液对抗体或抗原的检测响应范围宽、灵敏度高，检测限 能够达到pg/mL的水平。尤其是使用金核/铜铂合金壳纳米棒，以ABTS为底物 时，检测限为90pg/mL，以TMB为底物时，检测限比90pg/mL更低。此外，使 用金核/铜铂合金壳纳米棒时，可以实现结合位点与催化位点的分离，共存的蛋 白对纳米结构的催化活性没有明显的影响。本发明所提供的方法简单易操作、 重复性高，所使用的纳米颗粒成本低廉、易于制备。

附图说明

图1是本发明实施例1所制备的金核/铂壳（AuPt）（a）与金核/铜铂合金 壳（AuPtCu）（b）纳米颗粒的透射电子显微镜照片及相应的紫外可见吸收谱 图（c），其中Au NRs表示金纳米棒，曲线（I）、（II）和（III）分别代表AuPt、 AuPtCu和Au NRs紫外可见吸收谱。

图2是本发明实施例2中AuPt纳米棒和AuPtCu纳米棒作为类过氧化 物酶的底物浓度与催化氧化反应速度的关系，以及利用双倒数法求得的米氏常 数。

图3是本发明实施例4中蛋白存在的情况对AuPt纳米棒和AuPtCu纳 米棒催化的TMB氧化速度的影响，其中（a）显示共存的蛋白会明显降低AuPt 的催化活性，AuPt+0.05%BSA表示有0.05%BSA共存的情况，AuPt+对照表 示没有蛋白共存的情况；（b）显示共存的蛋白对AuPtCu带来的影响几乎可以 忽略，AuPtCu-对照表示没有蛋白共存的情况，AuPtCu抗体+0.05%BSA表 示有抗体和0.05%BSA共存的情况，AuPtCu+0.05%BSA表示有0.05%BSA共 存的情况。

图4是本发明中AuPtCu纳米棒的结构示意图，及其参与的ELISA反应 过程示意图。

图5是本发明实施例6和7中以TMB（a）和ABTS（b）为底物时，得到 的吸光度和待测蛋白浓度之间的关系。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将 会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因 而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各 种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或 改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无 特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化 试剂厂商购买得到的。

以下实施例中，所述试剂如下所示：十六烷基三甲基溴化铵（CTAB， Amresco），氯铂酸钾（K₂PtCl₄,，Alfa），氯化铜（CuCl₂，Alfa），抗坏血酸（AA， Alfa），聚苯乙烯基磺酸钠（PSS，Alfa），羊抗人IgG（ZSGB-Bio），人IgG （ZSGB-Bio），HRP标记的羊抗人IgG（Bioss），3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB， Alfa），2,2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS，Alfa）。

测试仪器有：酶标仪（Infinite ^TM M200），Varian Cary50，TEM（Tecnai G²20 S-TWIN），Delsa Nano C（Beckman Coulter）。

实施例1：金核/（铜）铂合金纳米岛壳结构的纳米棒的制备纯化

本发明中所述金核/（铜）铂合金纳米岛壳结构的纳米棒可以用本领域技术 人员所熟知的方法获得。在本发明中，我们使用金纳米棒为种子，通过还原剂 还原Pt或者Pt和Cu的共沉积实现纳米结构的制备。

金核/铂纳米岛壳结构的纳米棒（AuPt）的制备：取1mL纯化的金纳米棒 溶液，依次加入75μL的2mM的K₂PtCl₄溶液，22.5μL的0.1M的AA溶液，混 合均匀后放置在30℃水浴中反应半小时，之后加入0.5mL的0.1M的CTAB溶 液，于12000rpm下离心5分钟一次，沉淀分散在去离子水中备用。

金核/铜铂合金纳米岛壳结构的纳米棒（AuPtCu）的制备：取1mL纯化金 纳米棒溶液，依次加入75μL的2mM的K₂PtCl₄溶液，40μL的10mM的CuCl₂溶液，22.5μL的0.1M的AA溶液，混合均匀后放置在30℃水浴中反应半小时， 之后加入0.5mL的0.1M的CTAB溶液，于12000rpm下离心5分钟一次，沉淀 分散在去离子水中备用。

