用于预测胃癌预后的标记和用于预测胃癌预后的方法

摘要

本发明涉及用于预测胃癌预后的标记、用于预测胃癌预后的组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包含用于测量该标记表达水平的制剂，和使用所述标记预测胃癌预后的方法。根据本发明，可以精确地预测胃癌预后，并且可以基于预测的预后有利地建立适宜的治疗计划，以显著减少由胃癌引起的死亡。尤其，根据本发明，可以对Ib/II期胃癌患者中已经预测具有消极预后的患者使用用于III期胃癌患者的治疗方法，借此大幅度提高存活率。

说明书

技术领域

本发明涉及用于预测胃癌预后的标记、用于预测胃癌预后的包含测量该标记表达水平 的试剂的组合物和试剂盒和使用所述标记预测胃癌预后的方法。

背景技术

在2005年，总计65,479人死于癌症，占全部死亡的26.7%。造成最多死亡的癌症是 肺癌，每100,000人群中有28.4位患者死亡（21.1%），按顺序其次是胃癌，22.6位患者 死亡（16.8%）；肝癌，22.5位患者死亡（16.7%）；结直肠癌，12.5位患者死亡（9.3%）。 已知胃癌是世界范围内因癌症造成的死亡当中造成第二多死亡的因素。

胃癌的症状显示出多个方面，范围从无症状至严重疼痛。此外，胃癌症状似乎像常见 的消化症状，没有任何特异特征。通常，在胃癌早期，大部分病例没有症状，即便有任何 症状的话，也很轻微，如轻微消化不良或上腹部不适，这造成大部分人忽视并因此可能增 加胃癌死亡率。

大部分用于胃癌的检验方法迄今是物理检验方法。首选是胃X射线法，这包括双重 对比方法、压缩X射线法、粘膜图法，并且其次是胃镜检查法，所述胃镜检查法通过找 到非常小的病灶并且允许在疑似部位进行胃活组织检查而提高诊断率，其中所述非常小的 病灶在X射线检查法中通过用肉眼检查胃部时不显现。然而，这种方法具有以下缺点： 存在卫生问题和患者在检查期间感觉疼痛。因此，近年来，已经进行了通过测量胃中特异 性表达的标记基因的表达水平而诊断胃癌的研究，但是关于预测胃癌患者预后的遗传标记 的研究相对较少。

胃癌患者存活率取决于诊断时的病理学分期。根据三星医学中心的数据，胃癌患者的 5年存活率如下（KimS等人,Int J Radiat Oncol Biol Phys2005;63:1279-85）。

II期：76.2%，IIIA期：57.6%，

IIIB期：39.6%，IV期26.3%

结果显示早期检出胃癌能明显有助于提高存活率。然而，由于已经诊断为处于相同阶 段的胃癌根据患者的不同而显示出了预后的差异，因此精确预测胃癌预后以及早期检出胃 癌是有效治疗胃癌的最重要因素。

在另一方面，为诊断胃癌，医生开始对患者实施必要的、据认为是最适宜的治疗方案 的检查。存在用于治疗癌症的方法，如手术、内窥镜疗法、化疗和放射疗法。一般通过考 虑胃癌疗法、胃癌尺寸、位置和范围、患者总体健康状态以及许多其他因素确定治疗方法。

在仅用手术治疗ΙB/II期胃癌的情况下，已知大约30%患者在5年内复发。在这种情 况下，由于不能预测胃癌在哪些患者中复发，因此不同医生采用不同疗法。因此，如果可 以精确预测胃癌患者预后，则可以基于这种预后确定适宜的治疗方法，如手术或化疗，这 可能很有助于胃癌患者存活，并且因此需要可以精确预测胃癌患者预后的技术。

常规上，已经使用解剖观察法（癌细胞侵入程度和转移的淋巴结数目）以便预测胃癌 患者的预后，但是该方法存在医师主观判断的可能介入和精确预测预后的局限。

发明内容

发明公开

技术问题在这种背景下，作为研究可以通过精确预测胃癌预后并根据预测的预后确定 适宜治疗方向而提高胃癌患者存活率的结果，本发明人确定，可以通过鉴定用于预测胃癌 预后的标记并且测量所述标记的表达水平来精确预测胃癌预后，以便完成本发明。

技术方案

本发明的目的是提供一种用于预测胃癌预后的标记，所述标记包括选自以下的一个或 多种基因：C20orf103、COL10A1、MATN3、FMO2、FOXS1、COL8A1、THBS4、CDC25B、 CDK1、CLIP4、LTB4R2、NOX4、TFDP1、ADRA2C、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、 INSR、LPHN1、LYN、MRGPRX3、ALAS1、CASP8、CLYBL、CST2、HSPC159、MADCAM1、 MAF、REG3A、RNF152、UCHL1、ZBED5、GPNMB、HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、 ISLR2、GPBAR1、CPS1、BCL11B和PCDHGA8基因。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌预后的组合物，所述组合物包含用于测 量用于预测胃癌预后标记的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌预后的试剂盒，所述试剂盒包含用于测 量用于预测胃癌预后标记的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌预后的方法，所述方法包括a）获得从 胃癌患者采集的样品中用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模 式；和b）比较从步骤a）所获得的表达水平或表达模式与预后已知的胃癌患者中相应基 因的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌预后的方法，所述方法包括a）测量从 胃癌患者采集的样品中用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模 式，以获得定量的表达值；b）将步骤a）中获得的表达值应用于预后预测模型以获得胃 癌预后评分；和c）将步骤b）中获得的胃癌预后评分与参比值比较以确定患者的预后。

有益效果

根据本发明，可以迅速和精确地预测胃癌预后，并且可以基于预测的预后确定适宜的 治疗，这具有有助于显著减少由胃癌引起的死亡的优点。尤其是，根据本发明，可以通过 使用针对III期胃癌所开发的靶向疗法大幅度提高存活率，因为Ib/II期胃癌患者当中已经 预测具有消极预后的患者显示与III期胃癌患者相似的预后并且耐受现有的标准化疗。

附图简述

图1是显示在使用参比基因基于分位数归一化和自我标准化的多种风险之间关系的 图。

图2代表根据C20orf103、COL10A1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图3代表根据MATN3、FMO2基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图4代表根据FOXS1、COL8A1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图5代表根据THBS4、ALAS1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图6代表根据CASP8、CLYBL基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图7代表根据CST2、HSPC159基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图8代表根据MADCAM1、MAF基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图9代表根据REG3A、RNF152基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图10代表根据UCHL1、ZBED5基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图11代表根据GPNMB、HIST1H2AJ基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图12代表根据RPL9、DPP6基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图13代表根据ARL10、ISLR2基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图14代表根据GPBAR1、CPS1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图15代表根据BCL11B、PCDHGA8基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图2至图15的p-值是借助高表达或低表达和基因表达水平划分基因的表达水平并进 行对数秩检验的结果值。

图16是显示积极预后组（低风险）或消极预后组（高风险）的无疾病存活率的 Kaplan-Meier曲线，所述组根据使用表5中所列出基因的预后预测模型划分。

图17是显示Ib/II期胃癌患者的无疾病存活率的Kaplan-Meier曲线，所述Ib/II期胃 癌患者使用表5中所列出基因的预后预测模型划分成积极预后组或消极预后组。

图18是显示积极预后组（低风险）或消极预后组（高风险）的无疾病存活率的 Kaplan-Meier曲线，所述组根据使用表7中所列出基因的预后预测模型划分。图18中的 HR是累积性风险函数比，并且使用100个排列计算p-值。

图19是通过划分患者（高对低）后患者组的Kaplan-Meier曲线，其中根据使用表7 中列出的基因并根据病理学分期（IB+II对III+IV）的预后预测模型将所述患者分类。通 过双侧对数秩检验计算p-值。

图20代表根据CDC25B、CDK1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图21代表根据CLIP4、LTB4R2基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图22代表根据NOX4、TFDP1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图23代表根据ADRA2C、CSK基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图24代表根据FZD9、GALR1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图25代表根据GRM6、INSR基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图26代表根据LPHN1、LYN基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图27代表根据MRGPRX3基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图20至图27的p-值是借助高表达或低表达和基因表达水平划分基因的表达水平并 进行对数秩检验的结果值。

图28代表在表10中列出的基因的GCPS的临界值分析。最佳区分是将患者划分为高 风险组75%和低风险组25%的情况。

图29代表基于表10中列出的基因的GCPS的优化临界值，在发现集合中的II期胃 癌患者的无疾病存活率。

图30代表发现集合对验证集合中表10中列出的基因的GCPS的分布，并且显示发现 集合中GCPS的分布与发现集合中GCPS的分布重合。这代表这种测定法的分析稳健性。

图31代表根据预定义算法GCPS和临界值（红色=高风险）的验证队列的无疾病存 活率。

图32代表II期胃癌患者的无疾病存活率，其中所述II期胃癌患者基于表11中列出 的基因的GCPS接受手术和放射疗法。蓝颜色代表由GCPS定义的高风险。

图33代表II期胃癌患者的无疾病存活率，其中所述II期胃癌患者仅基于表11中列 出的基因的GCPS接受手术。蓝颜色代表由GCPS定义的高风险。

具体实施方式

优选发明模式

作为实现目标的一个方面，本发明提供用于预测胃癌预后的标记，所述标记包括选自 以下基因的一个或多种：C20orf103、COL10A1、MATN3、FMO2、FOXS1、COL8A1、 THBS4、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、NOX4、TFDP1、ADRA2C、CSK、FZD9、 GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MRGPRX3、ALAS1、CASP8、CLYBL、CST2、 HSPC159、MADCAM1、MAF、REG3A、RNF152、UCHL1、ZBED5、GPNMB、HIST1H2AJ、 RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBAR1、CPS1、BCL11B和PCDHGA8基因。

