一种复方鳖甲软肝片的质量检测方法

摘要

本发明一种复方鳖甲软肝片的质量检测方法，属于中药分析技术领域。所述质量检测方法，包括对复方鳖甲软肝片中苷类成分的检测和对复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分的检测，两类成分的检测均包括供试品的制备以及对供试品进行高效液相色谱分析，将供试品的指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，指纹图谱的相似度应不小于0.8为正常品，小于0.8为次品。本发明具有重复性好，专属性强，操作简便，方法可靠，可以对复方鳖甲软肝片质量进行科学、有效地评价，同时，也能够运用于实际生产中质量控制；并且避免了因只测定制剂中一、二个化学成分而判定复方鳖甲软肝片质量的片面性，又为复方鳖甲软肝片质量评价提供了新的参考方法的优点。

说明书

技术领域

本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种复方鳖甲软肝片的质量检测方法，特 别是指纹图谱的检测方法。

背景技术

复方鳖甲软肝片是由鳖甲(制)、莪术、赤芍、当归、三七、党参、黄芪、紫河车、 冬虫夏草、板蓝根、连翘十一味药组成，该品种是完全拥有自主知识产权的独家品种， 是国内第一个预防、治疗慢性乙型肝炎肝纤维化以及早期肝硬化的药物，现已入选国家 基本医疗保险药品目录。目前已获得2项专利授权，一种治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的 中药制剂及其制备方法(专利号：ZL00105695.6)；外观设计专利(专利号：ZL99.3 10690.0)。复方鳖甲软肝片是国家中药保护品种，2009年完成了延长中药保护期申报工 作。复方鳖甲软肝片具有软坚散结、化瘀解毒、益气养阴的功能，可用于治疗慢性乙型 肝炎纤维化及早期肝硬化。

本方中鳖甲为君药，味咸性平，入肝，肾经，其既可软坚散结，又可滋阴潜阳，用 于肝纤维化的瘀血凝结、肝肾阴血已伤；当归、赤芍、三七三味为臣，以增强养血活血， 化瘀散结，助君药消瘕、去积聚、化痞块的作用，祛邪而不伤正；党参、黄芪健脾益气， 为佐药；冬虫夏草、紫河车益肾添精，为佐药；板蓝根、连翘清热解毒，为佐药；莪术， 其性苦、辛、温，入肝经血分，能引经报使，故为使药。

该复方制剂具有抗肝纤维化，主要对纤维化形成初期阶段、抑制FSCs增殖、减少胶 原蛋白的合成、降低胶原蛋白在Disse腔过量沉积、对已形成的肝纤维化亦具有一定的改 善作用。复方鳖甲软肝片中药制剂攻补兼施、标本兼顾，使热毒余邪得以清除，肝脾肾 三脏功能得以恢复，现于肝络之瘀血得以消散，达到扶正消症的目的，有软坚散结、化 瘀解毒、益气养阴的功效，有效率为81.67%，治愈率为55.23%。

中药，尤其是复方中药，其所含的任何一种成分都不能代表其整体疗效。复方鳖甲 软肝片是由11味药材组成的中药复方制剂，其中的化学成分比较复杂，药品质量控制一 直沿用2002年由SFDA颁布的国家药品标准(WS₃-127(Z-04)-2002(Z))。为进一步提高药品 质量标准，确保产品的质量可控，确保其安全性，很必要将其现有的质量控制模式过渡 到一种综合的、宏观的质量控制模式。

发明内容

中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分 的色谱或光谱的图谱。鉴于现阶段重要的有效成分绝大多数不明确的情况下，中药指纹 图谱技术已经成为中药复方质量控制与评价的重要手段。中药的质量一直是中药产业化 进程中的一个瓶颈问题，指纹图谱技术是欧美国家普遍采用的控制植物药中已知组分及 未知组分含量的技术手段。只针对产品中的一、二个化学成分进行测定是不能全面表征 和控制其质量，因此，除了用“微观分析”，还应该用某种“宏观分析”方法，从整体 上有效地表征产品质量。本发明采用指纹图谱对产品质量进行控制，但如何能从更宏观 的角度对复方鳖甲软肝片进行质量控制却未见报道。建立关于一种复方鳖甲软肝片的指 纹图谱检测方法将弥补该品种指纹图谱研究的空白，有利于提升复方鳖甲软肝片生产的 质量水平。

基于指纹图谱的质量检测方法具有重复性好，专属性强，操作简便，方法可靠等优 点，本发明将采取该质量控制模式对复方鳖甲软肝片进行相关质量控制。

本发明的目的在于公开了一种复方鳖甲软肝片的质量检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种复方鳖甲软肝片的质量检测方法，包括对复方鳖甲软肝片中苷类成分的检测和 对复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分的检测，其中对复方鳖甲软肝片中苷类成分的检测 包括以下步骤：

