用于制备昆虫神经元细胞的生理缓冲液、消解液及方法

摘要

一种可以稳定可靠地获得昆虫离体神经元细胞的生理缓冲液、消解液及神经元细胞制备方法。生理缓冲液包括氯化钠180～200mmol/L、氯化钾5～7mmol/L、氯化钙4～5mmol/L、氯化镁4～6mmol/L、磷酸二氢钠0.8～1.0mmol/L、蔗糖70～90mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸10～12mmol/L、酵母浸提物2～3g/L，pH7.2～7.4。消解液通过将胰蛋白酶与IV型胶原蛋白酶溶于生理缓冲液得到，其中每10ml生理缓冲液溶有0.8-1.2mg胰蛋白酶和6.0-14.0mgIV型胶原蛋白酶。消化解离方法包括解剖昆虫获得昆虫神经索及用所述消解液消化解离所述神经索。用本发明生理缓冲液和消解液制备昆虫神经元细胞获得的昆虫神经元细胞稳定完整，所用材料易得，成本低，应用方便。

说明书

技术领域

本发明涉及用于制备昆虫神经元细胞的生理缓冲液、消解液及方法。

背景技术

昆虫的神经系统由外胚层的一部分细胞特化而成，属于腹神经索型，联系着体壁表面和体内的感觉器和反应器，昆虫通过神经系统与外界环境取得联系，协调虫体的快速运动。昆虫神经元细胞的分离和体外培养，不仅为细胞学研究提供了极好的神经细胞研究平台，而且在开发以昆虫神经系统为靶标的杀虫剂过程中具有重要作用。目前国内外急性分离蜚蠊目、鳞翅目等昆虫神经元细胞，主要通过以下4个方法进行。

（1）解剖并获得美洲大蠊（Periplaneta americana）腹神经索神经节背侧不成对中间神经元（DUM neurons）的末端神经节（TAG），在生理溶液①中漂洗后，于室温（20-25℃）条件下置于消化酶溶液②中酶解5min，然后用消化终止液③来终止酶解作用，并悬浮细胞，即用于电生理实验。（王瑞兰，梁宋平.虎纹捕鸟蛛毒素虎纹毒素—III对美洲蜚蠊神经细胞电压门控离子通道的影响.昆虫学报2009,52(2):126-132）

①生理溶液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，pH7.4。

②消化酶溶液(mmol/l)：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，胰蛋白酶0.3%，胶原蛋白酶IV0.5%，pH7.4。

③消化终止液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，胎牛血清5%，青霉素50IU/ml，链霉素50μg/ml，pH6.8。

（2）解剖并获得美洲大蠊（Periplaneta americana）中枢神经神经索末端腹神经节（TAG），置于生理溶液①中漂洗2次，转移入消化酶溶液②中，无菌条件下37℃水浴消化35min。酶解后，弃消化液，用消化终止液③冲洗终止消化，并反复轻柔吹打，以彻底分散神经节中的细胞。细胞悬浮于消化终止液中。（许鹏，孙芹，陈超，程洁，高蓉，姜志宽，肖杭.美洲大蠊中枢DUM神经元的分离和电压门控Na+电流的记录.昆虫学报2009,52(4):380-385）

①生理溶液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化钙5，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，pH7.4。

②消化酶溶液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化钙5，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，IV型胶原蛋白酶1.5mg/ml。

③消化终止液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化钙5，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，胎牛血清(5%,v/v)、1%双抗（青霉素50IU/ml，链霉素50mg/ml）。

（3）解剖并获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫腹神经索，用生理溶液①漂洗2次，在消化酶溶液②中孵育5～10min后去除神经鞘，继续振动消化25～35min。然后用消化终止液③终止酶作用，将细胞分散悬浮于培养基中。（贺秉军，刘安西，陈家童，孙金生，芮昌辉，孟香清.棉铃虫幼虫神经细胞的急性分离培养及其电压门控通道的膜片钳研究.昆虫学报2001,44(4):422-427）