作为另一个方面，本发明提供一种用于预测胃癌预后的组合物，所述组合物包含用于 测量用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平的试剂。

虽然处于相同病理学分期，但是每种胃癌的临床预后是不同的，并且必须根据这种预 后使用适宜的治疗方法以便增加胃癌患者的存活率。因而，本发明提供一种用于预测胃癌 预后的组合物，所述组合物包含用于预测胃癌预后的标记和用于测量其表达水平的试剂， 以便精确预测被诊断患有胃癌的患者的预后并且基于预测的预后确定适宜治疗方向，以增 加胃癌患者的存活率。

如本文所用，术语“标记”指与生物学现象的存在定量或定性相关的分子，并且本发明 的标记指作为预测胃癌患者存在良好或不良预后的基础的基因。

本发明的标记具有用于预测胃癌预后的显著低的p-值和高度可靠性，并且尤其，表5、 7、10和11中列出的标记可以根据所述标记的表达水平，将患者组划分成积极预后组或 消极预后组，并且可以通过测量标记的表达水平精确地预测胃癌患者的预后，因为根据显 示这些组的存活率的Kaplan-Meier曲线，积极预后组的存活率高于消极预后组的存活率。

如本文所用，术语“预后”指关于医学发展（例如，长期存活可能性、无疾病存活率等） 的预期，包括积极预后或消极预后，所述消极预后包括疾病进展如复发，肿瘤生长、转移 和耐药死亡率（mortality），并且积极预后包括疾病缓解如无疾病状态，疾病改善如肿瘤 消退或稳定（stabilization）。

如本文所用，术语“预测”指关于医学发展的猜测，并且出于本发明的目的，指猜测诊 断为胃癌的患者的疾病发展（疾病进展、改善、胃癌复发、肿瘤生长、耐药）。

在本发明的例子中，通过将诊断患有胃癌的患者划分成积极预后组或消极预后组来预 测胃癌患者的预后，并且另外，通过根据所述预后划分诊断存在胃癌病理学分期的患者来 预测胃癌患者的预后（实施例7至9）。

用于预测胃癌预后的标记可以优选地是以下基因的组合：C20orf103、COL10A1、 MATN3、FMO2、FOXS1、COL8A1和THBS4基因；以下基因的组合：ALAS1、C20orf103、 CASP8、CLYBL、COL10A1、CST2、FMO2、FOXS1、HSPC159、MADCAM1、MAF、 REG3A、RNF152、THBS4、UCHL1、ZBED5、GPNMB、HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、 ARL10、ISLR2、GPBAR1、CPS1、BCL11B和PCDHGA8基因；以下基因的组合：C20orf103、 CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因；或以下基因的组 合：ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、 MATN3、MRGPRX3和NOX4基因；并且更优选地是以下基因的组合：C20orf103、 CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因，或以下基因的组 合：ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、 MATN3、MRGPRX3和NOX4基因。

本发明人确定通过以下方法，以上基因可以精确地预测胃癌预后。本发明人从福尔马 林固定的石蜡包埋的胃癌肿瘤组织中提取RNA，使用提取的RNA和全基因组DASL测 定试剂盒（Whole-Genome DASL assay kit）测量基因表达水平，并且随后使用其中将基因 表达水平作为连续变量处理的Cox比例风险模型（Cox proportional hazard model）进行标 准统计分析（standard statistical analysis）。作为结果，鉴定到与无疾病存活率存在巨大相 关性的、用于通过单变量分析（Univariate analysis）预测胃癌预后的369种基因（表2）， 和用于预测病理学分期Ib/II胃癌预后的基因（表3）。随后，通过对鉴定的基因的表达水 平应用superPC算法，产生包含表5中基因的预后预测模型，并且根据这个预测模型，将 胃癌患者划分成积极预后组或消极预后组。通过显示积极预后组的存活率高于消极预后组 （实施例7和图16、图17），Kaplan-Meier曲线针对划分组的结果验证了使用本发明标记 的预后预测模型的有效性和可靠性。此外，通过对鉴定的基因的表达水平应用梯度套索算 法（gradient lasso algorithm）而产生的包含表7中基因的预后预测模型并且将胃癌患者划 分成积极预后组或消极预后组的结果确定这种分类与临床结果重合（实施例8和图18、 图19）。

如本文所用，术语“用于测量标记的表达水平的试剂”指可以用来确定标记基因或由这 些基因编码的蛋白质的表达水平的分子，并且可以优选地是对对所述标记特异的抗体、引 物或探针。

如本文所用，术语“抗体”是本领域已知的术语，指针对抗原性位点的特异性蛋白质分 子。出于本发明的目的，抗体指与本发明标记特异性结合的抗体并且可以通过常规方法从 标记基因编码的蛋白质中制备，其中通过以常规方式将每种基因克隆至表达载体中获得所 述蛋白质。其中，包括可以从所述蛋白质产生的部分肽。

如本文所用，术语“引物”指短核酸序列，作为具有短的游离3′末端羟基（游离3`羟基） 的核酸序列，它可以与互补模板（template）形成碱基对（base pair）并充当复制模板的 起点。在本发明中，可以通过以下方式预测胃癌预后：通过进行使用本发明的标记多核苷 酸的有义和反义引物的PCR扩增，所需的产物是否产生。可以基于本领域已知内容修改 PCR条件和有义引物和反义引物的长度。

如本文所用，术语“探针”指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所 述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因维持标记（Labeling）作用而确定特 定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA（single stranded DNA）探针、 双链DNA（double stranded DNA）探针和RNA探针等形式制备。在本发明中，可以通过 使用本发明的标记多核苷酸及互补探针实施杂交，借助是否杂交来预测胃癌预后。可以基 于本领域已知内容修改对探针和杂交条件的恰当选择。

本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以 使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、 用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电 荷的连接体（例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等），或修饰带电荷的 连接体（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）。

在本发明中，用于预测胃癌预后的标记的表达水平可以通过确定标记标记基因的 mRNA或由所述基因编码的蛋白质的表达水平来确定。

如本文所用，术语“测量mRNA的表达水平”指确定生物样品中标记基因的mRNA存 在及其表达水平以便预测胃癌预后的过程并且通过测量mRNA的量可实现。用于此目的 分析方法是但不限于RT-PCR、竞争性RT-PCR（competitive RT-PCR）、实时RT-PCR （Real-time RT PCR）、RNA酶保护测定法（RPA；RNase protection assay）、northern印迹 法（northern blotting）、DNA微阵列芯片等。

如本文所用，术语“测量蛋白质的表达水平”指确定生物样品中标记基因内表达的蛋白 质存在及其表达水平以便预测胃癌预后的过程，并且可以通过使用与上述基因中表达的蛋 白质特异性结合的抗体来确定蛋白质的量。用于此目的分析方法是但不限于western印迹 法（western blotting）、ELISA（酶联免疫吸附测定）、放射性免疫测定（Radioimmunoassay）、 放射性免疫扩散法（Radioimmunodiffusion）、奥克特洛尼（Ouchterlony）免疫扩散法、火 箭（Rocket）电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法（immunoprecipitation assay）、 补体结合测定法（complete fixation assay）、FACS、蛋白质芯片（protein chip）等。

作为另一个方面，本发明提供一种用于预测胃癌预后的试剂盒，所述试剂盒包含用于 测量用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平的试剂。

本发明的试剂盒可以用于鉴定用于预测胃癌预后的标记的表达水平以便预测胃癌预 后。

本发明的试剂盒可以是RT-PCR试剂盒、实时RT-PCR试剂盒、实时QRT-PCR试剂 盒、微阵列芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。

本发明的试剂盒可以不仅包含用于测量预测胃癌预后的标记的表达水平的引物、探 针，或特异性识别所述标记的抗体，还包含适用于分析方法的一类或多类其他组分的组合 物、溶液或装置。

根据本发明的例子，用于测量标记基因的mRNA的表达水平的试剂盒可以是包含进 行RT-PCR所要求的必需要素的试剂盒。除了对标记基因特异的每对引物之外，这种 RT-PCR试剂盒还可以包含试管或其他适宜容器、反应缓冲溶液、脱氧核苷酸（dNTPs）、 Taq-聚合酶和逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂和DEPC水（DEPC-water）以及无菌水。

根据本发明的另一个例子，用于测量标记基因编码的蛋白质的表达水平的试剂盒可以 包含底物、适宜的缓冲溶液、以生色酶或荧光物质标记的第二抗体和生色底物。

根据本发明的另一个例子，本发明中的试剂盒可以是用于检测预测胃癌预后的标记的 试剂盒，其包含为进行DNA微阵列芯片所要求的必需要素。DNA微阵列芯片试剂盒可 以包含底物，其中作为探针的基因或与其片段相对应的cDNA与所述底物连接，并且所 述底物可以包括定量性对照基因或与其片段相对应的cDNA。

作为另一个方面，本发明提供一种用于预测胃癌预后的方法，所述方法包括a）获得 从胃癌患者采集的样品中用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平或表达 模式；和b）比较步骤a）中所获得的表达水平或表达模式和预后已知的胃癌患者中相应 基因的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式。

如本文所用，术语“从胃癌患者采集的样品”可以是但不限于源自胃癌患者胃部的组 织、细胞、全血、血清、血浆，并且优选地是胃肿瘤组织。

如本文所用，术语“预后已知的胃癌患者”指在诊断为患有胃癌的患者当中其疾病进展 已经被揭示的患者，例如，因手术后3年内复发而证实具有消极预后的患者或因手术后彻 底治愈而证实具有积极预后的患者，并且可以通过从样品获得并且比较表达水平或表达模 式精确预测待发现其预后的患者的预后，其中所述样品从上述患者和待发现其预后的患者 采集。