AuPt和AuPtCu纳米棒的TEM形貌图及相应的紫外可见吸收图如图1 所示。从图1（a）可以看出，Pt在金纳米棒表面呈岛状生长模式；引入Cu后， Cu和Pt的共沉积仍然保持岛状生长，不同的是，这些岛主要是沉积在棒的两端 （b）。另外，Pt的沉积和Pt与Cu的共沉积都会导致局域等离激元共振峰（LSPR） 产生红移（c）。

实施例2：酶动力学参数分析

通过监测TMB氧化产物吸收峰吸光度的变化来考察其反应动力学。使用 Varian Cary50动力学模式，每隔0.1min间隔测量一次。测试条件为：AuPt 或者AuPtCu纳米棒的浓度为15pM，2.4mL的0.1M的pH4.5的磷酸缓冲溶液， 反应温度设定为30℃。当以TMB为底物时，H₂O₂的浓度固定在2mM；当以 H₂O₂为底物时，TMB的浓度固定在0.13mM。表观动力学参数从Lineweaver-Burk 方程：1/V=(K_m/V_max)(1/[C])+1/V_max获得。其中，V是反应速度，V_max是最大反 应速度，[C]是底物浓度，K_m是米氏常数。

得到的动力学参数如表1和图2所示。

表1AuPt和AuPtCu纳米棒作为类过氧化物酶的表观动力学参数

其中，K_cat=V_max/[E]，[E]是酶的浓度，K_cat是催化剂常数。

酶催化反应动力学可用方程（1）描述：

K_m＝((k_-1+k₂)/k₁)

$V=k_2\left[E_0\right]\times \frac{\left[S\right]}{K_m+\left[S\right]}=V_{\max }\times \frac{\left[S\right]}{K_m+\left[S\right]}$

在此，K_m是由k_-1、k₁和k₂决定。对纳米颗粒模拟酶来说，表面包覆和k₂对表观K_m都有贡献。从表1可以看出，以TMB为底物时，AuPtCu纳米棒有 较大的K_m和V_max；以H₂O₂为底物时，AuPtCu纳米棒有较小的K_m和较大的 V_max，K_m的降低主要来源于k₁的增加，说明Pt和Cu形成合金后，其对电子结 构带来的变化会影响对底物的亲近性，对H₂O₂的亲和力增强。

实施例3：金核/（铜）铂合金纳米岛壳结构的纳米棒表面进行羊抗人IgG 抗体修饰

取1mL纯化一次的原始CTAB包覆的金核/（铜）铂合金壳纳米结构溶液， 加入50μL的20mg/mL的PSS溶液，混合均匀后在室温下放置3h以上，之后于 12000rpm下离心5分钟一次，沉淀分散在200μL去离子水中备用，纯化后合金 纳米棒的浓度约为2nM。

取1mL纯化的PSS包覆的2nM合金纳米棒溶液，分散在1mL含0.05%BSA 的Tris缓冲溶液（0.05M，pH8）中。加入5μL的1mg/mL羊抗人IgG溶液，混 合均匀后放入37℃恒温箱中，孵化30分钟之后，于8000rpm转速下离心5分钟 去掉游离的羊抗人IgG分子。倒掉上清液，将沉淀物分散在1mL含0.05%BSA 的Tris缓冲液（50mM，pH8）中备用。

实施例4：共存的蛋白对催化活性的影响研究

1mL TMB底物溶液（1mg/mL TMB的DMSO溶液溶解于9mL0.05M pH4.2 的磷酸-柠檬酸缓冲溶液中，并加入2μL30%H₂O₂）中，用去离子水稀释一倍后， 加入20μL2nM的AuPtCu纳米棒溶液，监测其氧化TMB的动力学变化。