(1)、复方鳖甲软肝片供试品溶液的制备：取复方鳖甲软肝片，置容量瓶中，加甲醇 超声溶解，定容，即为供试品溶液；

(2)、测定：对供试品溶液用高效液相色谱仪进行测定，得到复方鳖甲软肝片中苷类 成分的指纹图谱，与标准指纹图谱进行比较，以确定产品质量；高效液相色谱仪的色谱 条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；采用梯度洗脱，其中流动相A为水溶液，流 动相B为乙腈溶液，检测波长200-280nm，流速0.8-1.2ml/min，柱温20-40℃，进样量 10-20ul；

对复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分的检测包括以下步骤：

(a)、复方鳖甲软肝片供试品溶液的制备：取复方鳖甲软肝片，置容量瓶中，加50% 甲醇超声溶解，定容，即为供试品溶液；

(b)、测定：对供试品溶液用高效液相色谱仪进行测定，得到复方鳖甲软肝片中虫草 核苷类成分的指纹图谱，与标准指纹图谱进行比较，以确定产品质量；高效液相色谱仪 的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；采用梯度洗脱，流动相A为水溶液， 流动相B为甲醇溶液，检测波长254-280nm，流速0.8-1.2ml/min，柱温20-40℃，进样 量10-20ul。

上述技术方案所述的复方鳖甲软肝片的质量检测方法，其中，检测步骤(2)的检测波 长为203nm，检测步骤(b)的检测波长260nm。

上述技术方案所述的复方鳖甲软肝片的质量检测方法，其中，对复方鳖甲软肝片中 苷类成分的检测步骤为：

(1)、复方鳖甲软肝片供试品溶液的制备：

取复方鳖甲软肝片，精密称定，置1～25ml容量瓶中，加甲醇1～25ml，超声处理30～ 60min，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为复方鳖甲软肝片的供 试品溶液；

(2)、测定：对供试品溶液用高效液相色谱仪进行测定，得到复方鳖甲软肝片中苷类 成分的指纹图谱，与标准指纹图谱进行比较，以确定产品质量；其中高效液相色谱仪的 色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用梯度洗脱，流动相A相为水 溶液，流动相B相为乙腈溶液，流速0.8～1.2ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，进 样量10～20μl；梯度洗脱程序如下：

0-10min，A相为90%-85%、B相为10%-15%；10-25min，A相为85%-80%、B相为15%-20%； 25-45min,A相为80%-70%、B相为20%-30%；45-55min,A相为70%-40%、B相为30%-60%； 55-65min,A相为40%-0%、B相为60%-100%；65-75min,A相为0%-90%、B相为100%-10%；

对复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分的检测步骤为：

(a)、复方鳖甲软肝片供试品溶液的制备：取复方鳖甲软肝片，精密称定，置1～25ml 容量瓶中，加50%甲醇1～25ml，超声处理30～60min，加50%甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为复方鳖甲软肝片的供试品溶液；

(b)、测定：对供试品溶液用高效液相色谱仪进行测定，得到复方鳖甲软肝片中虫草 核苷类成分的指纹图谱，与标准指纹图谱进行比较，以确定产品质量；其中高效液相色 谱仪的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用梯度洗脱，流动相A 相为水溶液，流动相B相为甲醇溶液，流速0.8-1.2ml/min，检测波长260nm，柱温25℃， 进样量10-20μl；梯度洗脱程序如下：

0～12min，A相为90%～84%、B相为10%～16%；12～45min，A相为84%、B相为16%。

上述技术方案所述的复方鳖甲软肝片的质量检测方法，其中，对复方鳖甲软肝片中 苷类成分的检测步骤为：

(1)、复方鳖甲软肝片供试品溶液的制备：取复方鳖甲软肝片，精密称定0.50g，置 10ml容量瓶中，加甲醇8～10ml，超声处理40min，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm微 孔滤膜，取续滤液作为复方鳖甲软肝片的供试品溶液；

(2)、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照步骤(2)下色谱条件进行 测定，得到复方鳖甲软肝片中苷类成分的指纹图谱，与标准指纹图谱进行比较，以确定 产品质量；其中高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂，采用梯度洗脱，流动相A相为水溶液，流动相B相为乙腈溶液，流速0.8～1.2ml/min， 检测波长203nm，柱温25℃，进样量10～20μl；梯度洗脱程序如下：

0min时，A相为90%，B相为10%；10min时，A相为85%，B相为15%；25min时，A 相为80%，B相为20%；45min时，A相为70%，B相为30%；55min时，A相为40%，B相 为60%；65min时，A相为0%，B相为100%；75min时，A相为90%，B相为10%；