根据本发明的例子，可以通过以下方式预测预后：测量来自许多胃癌患者的标记基因 的表达水平或表达模式，用所述患者的预后建立测量值的数据库，并且将待发现其预后的 患者的表达水平或表达模式输入数据库中。在这种情况下，已知的算法或统计分析程序可 以用来比较表达水平或表达模式。此外，该数据库可以进一步再划分成病理学分期、接受 的治疗等。

根据本发明的例子，在步骤a）和b）中的胃癌患者是接受相同治疗的患者，并所述 治疗可以是放射性疗法、化疗、化放疗、辅助化疗（adjuvant chemotherapy）、胃切除术、 胃切除术后化疗或化放疗和辅助化疗或手术后无放射性疗法情况下的胃切除术。

根据本发明的例子，胃癌可以是Ib期或II期胃癌。

在本发明中，可以在mRNA或蛋白质的水平测量标记基因的表达水平，并且可以使 用公众已知的方法从生物样品分离mRNA或蛋白质。

用于测量mRNA或蛋白质的水平的分析方法如上文所述。

借助以上分析方法，从预后已知的胃癌患者的样品中测量的胃癌基因标记的表达水平 可以与从待发现其预后的患者的样品中测量的胃癌基因标记的表达水平相比较，并且可以 通过确定所述表达水平的增加或减少而预测胃癌预后。换言之，如果通过比较表达水平的 结果，待发现其预后的患者的样品显示与存在积极预后的胃癌患者的样品相似的表达水平 或表达模式，则可以确定具有积极预后，并且相反地，如果它显示与存在消极预后的胃癌 患者的样品相似的表达水平或表达模式，则可以确定具有消极预后。

根据本发明的例子，可以通过以下方式预测预后：将标记基因的表达水平与选自表4 中列出的基因中的一个或多种基因的表达水平比较并归一化，并且随后使用归一化 （normalization）的表达水平。

作为另一个方面，本发明提供一种用于预测胃癌预后的方法，所述方法包括a）测量 从胃癌患者采集的样品中用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平以获得 定量的表达值；b）将步骤a）中获得的表达值应用于预后预测模型以获得胃癌预后评分； 和c）将步骤b）中获得的胃癌预后评分与参比值比较以确定患者的预后。

步骤a）是用于定量测量标记基因的表达水平的步骤。可以使用已知软件、试剂盒和 系统来定量如上文所述的用于测量mRNA或蛋白质水平的分析方法所测量的表达水平， 获得标记基因的定量表达值。根据本发明的例子，测量标记基因的表达水平可以使用 nCounter分析试剂盒（NanoString Technologies）进行。在这种情况下，标记基因的表达 水平可以通过与参比基因的表达水平比较而进行归一化。根据本发明的例子，测量的标记 基因表达水平可以通过与选自表4内所列出的参比基因中的一个或多个参比基因的表达 水平进行比较而归一化。

根据本发明的例子，在步骤a）中，可以测量C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4、 LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因，或者ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、 FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3和NOX4基因的 mRNA或蛋白质的表达水平。

步骤b）是将步骤a）中获得的表达值应用于预后预测模型以获得胃癌预后评分的步 骤。

根据本发明的例子，这个预后预测模型可以表述为：

[S=β₁x₁+...+β_nx_n]

其中，x_n是第n个基因的定量表达值，

β_n是第n个基因的Cox回归估计值（Cox Regression estimate），并且

S代表胃癌预后评分。

步骤c）是将步骤b）中获得的胃癌预后评分与参比值比较以确定患者预后的步骤。

可以将参比值确定为在多个胃癌预后评分分布中第三个四分位数（third quartile）的 临界值至第四个四分位数的临界值的范围内的值，其中通过输入来自多位胃癌患者的标记 基因的表达值来获得所述多个胃癌预后评分分布。此外，可以将参比值确定为在多个胃癌 预后评分分布中第二个四分位数（Second quartile）的临界值至第三个四分位数的临界值 的范围内的值，其中通过输入来自多位胃癌患者的标记基因的表达值来获得所述多个胃癌 预后评分分布。优选地，可以将参比值确定为在多个胃癌预后评分分布中第三个四分位数 的临界值至第四个四分位数的临界值的范围内的值，其中通过输入来自多位胃癌患者的标 记基因的表达值来获得所述多个胃癌预后评分分布。

四分位数的临界值可以定义为在多位胃癌患者根据胃癌预后评分的尺度而分布时，与 1/4、2/4、3/4和4/4点相对应的值。在这种情况下，第四个四分位数的临界值可以是从患 者所获得的胃癌预后评分当中最大的评分。

根据本发明的一个例子，可以确定具有步骤b）中获得的与参比值相同或较之更大的 胃癌预后评分的病例具有消极预后。

根据本发明的一个例子，该临界值可以是0.2205或-0.4478，并且可以确定具有步骤 b）中获得的与临界值相同或较之更大的胃癌预后评分的病例具有消极预后。优选地，如 果在步骤a）中测量C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4，LTB4R2、MATN3、NOX4 和TFDP1基因的表达水平，则临界值可以是0.2205，并且如果在步骤a）中测量ADRA2C、 C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、 MRGPRX3和NOX4基因的表达水平，则临界值可以是-0.4478。

在本发明的一个例子中，通过应用梯度套索算法而产生包含表10和表11中基因的预 后预测模型，并且通过比较胃癌预后值将胃癌患者划分成积极预后组或消极预后组，其中 通过输入表达值和参比值至上式而获得所述胃癌预后值。通过证实消极预后组（高风险） 的存活率显著低于积极预后组（低风险）（实施例9，和图29、图31、图32），针对划分 组的Kaplan-Meier曲线结果验证了使用本发明标记的预后预测模型的有效性和可靠性。 此外，根据以仅接受胃切除术的患者作为受试者而测量标记基因的表达水平所获得的胃癌 预后值划分患者的结果确定了，通过证实消极预后组（高风险）的存活率显著低，也可以 用本发明的标记预测仅接受胃切除术的患者的预后（实施例9和图33）。

因此，可以根据本发明精确地预测胃癌预后，并且可以获得与预测的预后一致的适宜 治疗方案的益处。例如，可以确定对经判定具有积极预后的患者进行标准疗法或侵入性较 小的治疗选项，可以确定对经判定具有消极预后的患者进行用于早期胃癌患者的治疗方法 或非常具有侵入性（invasive treatment）或实验性疗法。具体而言，对于经诊断患有Ib或 II期胃癌的患者，可以根据本发明预测的预后选择适宜治疗方法，因为这些患者可能显示 不同的预后。例如，用于III期胃癌患者的治疗方法如手术或抗癌药物可以用于经诊断患 有Ib或II期胃癌的患者中预测具有消极预后的患者。

发明方式

下文通过提供实施例更详细地描述了本发明。然而，这些实施例仅意在说明，而不以 任何方式限制要求保护的发明。

实施例1：胃癌患者的选择

本研究在三星医学中心（Samsung Medical Center）和三星癌症研究所（Samsung Cancer  Research Institue）按照赫尔辛基宣言（Declaration of Helsinki）而实施。本研究由三星医 学中心指导委员会批准。在1994年至2005年12月期间，1152位患者的队列（cohort） 根据以下标准选自1557位在5-FU/LV（INT-0116方案）辅助化疗后准接受胃切除术的患 者：

1）腺瘤组织学诊断，切除肿瘤，无残余肿瘤，

2）D2淋巴结清扫术（D2lymph node dissection），

3）年满18岁的男性和女性，

4）根据AJCC（美国癌症联合委员会）第6版，病理学分期Ib（T2bN0、T1N1或不 是T2aN0）至IV期，

5）完整保留手术记录和治疗记录，且根据以下方法接受5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸 （5-fluorouracil/leucovorin）辅助化疗（INT-0116方案）至少2次的患者。即，这样的患 者，其接受化放疗（总计4500cGy辐射，每日180cGy，1周/5日，持续5周），随后施用 5-氟尿嘧啶（400mg/m²/日）和甲酰四氢叶酸（20mg/m²/日）5日（1次），和额外施用1 次5-氟尿嘧啶（400mg/m²/日）和甲酰四氢叶酸（20mg/m²/日）。

1557位患者组中有405位患者从本分析中排除，归因于如下原因：

1）接受5-FU/LV辅助化疗少于2次的患者（N=144），

2）显微镜下存在阳性切缘（microscopically positive resection margin）的患者（N=73），

3）双重原发性癌症（double primary cancer）患者（N=53），

4）胃次全切除术后残余胃（remnant stomach）内胃癌复发的患者（N=5），

5）无完整医疗记录的患者（N=11），

6）使用非INT-0116方案的方案的患者（N=65）

7）其他（N=54）。

这项研究采用432位患者进行，其从1557位初步筛选的患者中二次筛查1152位患者 后最终随机筛选而来，并且表1中显示了所述患者的医学特征。432位患者根据胃癌病理 分期的分类显示了以下组成：Ib期68位、II期167位、IIIA期111位、IIIB期19位和IV 期67位（表1）。