向1mL TMB底物溶液中，加入20μL2nM的AuPtCu纳米棒溶液，5μL 1mg/mL羊抗人IgG溶液及0.05%BSA溶液，监测其氧化TMB的动力学变化。

向1mL TMB底物溶液中，加入20μL2nM的AuPtCu纳米棒溶液， 0.05%BSA溶液，监测其氧化TMB的动力学变化。

作为对比，我们对AuPt纳米棒溶液（含或不含0.05%BSA）也进行了氧 化TMB的实验。结果如图3所示。

从图3可以看到，共存的蛋白会明显降低AuPt的催化活性（图3（a））； 但是对AuPtCu来说，蛋白带来的影响几乎可以忽略，说明催化活性并未受到 抑制，这主要是由于蛋白倾向于吸附在纳米棒的侧面，而对AuPtCu来说，侧 面几乎没有催化位点，所以未受到影响。这一现象暗示AuPtCu具有实现催化 位点和结合位点分离的潜力。

表2是对不同包覆的AuPtCu纳米棒尺寸和zeta电位测量的数据。结果显 示PSS包覆的纳米棒（AuPtCu）带负电；与0.05%BSA孵化（AuPtCu0.05% BSA）后，纳米棒的表面电荷稍微增大；进一步与羊抗人IgG孵化 （AuPtCu0.05%BSA抗体），电荷会继续增加，说明纳米棒表面蛋白的存 在。

表2不同包覆的AuPtCu纳米棒的尺寸和zeta电位

实施例5：免疫识别反应

将透明、平底聚乙烯96孔板首先用0.05M pH7.4的PBS清洗。之后向孔中 分别加入100μL不同浓度的分散在0.05M pH7.4的PBS单抗人IgG溶液。其中 人IgG浓度范围从9pg到0.9μg，在4℃下孵化过夜。之后用50mM pH8的Tris  buffer（含0.05%Tween-20）清洗2次，最后用50mM pH8的Tris buffer再次清 洗。然后用1%BSA的Tris buffer于37℃封闭2小时。最后再用Tris buffer（0.05 M，pH8）清洗3次。然后向每个孔中加入100μL羊抗人IgG修饰的AuPtCu 纳米棒溶液，于37℃孵化4小时。之后用含0.05%Tween-20的Tris buffer（50mM， pH8）清洗，最后再用50mM pH8的Tris buffer清洗一次。

图4显示了本发明中AuPtCu纳米棒的结构示意图，及其参与的ELISA 反应过程示意图。可以看出，本发明中AuPtCu纳米棒参与的ELISA反应可 以实现结合位点与催化位点的分离。

实施例6：以TMB为显色底物时的检测反应

向实施例5的微孔板的每个孔中加入100μL TMB底物溶液（1mg/mL TMB 的DMSO溶液溶解于9mL0.05M pH4.2的磷酸-柠檬酸缓冲溶液中，并加入2μL 30%H₂O₂）。反应20分钟后加入25μL2M H₂SO₄终止反应，检测450nm处的吸 光度。整个实验设立了对比、阳性对比、阴性对比和空白对照。

结果如图5（a）所示，可以看出待测抗原和吸光度之间存在很好的指数关 系，响应范围为90pg/mL-9μg/mL，最低检测限要低于90pg/mL。

实施例7：以ABTS为显色底物时的检测反应

向实施例5的微孔板的每个孔中加入100μL ABTS的底物溶液（0.4mg/mL 溶于0.1M pH4.2的磷酸-柠檬酸缓冲液，含2μL30%H₂O₂）。反应20分钟后加入 100μL1%SDS终止液停止反应，检测405nm的吸光度。整个实验设置了对比， 阳性对比，阴性对比和空白对照。

结果如图5（b）所示，可以看出待测抗原和吸光度之间存在很好的指数关 系，响应范围为90pg/mL-9μg/mL，最低检测限为90pg/mL。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方 法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须 依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明 了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、 具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。