①生理溶液（mmol/l）：氯化钠90，氯化钾6，氯化钙2，氯化镁2，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖140，pH6.6。

②消化酶溶液（mmol/l）：氯化钠90，氯化钾6，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖25，D-甘露醇115，胰蛋白酶0.3%，Ⅳ型胶原酶0.15％，pH6.6。

③消化终止液：为细胞培养基，具体成分为Tc-100(Gibico)，L-15(sigma)，Grace(Gibico)，DMEM(Gibico)，或Tc-l00分别与L-15、Grace和DMEM按4:1、3:1、2:l或1:1的混合。并增补10%胎牛血清，100mmol/l葡萄糖，0.6mmol/l谷氨酰胺，0.3mg/ml谷胱苷肽，80U/ml庆大霉素，pH6.6。

（4）烟草天蛾（Manduca sexta）神经节用3%胶原蛋白酶和中性蛋白酶处理1min,将该神经节转移到含有0.5mg/ml胶原蛋白酶和2mg/ml中性蛋白酶并且用Ca²⁺和Mg²⁺平衡的昆虫生理溶液①②中，在37℃消化5min，然后加入6ml增补生理溶液和6ml培养基③后离心来终止酶消化。细胞用培养基再悬浮培养。（Hayashi JH,Levine RB,1992.Calcium and potassiumcurrents in leg motoneurons during postembryonic development in the hawkmoth Manduca sexta.J.Exp.Biol.,171:15-42.）

①生理溶液(mmol/l)：氯化钠l00，氯化钾4，氯化钙6，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖5，pH7.0，用甘露醇将生理溶液渗透压调至360mosmol/l。

②消化酶溶液（mmol/l）：氯化钠l00，氯化钾4，氯化钙6，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖5，胶原蛋白酶0.5mg/ml，中性蛋白酶2mg/ml，pH7.0。

③消化终止液：为增补生理溶液和培养基。

增补生理溶液（mmol/l）：氯化钠149.9，氯化钾3，氯化钙3，氯化镁0.5，三乙基硅烷10，D-葡萄糖11，水解乳蛋白6.5g/l，酵母提取物5g/l，10%胎牛血清，青霉素l00units/ml，链霉素l00μg/ml，pH7.0，渗透压360mosmol/l。

培养基：在500ml L-15(Gibico)中添加：α-酮戊二酸185mg，果糖200mg，葡萄糖350mg，苹果酸335mg，琥珀酸30mg，酵母提取物1.4gm，水解乳蛋白1.4gm，烟酸0.01mg，咪唑30mg，链霉素100ug/ml，青霉素100units/ml，20-羟基蜕皮酮1ug/ml和稳定的复合维生素2.5ml。其中5ml复合维生素中包含：天门冬氨酸15mg，胱氨酸15mg，β-丙氨酸5mg，生物素0.02mg，维生素B122mg，肌醇10mg，氯化胆碱10mg，硫辛酸0.05mg，p-氨基苯甲酸5mg，富马酸25mg，辅酶A0.4mg，谷氨酸15mg，酚红0.5mg，pH7.0，渗透压360mosmol/l。

以上为国内外急性分离鳞翅目或直翅目昆虫神经元细胞几种主要方法。然而，这几种方法不仅在生理溶液、消化酶溶液和消化终止液的组成之间存在较大的差异，而且在消化种类、消化温度、消化时间等方法也存在差异，甚至对于同一种昆虫如：美洲大蠊的神经元细胞的分离也存在差异，其原因主要是由于这些原代细胞仅用于细胞膜电生理的研究。可以看出，针对昆虫神经元细胞尚无统一高效的消化解离方法，而不同的消化解离方法对昆虫神经元细胞的解离效果存在巨大差异。另外，按照这些方法，将难以确保充足数量的用于研究昆虫神经细胞的药物响应所需的具有生理稳定性的细胞。