表1

实施例2：从胃肿瘤提取RNA

从实施例1中最终筛选的胃癌患者的胃肿瘤提取RNA。为此目的，选择由最大肿瘤 组成的原发性肿瘤石蜡块（primary tumor paraffin block）。RNA从福尔马林固定、石蜡包 埋的组织（formalin-fixed，paraffin-embedded tissue）中4μm厚度的2至4块切片提取， 并且在移至提取管之前，通过微切割法（microdissection）移除非肿瘤要素。随后，根据 制造商的说明书，使用High Pure RNA Paraffin试剂盒（Roche Diagnostic,Mannheim,德 国）或E.Z.N.A.FFPE RNA分离试剂盒（Omega Bio-Tek,Norcross,GA,美国）提取完 整RNA。使用NanoDrop8000分光光度计（Thermo Scientific）测定提取的RNA的浓度， 并且将其在使用之前贮存在-80°C的低温。在实验中，作为不适宜的样品，浓度小于40ng/μl 并且A260/A280比率小于1.5或A260/230比率小于1.0的RNA样品不用分析中。

实施例3：全基因组表达概况（Whole genome expression profiling）

根据制造商的说明书，用200ng实施例2中提取的RNA进行Illumina全基因组DASL（Illumina Whole-Genome DASL）（cDNA介导的复性、选择、延长和连接，Illumina， 美国）测定法。首先，通过以下方式制备PCR模板：使用生物素化的寡-dT（biotinylated  oligodT）引物和随机引物（random primers）将完整RNA逆转录成cDNA，使生物素化的 cDNA与一对查询寡聚物（query oligos）复性，延伸查询寡聚物之间的空位并且随后连接。 随后，使用一对通用PCR引物（universal PCR primers）扩增的PCR产物与人Ref-8表达 珠芯片（humanRef-8Expression BeadChip）（>24,000种注释的转录物）杂交。在杂交后， 使用iScan（Illumina，美国）扫描人Ref-8珠芯片。

实施例4：全基因组DASL测定法的质量控制（Quality control of Whole-Genome DASL  assay）

过滤并且移除在实施例3中使用的人Ref-8表达珠芯片的24,526种探针当中称作“不 存在”的探针。过滤后留下的17,418种探针用于稍后的分析中。将探针的强度通过以2） 为底数的对数（logarithm with base2）进行修正并且使用分位数归一化算法归一化 （normalization）。作为结果，使用17,418种探针和432份样品进行统计分析。

实施例5：胃癌预测基因的鉴定

为了鉴定其表达水平与临床结果如无疾病存活（disease free survival，DFS）相关的基 因，使用Cox比例风险模型（Cox proportional hazard model）进行标准统计分析（standard  statistical analysis），以处理作为连续变量（continuous variables）的基因表达水平。作为结 果，通过单变量分析（Univariate analysis）鉴定到17,418种探针当中与无疾病存活率存在 显著相关的369种探针，并且表2中显示了该结果（p<0.001）。

此外，由于重要的是预测Ib/II期（stage Ib/II）患者的预后，用样品中从Ib/II期患者 采集的样品作为对象、以同上文一样的方式鉴定对Ib/II期特异的胃癌预后基因，并且表 3中显示了该结果。表3中的p值（p value）代表基因表达水平对临床预后的影响程度， 其中较低的p值更显著地影响预后，并且风险比代表对胃癌复发率的影响程度，数字增加 或下降具有显著的含义。

根据表2和表3，鉴定到众多Ib/II期特异性预后基因的存在，不过采用整组患者作 为对象所鉴定到的预后基因与采用Ib/II期患者作为对象所鉴定到的预后基因重合。

表2

表3

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1736078 THBS4 NM_003248.3 1.38572E-06 1.682498015 ILMN_1713561 C20orf103 NM_012261.2 2.55588E-06 1.478694678 ILMN_1776490 C17orf53 NM_024032.2 6.03826E-06 0.34241099 ILMN_1755318 HIST1H2AJ NM_021066.2 1.2522E-05 0.470375569 ILMN_1769168 ARL10 NM_173664.4 1.4066E-05 1.561604462 ILMN_2180606 NAT13 NM_025146.1 1.73444E-05 0.33114386 ILMN_1726815 HIST1H3G NM_003534.2 2.23113E-05 0.599169194 ILMN_1663786 EPB41 NM_203342.1 5.97621E-05 0.488778032 ILMN_1789955 PNRC1 NM_006813.1 7.41079E-05 1.448627279 ILMN_1762003 SEC62 NM_003262.3 8.06626E-05 0.374133795 ILMN_1757060 CAMK2D NM_172115.1 8.99236E-05 0.276235186 ILMN_1721127 HIST1H3D NM_003530.3 0.000100991 0.360536141 ILMN_2390544 DKFZP564J102 NM_015398.2 0.000123879 1.538277475 ILMN_2249018 LOC389816 NM_001013653.1 0.000139453 0.427195449 ILMN_1694877 CASP6 NM_001226.3 0.000139804 0.325712607 ILMN_2103685 DEPDC1B NM_018369.1 0.00014085 0.366505298 ILMN_1694472 GCK NM_033508.1 0.000145382 1.428117308 ILMN_1769207 KCTD7 NM_153033.1 0.000190952 1.585238708 ILMN_1738116 TMEM119 NM_181724.1 0.000198141 1.489761712 ILMN1725314 GBP3 NM_018284.2 0.000198903 0.361133685 ILMN_1784871 FASN NM_004104.4 0.000207395 0.056877471 ILMN_1652716 THEX1 NM_153332.2 0.000207846 0.288484984 ILMN_2050761 EIF4E NM_001968.2 0.00025774 0.385622247 ILMN_1747911 CDC2 NM_001786.2 0.000263771 0.568007158 ILMN_1795340 TMPO NM_001032283.1 0.000264185 0.26979899 ILMN_1780769 TUBB2C NM_006088.5 0.00027646 0.339197541 ILMN_2318430 EIF5 NM_001969.3 0.000283832 0.321862089 ILMN_2051373 NEK2 NM_002497.2 0.000305397 0.631359834 ILMN_1736176 PLK1 NM_005030.3 0.000307467 0.515204021 ILMN_1742238 SET NM_003011.2 0.000327498 0.403070785 ILMN_2159044 PDF NM_022341.1 0.000327825 0.457651002 ILMN_1678669 RRM2 NM_001034.1 0.000346452 0.717686042 ILMN_1721963 MEN1 NM_130801.1 0.000353953 0.671478274 ILMN_1701331 UBE2M NM_003969.3 0.000388326 0.036042361 ILMN_1797693 BRI3BP NM_080626.5 0.000397118 0.239964969 ILMN_2375386 RNPS1 NM_080594.1 0.000413055 0.225058918 ILMN_2390974 DNAJB2 NM_006736.5 0.00042772 11.00703115 ILMN_1727709 GPBAR1 NM_170699.2 0.00045926 1.658706421

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1792110 C10orf76 NM_024541.2 0.000466902 1.369140571 ILMN_2041327 MRPL37 NM_016491.2 0.000469554 0.053735215 ILMN_1680419 ASB7 NM_024708.2 0.000480501 0.417937044 ILMN_1684873 ARSD NM_001669.2 0.000494954 1.491248628 ILMN_2414399 NME1 NM_000269.2 0.000513696 0.635435354 ILMN_1729368 FZD8 NM_031866.1 0.000538803 1.491192988 ILMN_2354269 FAM164C NM_024643.2 0.000560341 0.580400914 ILMN_2220187 GFPT1 NM_002056.1 0.000563592 0.444796775 ILMN_1693669 WDR79 NM__018081.1 0.000579389 0.432824705 ILMN_2155998 PSMD6 NM_014814.1 0.000581349 0.42069481 ILMN_2116556 LSM5 NM_012322.1 0.00059526 0.244672115 ILMN_1695079 ZNF101 NM_033204.2 0.000608109 0.497757641 ILMN_1661424 THAP6 NM_144721.4 0.000613204 0.505963223 ILMN_1705861 AP1M2 NM_005498.3 0.000620207 0.487707134 ILMN_1788489 HIST1H3F NM_021018.2 0.000652917 0.536377137 ILMN_1740842 SALL2 NM_005407.1 0.000652976 1.634825796 ILMN_1677794 BRCA2 NM_000059.3 0.000653428 0.521624269 ILMN_1712755 LRRC41 NM_006369.4 0.000655598 0.254806566 ILMN_1765532 RDBP NM_002904.5 0.000661777 0.226006062 ILMN_1655734 BXDC5 NM_025065.6 0.000691174 0.321806825 ILMN_1665515 MGC4677 NR_024204.1 0.000696851 0.379310859 ILMN_1652280 FBXO32 NM_058229.2 0.000697182 4.158410279 ILMN_1758067 RGS4 NM_005613.3 0.000731812 1.448721169 ILMN_1677636 COMP NM_000095.2 0.000731916 1.358640294 ILMN_2148796 MND1 NM_032117.2 0.000846675 0.525138393 ILMN_1804090 SLC25A10 NM_012140.3 0.000856602 0.410793488 ILMN__2358914 SLC35C2 NM_015945.10 0.000884827 0.309429971 ILMN_1771385 GBP4 NM_052941.3 0.000892961 0.535961124 ILMN_1780667 WDR51A NM_015426.3 0.000908419 0.509178934 ILMN_1710752 NAPRT1 NM_145201.3 0.000910567 0.122773656 ILMN_1774589 IQCC NM_018134.1 0.000939997 0.39966678 ILMN_1732158 FMO2 NM_001460.2 0.000962173 1.34318011 ILMN_1735453 FAM98A NM_015475.3 0.000981164 0.237917743 ILMN_2265759 SLC2A11 NM_030807.2 0.001008065 1.348676454 ILMN_2190292 UGT8 NM_003360.2 0.001008405 0.335985912 ILMN_2258471 SLC30A5 NM_022902.2 0.001009148 0.353367403 ILMN_1801205 GPNMB NM_001005340.1 0.001012932 1.569348784 ILMN_2224990 HIST1H4J NM_021968.3 0.001040369 0.433804745 ILMN_2396875 IGFBP3 NM_000598.4 0.001056099 1.496136094 ILMN_2079004 MDH2 NM_005918.2 0.001059324 0.098117309 ILMN_2103480 ZNF320 NM_207333.2 0.001120173 0.515683347 ILMN_1756849 HIST1H2AE NM_021052.2 0.001128782 0.55825351 ILMN_1751264 CCDC126 NM_138771.3 0.001131162 0.539458225