对复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分的检测步骤为：

(a)、复方鳖甲软肝片供试品溶液的制备：称取复方鳖甲软肝片0.50g，置10ml容 量瓶中，加50%甲醇8～10ml，超声处理60min，加50%甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm 微孔滤膜，取续滤液作为复方鳖甲软肝片的供试品溶液；

(b)、测定：供试品溶液用高效液相色谱仪进行测定，得到复方鳖甲软肝片中虫草核 苷类成分的指纹图谱，与标准指纹图谱进行比较，以确定产品质量；其中高效液相色谱 仪的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用梯度洗脱，流动相A相 为水，流动相B相为甲醇，流速0.8-1.2ml/min，检测波长260nm，柱温25℃，进样量 10-20μl；梯度洗脱程序如下：

0～12min时，A相为90%，B相为10%；12～45min时，A相为84%，B相为16%；45min时， A相为84%，B相为16%。

上述技术方案所述的复方鳖甲软肝片的质量检测方法，其中，所述方法还包括建立 标准指纹图谱的步骤，包括：

(ⅰ)选取10批不同批次的复方鳖甲软肝片，按照权利要求4中的检测步骤进行高效液 相色谱指纹图谱分析，每个批次的药品获得2张不同波长下的指纹图谱，对HPLC指纹图谱 中所有峰进行比较，分别确定10个批次中相同波长下的共有峰；

(ⅱ)经对照品定性鉴定，确定各峰对应的物质，得到标准指纹图谱。

上述技术方案所述的复方鳖甲软肝片的质量检测方法，其中，对照品为芍药苷、人 参皂苷Rg1、人参皂苷Re、连翘苷、人参皂苷Rb1、尿苷、鸟苷和腺苷。

上述技术方案中任一技术方案所述的复方鳖甲软肝片的质量检测方法，其中，复方 鳖甲软肝片中苷类成分的指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，11个共有峰计算得到的相 似度应不小于0.8为正常品，小于0.8为次品；复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分的指纹 图谱与标准指纹图谱进行比较，4个共有峰计算得到的相似度应不小于0.8为正常品，小 于0.8为次品。本技术方案中的指纹图谱比较是根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版(国家药典委员会)进行比较的。

本发明的优点如下：

(1)、本发明建立复方鳖甲软肝片的HPLC指纹图谱，能有效地表征复方鳖甲软肝片的 质量，从而实现对复方鳖甲软肝片最大程度的化学成分检测，有利于对中药质量的全方 面监测。

(2)、本发明选用两个不同的色谱条件建立了复方鳖甲软肝片种不同物质的指纹图 谱。

(3)、本发明采用两种不同的样品前处理方法和色谱条件，利用二极管阵列检测器的 多波长测定的优点，分别建立了2张HPLC指纹图谱分别表达了复方鳖甲软肝片中苷类成分 的分布和复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分的分布。通过大量实验，本发明已对指纹图 谱的色谱条件进行了各方面的优化，包括确色谱柱、流动相种类、流动相比例、检测波 长及柱温等色谱条件。

(4)、本发明对10批样品的指纹图谱进行相似度评价，发现相似度在0.8-1.0之间。 该结果说明本方法，重复性好，专属性强，操作简便，方法可靠，可以对复方鳖甲软肝 片质量进行科学、有效地评价，同时，也能够运用于实际生产中质量控制。

(5)、该发明为复方鳖甲软肝片的指纹图谱质量控制提供了条件，避免了因只测定制 剂中一、二个化学成分而判定复方鳖甲软肝片质量的片面性，又为复方鳖甲软肝片质量 评价提供了新的参考方法。

附图说明

1、图1为复方鳖甲软肝片的标准HPLC指纹图谱，A为203nm，B为260nm。

对照品定性，其中，1号峰为芍药苷，6号峰为人参皂苷Rg1，7号峰为人参皂苷Re，8 号峰为连翘苷，11号峰为人参皂苷Rb1，12号峰为尿苷，14号峰为鸟苷，15号峰为腺苷。

2、图2为复方鳖甲软肝片样品的指纹图谱，A为203nm，B为260nm。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种复方鳖甲软肝 片的质量检测方法作进一步的说明。

一、仪器与试剂

仪器：BSA-124S精密电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；岛津LC-20AT高效液 相色谱仪(含在线脱气机，四元梯度泵，自动进样器，DAD检测器)；