昆虫神经元细胞是高度分化的不可继代培养的细胞，需要通过急性分离的方法从昆虫活体中获得。目前，不论在昆虫神经元解离过程中细胞数量的获得还是后期试验的稳定性，都需要一种高效稳定的消化解离方法，尤其是消化解离溶液。由于消化解离溶液一般以具有消化作用的酶为主，使用的消化酶目前并没有固定的种类如：胶原蛋白酶、胰蛋白酶、透明质酸酶、中性蛋白酶等，也没有联合消化的复合比例，从而影响昆虫神经元细胞的消化解离效果和细胞的稳定性。

发明内容

本发明目的在于提供一种可以稳定可靠地获得昆虫离体神经元细胞的生理缓冲液、消解液及神经元细胞的制备方法。

本发明的第一方面是一种用于制备昆虫神经元细胞的生理缓冲液，包括：氯化钠180～200mmol/L、氯化钾5～7mmol/L、氯化钙4～5mmol/L、氯化镁4～6mmol/L、磷酸二氢钠0.8～1.0mmol/L、蔗糖70～90mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸10～12mmol/L、酵母浸提物2～3g/L，pH7.2～7.4。

本发明的第二方面是一种用于制备昆虫神经元细胞的消解液，通过将胰蛋白酶与IV型胶原蛋白酶溶于本发明的上述生理缓冲液得到，其中每10ml生理缓冲液溶有0.8-1.2mg的胰蛋白酶和6.0-14.0mg的IV型胶原蛋白酶。

在优选的消解液中，其中每10ml生理缓冲液溶有0.9-1.1mg的胰蛋白酶和8.0-12.0mg的IV型胶原蛋白酶。

本发明还提供一种制备昆虫神经元细胞的消化解离方法，包括：解剖昆虫获得昆虫中枢神经索；及用权利要求2或3的消解液消化解离所述神经索。

在本发明的优选方法中，其中消化解离温度为28～37℃，时间为20～40分钟。

在本发明的优选方法中，其中所述昆虫选自鳞翅目和蜚蠊目昆虫。

在本发明的优选方法中，其中解剖昆虫过程使用权利要求1所述的生理缓冲液。

在本发明的优选方法中，其中消化解离后的消化终止液为含有10%质量的胎牛血清的所述生理缓冲液。

发明的优点在于，（1）本发明的生理缓冲液和消解液可用于制备昆虫神经元细胞，且所获得的昆虫神经元细胞稳定完整，所用材料易得，成本低，应用方便。（2）本发明提供了一种制备昆虫神经元细胞的方法，缩短了消化解离时间。（3）本发明所需材料易得，配置条件温和，所提供的昆虫神经元细胞消化解离组合物易于保存保存，应用方便。（4）本发明适用范围广，能应用于鳞翅目和蜚蠊目昆虫的神经元细胞分离。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，所列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

附图说明

图1昆虫神经元细胞从昆虫神经节上解离过程。

图2完整的昆虫神经元细胞。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，在大量的实验摸索与比较的基础上，完成了本发明。

本发明的第一方面，提供一种制备昆虫神经元细胞的生理溶液，由氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、磷酸二氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、蔗糖、酵母提取物（Yeast Extract）等物质混合溶解于去离子水中组成。

本发明的第二方面是一种制备昆虫神经元细胞的消解液，该消解液是生理溶液和胰蛋白酶与IV型胶原蛋白酶的组合。

在本发明的消解液中，每10ml生理缓冲液溶有0.8-1.2mg的胰蛋白酶和6-14mg的IV型胶原蛋白酶。优选地这两种酶的质量比例为1:8～12。

本发明各实施例中，使用的胰蛋白酶（sigma T9935CAS:9002-07-7）来源于牛胰腺，其活力单位≥9000BAEE U/mg：胶原蛋白酶（sigma C5138CAS:9001-12-1）来源于溶组织梭菌，其活力单位≥125U/mg。使用其他来源的具有不同酶活力的胰蛋白酶和胶原蛋白酶，其用量须与上述标准酶在消化解离昆虫神经元过程中相同的酶活力单位所相当的剂量。