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1670638 PITPNC1 NM_181671.1 0.001156364 1.432837149 ILMN1805404 GRIN1 NM_021569.2 0.001179724 0.646993195 ILMN_1735108 ANKS6 NM_173551.3 0.001190605 0.531136784 ILMN_1710428 CDC2 NM_001786.2 0.00120549 0.30663512 ILMN_1674620 SGCE NM001099400.1 0.001211609 1.454072287 ILMN_1694400 MSR1 NM_138715.2 0.001211833 1.467532171 ILMN_2088847 OTUD5 NM_017602.2 0.00121411 0.378973971 ILMN2160209 TACSTD1 NM_002354.1 0.001214616 0.429796469 ILMN_1803376 AEBP2 NM_153207.3 0.001233925 0.379590397 ILMN_1685431 DZIP1 NM_198968.2 0.001245864 1.355178613 ILMN_2287276 FAM177A1 NM_173607.3 0.001259789 0.515786967 ILMN2241317 FOXK2 NM_004514.3 0.001263375 0.633792641 ILMN_1656192 ZNF704 NM_001033723.1 0.001275697 1.462816957 ILMN_1708105 EZH2 NM_152998.1 0.001284332 0.53646297 ILMN_1778617 TAF9 NM_001015891.1 0.001312314 0.437194069 ILMN_1678423 SPA17 NM_017425.2 0.001322915 0.31024646 ILMN_1735004 C4orf43 NM_018352.2 0.001330807 0.451219666 ILMN_1766264 PI16 NM_153370.2 0.001342722 1.54312461 ILMN_1651429 SELM NM_080430.2 0.001350332 7.120826545 ILMN_1652198 CCM2 NM_001029835.1 0.001360123 1.478634628 ILMN_1651872 UBIAD1 NM_013319.1 0.001363479 0.483856217 ILMN_1747353 KIF27 NM_017576.1 0.001366794 0.305754215 ILMN_1735958 METTL2B NM_018396.2 0.001372067 0.497518932 ILMN_2130441 HLA-H U60319.1 0.001383524 1.309869151 ILMN_2320250 NOL6 NM_022917.4 0.001386545 0.198070845 ILMN_1710170 PPAP2C NM_177526.1 0.001395701 0.643357078 ILMN_1719870 GCUD2 NM_207418.2 0.001456501 0.604998995 ILMN_2181060 CKAP2 NM_001098525.1 0.001459646 0.663378155 ILMN_1669928 ARHGEF16 NM_014448.2 0.001462437 0.435748845 ILMN_2233099 SSRP1 NM_003146.2 0.001462983 0.313100651 ILMN_1788886 TOX NM_014729.2 0.001464337 1.382074069 ILMN_2150894 ALDH1B1 NM_000692.3 0.001471083 0.478898918 ILMN_2148469 RASL11B NM_023940.2 0.001485489 1.301724101 ILMN_1734766 C6orf182 NM_173830.4 0.001504844 0.352005589 ILMN_1811790 FOXS1 NM_004118.3 0.001525515 1.493899582 ILMN_1711543 C14orf169 NM_024644.2 0.001566629 0.378006897 ILMN_1660698 GTPBP8 NM_014170.2 0.001588061 0.40836939 ILMN_1721868 KPNA2 NM_002266.2 0.001617872 0.566719073 ILMN_2344971 FOXM1 NM_202003.1 0.001627322 0.668830609 ILMN_2120340 RUVBL2 NM_006666.1 0.001643506 0.641655709 ILMN1738938 TIMM8B NM_012459.1 0.001649996 0.507398524 ILMN_1718387 LOR NM_000427.2 0.001653634 1.304994604 ILMN_2388517 MTERFD3 NM_001033050.1 0.001661168 0.298295273

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1795063 ZADH2 NM_175907.3 0.001673092 1.385143264 ILMN_1695579 CIT NM_007174.1 0.001678569 0.631478718 ILMN_1767448 LHFP NM_005780.2 0.001686324 1.649522164 ILMN_1712803 CCNB1 NM_031966.2 0.001729899 0.698597294 ILMN_1715583 BOP1 NM_015201.3 0.001745263 0.427680383 ILMN_1685343 NUPL1 NM_001008565.1 0.001752276 0.531577742 ILMN_1790781 DHRS13 NM_144683.3 0.00180559 0.373621553 ILMN_2152387 DOCK7 NM_033407.2 0.001860415 0.372834463 ILMN_2223836 CHORDC1 NM_012124.1 0.001888776 0.314995736 ILMN_1775925 HIST1H2BI NM_003525.2 0.00191329 0.215094156 ILMN_2310909 ATP2A3 NM_174955.1 0.001920605 0.640714872 ILMN_1799999 LRRCC1 NM_033402.3 0.001933642 0.310223122 ILMN_1765258 HLA-E NM_005516.4 0.001962169 0.41448045 ILMN_1693604 GRM2 NM_000839.2 0.001964674 0.605639742 ILMN_2396020 DUSP6 NM_001946.2 0.001989538 0.440365228 ILMN_2215370 WWP1 NM_007013.3 0.002004931 0.410021251 ILMN_1732127 RBKS NM_022128.1 0.002028283 0.519499482 ILMN_1709451 TFPT NM_013342.2 0.00203197 2.444929835 ILMN_1753467 SAMD4B NM_018028.2 0.002084896 1.944528201 ILMN_1797893 PFAAP5 NM_014887.1 0.002089509 1.780690735 ILMN_2413898 MCM10 NM_018518.3 0.002098445 0.746035804 ILMN_1689086 CTSC NM_001814.2 0.002101771 0.357197864 ILMN_2363668 YIF1B NM_001039673.1 0.002144846 0.395212683 ILMN_1737195 CENPK NM_022145.3 0.002181123 0.652279 ILMN_1749789 HIST1H1D NM_005320.2 0.002196903 0.45086036 ILMN_1760153 GATA5 NM_080473.3 0.00224015 1.333301072 ILMN_2369018 EVI2A NM_014210.2 0.002248908 1.53070581 ILMN_2294653 PDE5A NM_033437.2 0.00226466 1.325372841 ILMN_1742307 MEST NM_177524.1 0.002265982 0.384915559 ILMN_2207865 HIST1H3I NM_003533.2 0.002313157 0.390719052 ILMN_2061043 CD48 NM_001778.2 0.002343934 1.4403949 ILMN_2307656 AGTRAP NM_001040196.1 0.002353483 0.476416601 ILMN_1737709 RPL10L NM_080746.2 0.002355167 0.592421921 ILMN_1777156 GTPBP3 NM_032620.1 0.002378577 0.458656308 ILMN_2058141 HMGN2 NM_005517.3 0.00240793 0.396669549 ILMN1700413 MAFF NM_152878.1 0.002420337 0.473434773 ILMN_1688755 AAK1 NM_014911.2 0.0024249 1.443142271 ILMN_1656415 CDKN2C NM_078626.2 0.002445334 1.363082198 ILMN_1773080 OAZ1 NM_004152.2 0.002463203 0.006652434 ILMN_1655052 TRNT1 NM_016000.2 0.002469548 0.453240253 ILMN_1763491 CKMT1B NM_020990.3 0.002479888 0.696617712 ILMN_2349459 BIRC5 NM_001012271.1 0.002493781 0.632059133 ILMN_1693597 ZNF287 NM_020653.1 0.002546359 1.321302822