试剂：色谱甲醇(Oceanpak,Sweden)、色谱乙腈(Oceanpak,Sweden)，水为重蒸水， 其余试剂均为分析纯；

成品：复方鳖甲软肝片，来源：内蒙古福瑞制药有限责任公司

对照品：芍药苷(中国药品生物制品检定所)；连翘苷(中国药品生物制品检定所)； 人参皂苷Rg1(中国药品生物制品检定所)；人参皂苷Re(中国药品生物制品检定所)；人参 皂苷Rb(中国药品生物制品检定所)；腺苷(中国药品生物制品检定所)；尿苷(上海源叶 生物科技有限公司)；鸟苷(上海源叶生物科技有限公司)。

二、检测：

(一)、检测方法A(203nm)(对复方鳖甲软肝片中苷类成分的检测):

供试品溶液的制备：取复方鳖甲软肝片，精密称定0.50g，置10ml容量瓶中，加甲 醇8～10ml，超声处理40min，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液 作为复方鳖甲软肝片的供试品溶液；

色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用梯度洗脱，流动相A相为 水，流动相B相为乙腈。梯度洗脱程序如下：

色谱条件：Alltima(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：A相为水，B相为乙腈； 流速1.0ml/min，检测波长203nm，柱温25℃，进样量10μl；采用梯度洗脱。梯度洗 脱程序如下：

时间(min) A相：水 B相：乙腈 0 90 10 10 85 15 25 80 20

45 70 30 55 40 60 65 0 100 75 90 10

(二)、检测方法B(260nm)(对复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分的检测):

供试品溶液的制备：称取复方鳖甲软肝片0.50g，置10ml容量瓶中，加50%甲醇8～ 10ml，超声处理60min，加50%甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作 为复方鳖甲软肝片药的供试品溶液；

色谱条件：Alltima(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：A相为水，B相为甲醇；流 速0.8ml/min，检测波长260nm，柱温室温，进样量10μl；梯度洗脱程序如下：

时间(min) A相：水 B相：甲醇 0 90 10 12 84 16 45 84 16

在确定检测方法A的最佳色谱条件后，对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并 在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即芍药苷对照品溶液(36.68μg/ml) 峰面积重现性(RSD)低于3%，保留时间重现性(RSD)低于2%，理论塔板数按芍药苷计不少 于3000。

在确定检测方法B的最佳色谱条件后，对至少三批样品进行测定，计算相关，计算相 关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即腺苷对照品溶液(23 μg/ml)峰面积重现性(RSD)低于3%，保留时间重现性(RSD)低于2%，理论塔板数按腺苷计 不少于3000。

复方鳖甲软肝片的供试品(样品)的指纹图谱如图2所示，其中A为根据复方鳖甲软肝 片中苷类成分的检测方法于203nm波长下的指纹图谱；B为根据复方鳖甲软肝片中虫草核 苷类成分检测方法于260nm波长下的指纹图谱。

三、标准指纹图谱的制备：

对10批次的复方鳖甲软肝片，分别获取按照复方鳖甲软肝片中苷类成分的检测方法 于203nm波长下的指纹图谱和按照复方鳖甲软肝片中虫草核苷类成分检测方法于260nm 波长下的指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》A版(国家药典委员会)进 行相似度评价。采用共有峰模式，设定时间窗宽度为0.1min，以平均数法生成标准指纹 图谱，如图1所示，其中从按照复方鳖甲软肝片中苷类成分的检测方法于203nm波长下的 指纹图谱中确定了11个共有峰(1～11号峰)，如图1中A所示；从根据复方鳖甲软肝片中虫 草核苷类成分检测方法于260nm波长下的指纹图谱，确定了4个共有峰(12～15号峰)， 如图1中B所示；经对照品芍药苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、连翘苷、人参皂苷Rb1、 尿苷、鸟苷和腺苷定性鉴定，确认共有峰中，1号峰为芍药苷，6号峰为人参皂苷Rg1，7 号峰为人参皂苷Re，8号峰为连翘苷，11号峰为人参皂苷Rb1，12号峰为尿苷，14号峰为 鸟苷，15号峰为腺苷；

同时经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》A版(国家药典委员会)结果表明，10个 批次的指纹图谱的相似度在0.8-1.0之间。

四、将步骤二中得到的复方鳖甲软肝片的供试品的指纹图谱与步骤三得到的标准指 纹图谱进行对比，当复方鳖甲软肝片中苷类成分的指纹图谱与标准指纹图谱进行比较， 11个共有峰计算得到的相似度应不小于0.8为正常品，小于0.8为次品；复方鳖甲软肝片 中虫草核苷类成分的指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，4个共有峰计算得到的相似度应 不小于0.8为正常品，小于0.8为次品。

本发明所建立的复方鳖甲软肝片指纹图谱检测方法操作简便，可靠。并且能够运用 于实际生产中的质量控制，满足企业对成品的鉴别和质量控制的需求。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制， 凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时， 凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍 属于本发明的技术方案的范围内。