或者说，在本发明的消解液中，每10ml生理缓冲液具有约（0.8-1.2mg）×9000BAEE U/mg的胰蛋白酶活和约（6-14mg）×125U/mg的IV型胶原蛋白酶活。

本发明的另一方面，提供第一方面所述的昆虫神经元细胞的制备方法。将解剖获得的昆虫神经元神经节在无菌条件下置于消化解离组合物中消化时间为20～40min，消化温度为28～37℃。用含10%胎牛血清的昆虫神经元细胞生理溶液（pH7.2～7.4）终止消化。细胞用含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml）的昆虫神经元生理溶液悬浮。

本发明所提供的用于制备昆虫神经元细胞的方法和消化解离组合物对昆虫中枢神经索上的神经元细胞皆可适用，但对鳞翅目如：东方粘虫、斜纹夜蛾、烟草天蛾、棉铃虫、等等，和蜚蠊目如：美洲大蠊、德国小蠊、等等昆虫的作用效果最佳。同时需要注意的是，在实验前，需对昆虫体表进行消毒处理，并且整个操作过程需在无菌状态下进行。

实施例

<A生理缓冲液和消解液的制备>

实施例1昆虫神经元细胞生理缓冲液的制备

取氯化钠11.68g、氯化钾0.46g、氯化钙0.55g、氯化镁0.57g、磷酸二氢钠0.1g、蔗糖26.63g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38g、酵母提取物3g，溶于800ml去离子水中，用氢氧化钠调至pH7.2，定容至1000ml。即为昆虫神经元细胞生理缓冲液。经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

实施例2昆虫神经元消解液的制备

消解液I

取IV型胶原蛋白酶12.0mg，胰蛋白酶1.0mg共同溶于10ml实施例1的昆虫神经元细胞生理缓冲液中，0.22μm滤膜过滤除菌，置于-20℃条件下保存备用。

消解液II

取IV型胶原蛋白酶8.0mg，胰蛋白酶1.0mg共同溶于10ml昆虫神经元细胞生理缓冲液中，0.22μm滤膜过滤除菌，置于-20℃条件保存备用。

<B.昆虫神经元细胞的制备>

首先，以美洲大蠊为例分离其腹神经索：

（1）实验所需的器材需灭菌消毒，实验操作过程需在无菌条件下进行。

（2）取美洲大蠊成虫，饥饿处理半天后，用75%的乙醇进行虫体表面消毒，再使用昆虫神经细胞生理缓冲液进行表面冲洗，洗净残留乙醇。

（3）剪去虫体的足和翅，在蜡盘中用大头针固定其头部和尾部，用昆虫神经元细胞生理缓冲液浸覆虫体。沿背中线剪开体壁，用大头针去除消化道和腹壁上残存的脂肪体，可见虫体腹神经索，呈白色略透明状。

（4）小心的挑起并轻轻剥离出整条腹神经索。用昆虫神经元细胞生理缓冲液冲洗后，再将其迅速置于含有1%抗生素(100U/ml青霉素&100μg/ml链霉素)的昆虫神经元细胞生理缓冲液中2min。

（5）取出腹神经索，用于解离神经节和神经组织，并制备神经元细胞。

其次，以东方粘虫为例分离其腹神经索：

分离步骤与美洲大蠊基本一致，所不同之处在于取5龄或6龄粘虫幼虫，饥饿处理半天后，经75%乙醇进行虫体表面消毒，再使用昆虫神经细胞生理缓冲液进行表面冲洗，在蜡盘中直接用大头针将虫体头部和尾部固定，然后按照美洲大蠊腹神经索分离方法来分离粘虫幼虫的腹神经索。