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1791149 ARL6IP4 NM_001002252.1 0.002559255 0.445204912 ILMN_2191634 RPL37 NM_000997.3 0.002566623 0.439638182 ILMN_1692511 TMEM106C NM_024056.2 0.002584001 0.410086273 ILMN_2336335 40245 NM_006231.2 0.002594922 1.492701021 ILMN_1670903 NAT2 NM_000015.2 0.002621283 0.394117706 ILMN2350183 ST5 NM_213618.1 0.00264123 1.71088169 ILMN_1806473 BEX5 NM_001012978.2 0.00264497 1.405290668 ILMN1745108 ADAD2 NM_139174.2 0.002650355 0.564020967 ILMN_2208455 DDHD1 NM_030637.1 0.002666187 0.62040113 ILMN2289381 DKK3 NM_015881.5 0.002677686 1.273699695 ILMN_2093500 ZBED5 NM_021211.2 0.002686929 1.593462221 ILMN_1676215 DLG2 NM_001364.2 0.002687616 1.393751447 ILMN_1746435 HIST1H1E NM_005321.2 0.002709568 0.426535974 ILMN_1681757 FAM80B NM_020734.1 0.002716862 1.385585016 ILMN_1814282 ISG20L1 NM_022767.2 0.002720111 0.401067743 ILMN_1695107 IL20RA NM_014432.2 0.002727132 0.391212161 ILMN_1704261 RANGRF NM_016492.3 0.002732176 0.561395184 ILMN_1742544 MEF2C NM_002397.2 0.002763958 1.634742949 ILMN_1800420 RNF214 NM_207343.2 0.002818409 0.441702219 ILMN_2115696 USP42 NM_032172.2 0.002826683 1.254016918 ILMN_2369104 TRAPPC6B NM_177452.3 0.002836961 0.537255223 ILMN_1811426 TMTC1 NM_175861.2 0.002846937 1.449228612 ILMN_1679641 FAM120B NM_032448.1 0.00286719 0.700685077 ILMN_2191436 POLA1 NM_016937.3 0.002880446 0.291792953 ILMN_1708160 KPNA2 NM_002266.2 0.002920159 0.671481421 ILMN_1752249 FAM38A NM_014745.1 0.002968991 5.849847658 ILMN_2414027 CKLF NM_001040138.1 0.003007182 0.536219708 ILMN_1748147 MTO1 NM_133645.1 0.003021874 0.435348875 ILMN_1688231 TREM1 NM_018643.2 0.003038524 0.404373704 ILMN_2071826 RNF152 NM_173557.1 0.003053367 1.396524052 ILMN_1720542 POLR2I NM_006233.4 0.00316402 0.710946957 ILMN_1718334 ITPA NM_033453.2 0.003165015 0.441320307 ILMN_1731374 CPE NM_001873.1 0.003168171 1.387565375 ILMN_2099045 KIAA1524 NM_020890.1 0.003184317 0.397921546 ILMN_1774350 MYOZ3 NM_133371.2 0.003202754 1.362439801 ILMN_2395926 MANBAL NM_022077.3 0.003220826 0.446106468 ILMN_1814002 TEAD3 NM_003214.3 0.00322364 0.508063459 ILMN_2351916 EX01 NM_006027.3 0.00323852 0.621409496 ILMN_1785005 NCF4 NM_013416.2 0.003244984 1.852600594 ILMN_2082810 BRD7 NM_013263.2 0.003247679 0.445190505 ILMN_1702858 ADHFE1 NM_144650.2 0.003259448 1.522440502 ILMN_1815385 SMAD9 NM_005905.3 0.003266862 1.486381567 ILMN_1699665 CLIC6 NM_053277.1 0.003268017 1.394934339

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1672660 MBP NM_001025100.1 0.003308632 1.307617077 ILMN_1710495 PAPLN NM_173462.3 0.003317357 1.555971585 ILMN_1788955 PDLIM1 NM_020992.2 0.003335768 0.36434918 ILMN_1750130 GSPT1 NM_002094.2 0.003432206 0.561549921 ILMN_1715175 MET NM_000245.2 0.00344409 0.408579482 ILMN_1688041 TMEM53 NM_024587.2 0.003458129 0.460287691 ILMN_1693333 TMEM19 NM_018279.3 0.003507351 0.36821929 ILMN_1688848 TMEM44 NM_138399.3 0.003510688 0.444391423 ILMN_2379527 ELM01 NM_014800.9 0.003566733 1.44357207 ILMN_1729713 RAB23 NM_183227.1 0.003569889 1.290055449 ILMN_1717262 PROCR NM_006404.3 0.003588508 0.481142471 ILMN_1722829 HLF NM_002126.4 0.003592205 1.387440105 ILMN_1653165 AAMP NM_001087.3 0.003625108 0.51315174 ILMN_1652826 LRRC17 NM_005824.1 0.0036285 1.338749637 ILMN_1653200 SLC22A17 NM_020372.2 0.003656112 1.452161875 ILMN_2076250 GPBP1L1 NM_021639.3 0.003660253 0.525101894 ILMN_1731610 ABLIM1 NM_006720.3 0.00367075 1.420084637 ILMN_1653001 CABLES1 NM_138375.1 0.003735355 0.421734171 ILMN_1670609 ATOX1 NM_004045.3 0.003736891 4.196917472 ILMN_1714197 ACSS2 NM_139274.1 0.003759326 0.144997669 ILMN_2367070 ACOT9 NM_001033583.2 0.003773424 0.439029956 ILMN_1757406 HIST1H1C NM_005319.3 0.00377794 0.545763401 ILMN_1815010 RNF141 NM_016422.3 0.003799608 0.499957309 ILMN_1687589 CPT1A NM_001876.2 0.003816375 0.556334372 ILMN_1702265 HDHD2 NM_032124.4 0.003820466 0.255780221 ILMN_1776577 DSCC1 NM_024094.2 0.003827106 0.445375329 ILMN_1680692 NUCKS1 NM_022731.2 0.003830411 0.352050942 ILMN_2301083 UBE2C NM_181803.1 0.00384705 0.746466822 ILMN_1660636 WWOX NM_130844.1 0.003850247 0.389587873 ILMN_2252408 CNPY4 NM_152755.1 0.003872081 1.926411669 ILMN_2122374 FAM49B NM_016623.3 0.003874185 0.475549021 ILMN_1679809 GSTP1 NM_000852.2 0.00390375 12.13414752 ILMN_1739645 ANLN NM_018685.2 0.003925781 0.565399848 ILMN_1804419 LRMP NM_006152.2 0.003992031 1.293737566 ILMN_2330410 EIF3C NM_003752.3 0.004011169 0.321444331 ILMN_1696380 GHRL NM_016362.2 0.004018356 1.26994829 ILMN_1787280 C1orf135 NM_024037.1 0.004058179 0.650335614 ILMN_1736178 AEBP1 NM_001129.3 0.004064418 2.22040315 ILMN_1801939 CCNB2 NM_004701.2 0.004065318 0.738524159 ILMN_1682375 ATPBD3 NM_145232.2 0.004071346 0.47285411 ILMN_1657701 TMEM137 XR_017971.1 0.004078655 0.178899275 ILMN_1662419 COX7A1 NM_001864.2 0.004102612 1.701574095 ILMN_1708041 PLEKHF1 NM_024310.4 0.004131276 1.32143517

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1667641 ACACA NM_198834.1 0.004154722 1.323720243 ILMN_1682675 TWF1 NM_002822.3 0.004217274 0.474590351 ILMN_2123402 TMEM4 NM_014255.4 0.00423593 0.426349629 ILMN_1720484 CRTAP NM_006371.3 0.004250147 1.390315752 ILMN_1756982 CLIC1 NM_001288.4 0.004251433 0.262265066 ILMN_2315964 PSRC1 NM_001032290.1 0.004265342 0.446786367 ILMN_1738704 TRIM26 NM_003449.3 0.004269347 0.598757026 ILMN_1713178 FAM116A XM_001132771.1 0.004275545 0.563919761 ILMN_1814856 C9orf7 NM_017586.1 0.004277418 0.424020863 ILMN_1755504 CALCOCO2 NM_005831.3 0.004300376 1.498460692 ILMN_1764694 ZFP14 NM_020917.1 0.004300529 1.492032427 ILMN_1718265 ATG5 NM_004849.2 0.004309361 0.314797866 ILMN_1764850 HPCAL1 NM_134421.1 0.004323109 0.564769594 ILMN_1677652 PREX2 NM_024870.2 0.004337807 1.291465793 ILMN_2362293 FBXO38 NM_205836.1 0.004344345 0.30957276 ILMN_2184231 CHRDL1 NM_145234.2 0.004355928 1.405989697 ILMN_1674337 FKBP2 NM_057092.1 0.004365515 0.552251971 ILMN_1673380 GNG12 NM_018841.4 0.004429613 2.220091452 ILMN_1730347 CCDC115 NM_032357.2 0.004442253 1.299753115 ILMN_1752589 TMEM183A NM_138391.4 0.004454617 0.582347893 ILMN_1692790 ITGB3BP NM_014288.3 0.004456606 0.283335019 ILMN_1680626 PDIA6 NM_005742.2 0.004486813 0.438758243 ILMN_1789040 SLITRK5 NM__015567.1 0.004487421 1.58800473 ILMN_2221046 GM2A NM_000405.3 0.004499557 1.343681008 ILMN_2392818 RTKN NM_D33046.2 0.004504209 0.380099265 ILMN_1691559 ELF2 NM_006874.2 0.004539554 1.445911237 ILMN_2120965 NPAT NM_002519.1 0.004608556 1.53213071 ILMN_1761772 NUP155 NM_153485.1 0.004609259 0.787766929 ILMN_1768969 LBR NM_194442.1 0.004612078 0.381969617 ILMN_1669931 TM9SF3 NM_020123.2 0.004639769 0.455109316 ILMN_1731194 STRAP NM_007178.3 0.004663374 0.486661013 ILMN_1665717 EIF2S3 NM_001415.3 0.00466426 0.607788466 ILMN_2076567 UBE2V2 NM_003350.2 0.004673328 0.376889407 ILMN_1815570 HOXA6 NM_024014.2 0.004677877 1.315082473 ILMN_1704943 ATPBD1C NM_016301.2 0.004692424 0.45831831 ILMN_1681304 PAN3 NM_175854.5 0.004694593 0.336691298 ILMN_1754842 DLGAP4 NM_014902.3 0.004695897 1.500771594 ILMN_2397347 SEMG1 NM_198139.1 0.004704468 0.504369353 ILMN_1766983 FBXW11 NM_033644.2 0.004733209 1.373759174 ILMN_1715607 CHMP4A NM_014169.2 0.004813934 0.599264497 ILMN_1657148 C19orf23 NM_152480.1 0.004839756 0.777157317 ILMN_1749213 SDF2L1 NM_022044.2 0.004874196 0.117041269 ILMN_1664761 TMEM138 NM_016464.3 0.004884175 1.768386882

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1782403 PRR11 NM_018304.2 0.004895172 0.692001418 ILMN_1749583 KIAA1285 NM_015694.2 0.004895535 0.485704875 ILMN_2294274 S100PBP NM_022753.2 0.004902704 0.348252651 ILMN_2089977 FKBP9L NM_182827.1 0.004925827 1.35715531 ILMN_1708143 FAM127A NM_001078171.1 0.004940424 1.536857038 ILMN_1687947 HIST1H2BE NM_003523.2 0.004945146 0.60890965 ILMN_1790741 RNF126 NM_194460.1 0.004999963 0.403652191 ILMN_2084391 RAD18 NM_020165.2 0.005021514 0.478869988 ILMN_1700975 ENSA NM_207168.1 0.005023952 0.597039464 ILMN_1758529 P2RX1 NM_002558.2 0.005040437 1.331690952 ILMN_1653824 LAMC2 NM_018891.1 0.005053334 0.510397105 ILMN_1673673 PBK NM_018492.2 0.005072448 0.502353808 ILMN_2188451 HIST1H2AH NM_080596.1 0.005091975 0.56869136 ILMN_1729430 FBXO18 NM_032807.3 0.005096865 0.409638443 ILMN_2145670 TNC NM_002160.2 0.005099349 0.44945639 ILMN_1799113 CCDC41 NM_016122.2 0.005124666 0.331541717 ILMN_1694177 PCNA NM_182649.1 0.005131856 0.431824254 ILMN_2365176 ALDH8A1 NM_022568.2 0.0051498 0.578765996 ILMN_1703791 ANXA7 NM_004034.1 0.005194134 0.520011299 ILMN_1653432 HNRPDL NR_003249.1 0.00519902 1.962006317 ILMN_1711470 UBE2T NM_014176.2 0.005212905 0.70825341 ILMN_1672876 MFI2 NM_05929.4 0.005216636 0.688790743 ILMN_1803956 BOC NM_033254.2 0.005222405 1.56055792 ILMN_1793959 ADPGK NM_031284.3 0.005222668 0.622209617 ILMN_2141118 C15orf59 NM_001039614.1 0.005232281 1.288389631 ILMN_1740265 ACOT7 NM_181864.2 0.005276176 0.42513968 ILMN_1705515 UPF3A NM_080687.1 0.005335596 0.555924796 ILMN_1747870 CD3EAP NM_012099.1 0.005335819 0.431594263 ILMN_1662935 C1QTNF7 NM_031911.3 0.005340141 1.400132792 ILMN_2408796 C190rf28 NM_174983.3 0.005377619 0.535188081 ILMN_1808748 CLCN6 NM_001286.2 0.005389385 0.448798804 ILMN_2347999 IFNAR2 NM_207585.1 0.00540236 0.394741019 ILMN_1759184 C190rf48 NM_199250.1 0.005420614 0.262738545 ILMN_2402392 COL8A1 NM_001850.3 0.005441026 1.506073801 ILMN_1670542 AK2 NM_001625.2 0.005456193 0.4642596 ILMN_1815306 AP2A1 NM_014203.2 0.005479068 0.45782699 ILMN_1665982 AKTIP NM_022476.2 0.005552907 1.426606686 ILMN_1754476 TRIM15 NM_033229.2 0.005599962 0.672365812 ILMN_1715789 DOCK1 NM_001380.3 0.005637866 1.290809728 ILMN_2140207 ATPBD4 NM_080650.2 0.005687417 0.465173775 ILMN_1707257 HIST1H3J NM_003535.2 0.00569548 0.411868035 ILMN_2330341 TCEAL4 NM_024863.4 0.005697718 1.905792982 ILMN_2371964 MRPS12 NM_021107.1 0.005734333 0.338999466

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1793888 SERPINB5 NM_002639.3 0.005756119 0.759749969 ILMN_1715616 PPIL5 NM_203467.1 0.005771905 0.454389155 ILMN_1702526 C17orf48 NM_020233.4 0.005799246 1.355222195 ILMN_1739076 HIST1H2BO NM_003527.4 0.005801406 0.73401284 ILMN_2075714 ZNF284 NM_001037813.2 0.005824027 1.411449642 ILMN_1814151 AGR2 NM_006408.2 0.005831268 0.504940913 ILMN_1738684 NRXN2 NM_138734.1 0.005836232 1.418214009 ILMN_2065022 KIAA0672 NM_014859.4 0.00584505 1.279720801 ILMN_2402168 EXOSC10 NM_001001998.1 0.005845299 0.518518591 ILMN_1803570 BRI3BP NM_080626.5 0.00584885 0.795690999 ILMN_2103362 ARHGAP27 NM_199282.1 0.005891206 0.487395295 ILMN_1731048 TLR1 NM_003263.3 0.005909894 0.354107909 ILMN_1813295 LMO3 NM_018640.3 0.00592348 1.417834019 ILMN_1676058 MAGOHB NM_018048.3 0.005932808 0.466547235 ILMN_2255133 BCL11A BCL11A 0.005943127 0.464319877 ILMN_2311537 HMGA1 NM_145902.1 0.005946164 0.801243797 ILMN_1718853 UQCRC2 NM_003366.2 0.005980146 0.513524684 ILMN_1776845 HIST1H3A NM_003529.2 0.005985544 0.710949575 ILMN_1672122 PH-4 NM_177938.2 0.005995002 0.5034317 ILMN_1651229 IP013 NM_014652.2 0.006001369 2.321489493 ILMN_2217661 SREBF2 NM_004599.2 0.006020596 0.42538648 ILMN_2115340 HIST2H4A NM_003548.2 0.006051534 0.723953441 ILMN_1662140 SGPP2 NM_152386.2 0.006053142 0.735761893 ILMN_2362368 U2AF1 NM_001025203.1 0.006055125 0.543969023 ILMN_1710070 PCSK6 NM_138320.1 0.00611501 0.72158868 ILMN_2358783 ASB3 NM_016115.3 0.006128461 0.496862366 ILMN_2407464 FASTK NM_006712.3 0.006201308 0.537689921 ILMN_2382990 HK1 NM_033498.1 0.006216229 2.353179628 ILMN_2143685 CLDN7 NM_001307.4 0.00624499 0.7855261 ILMN_1726108 LASS2 NM_181746.2 0.006250473 0.422395144 ILMN_1734867 NR2C1 NM_003297.1 0.006253786 0.575169323 ILMN_1788180 RAB13 NM_002870.2 0.006265118 0.448550857 ILMN_1720595 MDGA1 NM_153487.3 0.006287087 1.594869983 ILMN_2162358 ZNF597 NM_152457.1 0.006307603 1.269525875 ILMN_1717393 PTCHD1 NM_173495.2 0.006308428 1.365299066 ILMN_1688033 HPS5 NM_181507.1 0.006328446 1.350346589 ILMN_1664815 ELK4 NM_001973.2 0.006330513 0.648779128 ILMN_2388070 TMEM44 NM_138399.3 0.006349048 0.462595584 ILMN_1666096 ACSL3 NM_004457.3 0.006367395 1.470484977 ILMN_1717757 CALML4 NM_001031733.2 0.006395212 0.732505749 ILMN_2116827 RGPD1 NM_001024457.1 0.006400663 1.273196499 ILMN_1684647 ILKAP NM_030768.2 0.006420595 0.520137067 ILMN_1795507 ABCA6 NM_080284.2 0.00645301 1.266389585

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1726030 GPX7 NM_015696.3 0.006505417 1.319011509 ILMN_2336595 ACSS2 NM_018677.2 0.006519276 0.377268086 ILMN_1653251 HIST1H1B NM_005322.2 0.006533608 0.61504306 ILMN_2250923 FOXP1 NM_032682.4 0.006544389 0.435456884 ILMN_1694759 C19orf42 NM_024104.3 0.006574444 0.480847866 ILMN_2230025 PDLIM3 NM_014476.1 0.006617224 1.749382931 ILMN_1812970 RWDD1 NM_016104.2 0.006651454 1.274265391 ILMN_1733559 LOC100008589 NR_003287.1 0.006655633 0.05494194 ILMN_2214278 ANKRD32 NM_032290.2 0.006672263 0.407002498 ILMN_2364928 APBA2BP NM_031231.3 0.006674687 0.476662735 ILMN_2368721 CENPM NM_024053.3 0.006681262 0.775688614 ILMN_2042651 EVI2B NM_006495.3 0.006709516 0.398923979 ILMN_1757536 USP40 NM_018218.2 0.006719019 0.443606755 ILMN_1743579 WDR4 NM_033661.3 0.006719975 0.586652104 ILMN_1794017 SERTAD1 NM_013376.3 0.006766851 1.477182017 ILMN_2192683 DHX37 NM_032656.2 0.006803347 0.144674391 ILMN_2148452 BCAS2 NM_005872.2 0.00688614 0.394539719 ILMN_1805778 RBM12B NM_203390.2 0.006906573 1.534168009 ILMN_1658821 SAMD1 NM_138352.1 0.006914193 0.710097017 ILMN_2072357 IRF6 NM_006147.2 0.006953237 0.502557868 ILMN_1740508 KCNMA1 NM_001014797.1 0.006971733 1.4569512 ILMN_2401779 FAM102A NM_001035254.1 0.007011925 0.251786364 ILMN_2330570 LEPR NM_002303.3 0.007074066 1.44870954 ILMN_1675106 YIPF2 NM_024029.3 0.007074451 0.454951256 ILMN_1784367 HSPD1 NM_002156.4 0.007116294 0.729230188 ILMN_1798254 ACTR10 NM_018477.2 0.00713915 0.456078802 ILMN_2061950 RABGAP1 NM_012197.2 0.007143416 1.909688817 ILMN_1657836 PLEKHG2 NM_022835.1 0.007225484 1.409139505 ILMN_2073307 IL10 NM_000572.2 0.007235338 0.581576619 ILMN_1669023 FHL5 NM_020482.3 0.007238126 1.314020057 ILMN_2413251 EWSR1 NM_005243.2 0.007243401 0.497456343 ILMN_1692779 PRPF39 NM_017922.2 0.007254878 0.410654488 ILMN_1803338 CCDC80 NM_199511.1 0.007368666 1.892126506 ILMN_2316918 PANK1 NM_148978.1 0.007397188 0.417679556 ILMN_1781400 SLC7A2 NM_001008539.2 0.007413353 1.515745654 ILMN_1799289 MRPL55 NM_181454.1 0.007420628 0.461570361 ILMN_2410924 PLOD2 NM_000935.2 0.007437692 1.876219594 ILMN_1684931 GPR119 NM_178471.1 0.007438219 0.463748761 ILMN_2138589 MERTK NM_006343.2 0.007438466 1.473780814 ILMN_1671557 PHLDA2 NM_003311.3 0.00745336 0.620891122 ILMN_1809101 STEAP2 NM_152999.3 0.007473192 1.405229708 ILMN_2381037 LIMS1 NM_004987.3 0.007479728 0.506576202 ILMN_1723522 APOLD1 NM_030817.1 0.007500182 1.273846061