然后，从神经索制备神经元细胞。下面是解离昆虫中枢腹神经索和制备神经元细胞的例子。由于鳞翅目昆虫如：东方粘虫神经元细胞的制备方法与美洲大蠊基本一致，因此下述实施例和比较例以美洲大蠊为代表进行具体说明，这些实施例也同样适用于鳞翅目昆虫并得到基本相同的效果。

实施例3

用实施例2中制备的消解液I对上述分离的美洲大蠊腹神经索进行消化解离，使用时应控制温度为28℃。

解离效果：在浸润15min后细胞开始被不同程度地从神经节上解离下来，解离40min后，用含有10%胎牛血清及1%双抗的生理缓冲液来终止反应。在200倍倒置显微镜下观察发现，神经节组织已消化完全，随机取9个不同视野观察结果显示，平均每视野下可清晰地获得约30～32个完整的神经元细胞。其中，图1所示为神经元细胞自昆虫中枢神经索上的解离过程；图2所示为分离美洲大蠊中枢腹神经索所得的单个神经元细胞。

实施例4

用实施例2中制备的消解液II对上述美洲大蠊腹神经索进行消化解离，使用时应控制温度为37℃。

解离效果：在浸润10min后细胞开始被不同程度地从神经节上解离下来，解离20min后，用含有10%胎牛血清及1%双抗的生理缓冲液来终止反应。在200倍倒置显微镜下观察发现，神经节组织已消化完全，随机取9个不同视野观察结果显示，平均每视野下可清晰地获得约29～32个完整的神经元细胞。

比较例1

与实施例3基本相同的方法解离美洲大蠊腹神经索的神经元细胞，不同之处仅在于消解液制备时仅取IV型胶原蛋白酶8.0mg，不添加胰蛋白酶，溶于10ml昆虫神经元细胞生理缓冲液中。

解离效果：在浸润15min后细胞开始被不同程度地从神经节上解离下来，解离40min后，用含有10%胎牛血清及1%双抗的生理缓冲液来终止反应。在200倍倒置显微镜下观察发现，神经节组织消化不完全，随机取9个不同视野观察结果显示，平均每视野下可观察到约27～30个完整的神经元细胞。同时显示，神经元细胞虽已从神经节组织上被解离，但每个视野下均存在大量碎屑状的神经组织碎片，神经元细胞需通过200目网筛进一步过滤才可获得，易造成神经元细胞的损伤。

比较例2

与实施例3基本相同的方法解离美洲大蠊腹神经索的神经元细胞，不同之处仅在于消解液制备时取IV型胶原蛋白酶1.0mg和胰蛋白酶8.0mg，共同溶于10ml昆虫神经元细胞生理缓冲液中。

解离效果：在1～5min内，细胞开始被不同程度地从神经节上解离下来，浸润10min后，用含有10%胎牛血清及1%双抗的生理缓冲液来终止反应。在200倍倒置显微镜下观察发现，神经节组织消化完全，但所有细胞均出现表面损伤，最终获得的完整神经元细胞数量为0。同时发现，在该解离条件下，很难实施控制以便确定可获得最大细胞数量的最终反应时间。

比较例3

与实施例3基本相同的方法解离美洲大蠊腹神经索的神经元细胞，不同之处仅在于消解液制备时取IV型胶原蛋白酶4.0mg和胰蛋白酶4.0mg，共同溶于10ml昆虫神经元细胞生理缓冲液中。

解离效果：在2min后细胞开始被不同程度地从神经节上解离下来，浸润15min后，用含有10%胎牛血清及1%双抗的生理缓冲液来终止反应。在200倍倒置显微镜下观察发现，神经节组织消化完全，但大多数细胞出现表面损伤，随机取9个不同视野观察结果显示，平均每视野下可清晰地获得约9～13个完整的神经元细胞。