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_2292178 CLEC12A NM_201623.2 O.007513142 1.293618589 ILMN_2294684 CEP170 NM_014812.2 O.007567842 0.492080122 ILMN_2331163 CUL4A NM_003589.2 O.007580851 O.677020715 ILMN_2209163 CHD6 NM_032221.3 O.007605645 O.532521441 ILMN_1777263 MEOX2 NM_005924.4 O.007648662 1.344671457 ILMN_1688666 HIST1H2BH NM_003524.2 0.007688938 O.679188681 ILMN_2064926 ITFG1 NM_030790.3 O.007689192 O.430133813 ILMN_1812795 RUNX1T1 NM_175636.1 O.007693535 1.234743018 ILMN_1783908 B3GNT9 NM_033309.2 0.007740725 0.548726198 ILMN_1689438 BTRC NM_033637.2 O.007752648 1.397535008 ILMN_1687652 TGFB3 NM_003239.1 O.007770746 1.352457691 ILMN_1695025 CD2 NM_OO1767.3 O.007797265 1.313736386 ILMN_1749846 OMD NM_005014.1 O.007801275 1.462435251 ILMN_1807945 ANP32A NM_006305.2 0.0078657 0.54232047 ILMN_166491O RPSA NM_001012321.1 O.007938497 O.537155609 ILMN_2407605 GIYD2 NM_024044.2 O.007944606 O.531217635 ILMN_2152095 RNASEN NM_013235.3 O.007987447 O.458218869 ILMN_1678464 DCLRE1C NM_001033858.1 O.007991392 O.619351961 ILMN_1730529 CAB39L NM_001079670.1 O.008004106 O.465761281 ILMN_1809285 DCP1A NM_018403.4 O.008063544 O.499569903 ILMN_1699440 ZBTB47 NM_145166.2 O.008069873 1.300721326 ILMN_1774083 TRIAP1 NM_016399.2 O.008084101 O.452093496 ILMN_1796523 FNIP1 NM_133372.2 0.008101041 1.251935595 ILMN_1742379 IFT122 NM_052989.1 0.008107069 O.585299967 ILMN_1798581 MCM8 NM_032485.4 O.008124758 O.39895875 ILMN_2045994 SEPW1 NM_003009.2 O.008180544 2.170610772 ILMN_2111237 MN1 NM_002430.2 O.008181064 1.480543494 ILMN_1727558 MRPL27 NM_148571.1 O.008216167 O.49290801 ILMN_1713613 PIAS2 NM_173206.2 O.008218756 O.533318798 ILMN_2207720 ITM2B NM_021999.3 O.008268371 0.409229979 ILMN_1778059 CASP4 NM_033306.2 0.008299631 O.352535107 ILMN_2151281 GABARAPL1 NM_031412.2 0.00830592 1.40344079 ILMN_2227368 SELT NM_016275.3 O.008323563 0.629151938 ILMN_1755222 C9orf82 NM_024828.2 0.008376736 0.537845874 ILMN_1670272 LRP10 NM_014045.3 O.008387951 0.488461901 ILMN_1750044 ZNHIT3 NM_004773.2 O.008414785 0.596203697 ILMN_1801899 PLEC1 NM_201380.2 O.008415501 O.788422978 ILMN_1667707 SPCS3 NM_021928.1 O.008416213 0.333306413 ILMN_1784459 MMP3 NM_002422.3 O.008424899 0.743845984 ILMN_1715613 TAOK2 NM_004783.2 O.008428815 O.577192898 ILMN_1783170 ING3 NM_198267.1 O.008464107 O.45594537 ILMN_2343332 TAF9 NM_001015891.1 O.008467944 O.502769469 ILMN_1746426 TOMM70A NM_014820.3 O.008511501 0.451400009

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1708164 EIF3A NM_003750.2 0.0085147 0.273046283 ILMN_2319919 MAGEA2 NM_175743.1 0.008522299 0.564708047 ILMN_1788166 TTK NM_003318.3 0.008532079 0.6260955 ILMN_1694731 CLCN7 NM_001287.3 0.008552366 0.047428986 ILMN_2189037 WDR52 NM_018338.2 0.008579091 0.442426039 ILMN_1654411 CCL18 NM_002988.2 0.008582303 0.534771494 ILMN_1666372 ATP5H NM_006356.2 0.00858678 0.339181294 ILMN_1663220 MRPL22 NM_014180.2 0.008657699 0.682213605 ILMN_1736689 PC NM_001040716.1 0.008686562 0.491364567 ILMN_1702609 B3GNT5 NM_032047.4 0.008699695 0.35924426 ILMN_2126399 psiTPTE22 EF535614.1 0.008701089 0.508410979 ILMN_1714438 MUTYH NM_001048172.1 0.008708257 1.452044111 ILMN_1697117 TBP NM_003194.3 0.008717257 1.375754246 ILMN_2160476 CCL22 NM_002990.3 0.00873155 0.626816124 ILMN_2405156 PPAP2C NM_177543.1 0.008744942 0.486658323 ILMN_2357976 BAT1 NM_004640.5 0.008748889 0.39869983 ILMN_1686804 CCRK NM_012119.3 0.008781738 1.379683611 ILMN_1735908 UTP15 NM_032175.2 0.008795849 0.455716604 ILMN_1739496 PRRX1 NM_006902.3 0.008810631 1.352203092 ILMN_2215631 OTUD6B NM_016023.2 0.008824788 0.318170009 ILMN_1676449 SLIT2 NM_004787.1 0.008825626 1.443309256 ILMN_1717982 BZW1 NM_014670.2 0.008843056 0.496720206 ILMN_2089902 NUS1 NM_138459.3 0.008924061 0.426437437 ILMN2172269 TMEM183B NM_001079809.1 0.008947562 0.531376285 ILMN_1750144 C3orf19 NM_016474.4 0.008998487 1.224881041 ILMN_1686043 FAM164C NM_024643.2 0.009007654 0.524954198 ILMN_2342793 FBXW8 NM_153348.2 0.009010131 0.526747165 ILMN_1684554 COL16A1 NM_001856.3 0.009207494 2.157593197 ILMN_2198878 INPP4B NM_003866.1 0.009224731 1.355483357 ILMN_2183610 SERAC1 NM_032861.2 0.009237213 0.652929929 ILMN_1735827 NISCH NM_007184.3 0.009267976 3.244972339 ILMN_2408815 NAP1L1 NM_139207.1 0.009273677 0.466078202 ILMN_1736154 ProSAPiP1 NM_014731.2 0.009297408 1.371836507 ILMN_1660043 UBXN11 NM_145345.2 0.009301234 0.414923686 ILMN_1723087 MDK NM_002391.3 0.009357376 0.477925138 ILMN_2405190 VAPA NM_003574.5 0.009380725 0.642869229 ILMN_2365549 BRPF1 NM_004634.2 0.009418423 0.030900528 ILMN_1688637 TMEM198 NM_001005209.1 0.009454295 0.53441861 ILMN_2381753 G3BP2 NM_012297.3 0.009454643 0.528560031 ILMN_2119945 NDUFB3 NM_002491.1 0.009512793 0.605900377 ILMN_2395913 ARHGAP11A NM_199357.1 0.009513189 0.52537859 ILMN_1799105 COL17A1 NM_000494.3 0.009521418 0.569237452 ILMN_1786707 C19orf63 NM_175063.4 0.009549933 0.705859833

引物编号 符号 登录号 P值 风险 ILMN_1695962 SLC12A9 NM_020246.2 0.00955532 0.632986434 ILMN_2213247 SPCS2 NM_014752.1 0.009568632 0.468103464 ILMN1722016 LY6G5C NM_001002849.1 0.009572932 1.337326232 ILMN_1809141 ING4 NM_198287.1 0.009584963 0.47920737 ILMN_1682332 GYPC NM_016815.2 0.009633083 1.887056171 ILMN_1761363 VAMP4 NM_003762.3 0.009646552 0.476950334 ILMN_1785179 UBE2G2 NM_003343.4 0.009701867 0.617105146 ILMN_1763000 ADAP2 NM_018404.2 0.009748952 1.681799633 ILMN_1716224 STARD4 NM_139164.1 0.009783456 0.489406267 ILMN_1739587 UTY NM_007125.3 0.009816309 0.439298478 ILMN_1680643 KIAA1333 NM_017769.2 0.009820691 0.460192694 ILMN_2407879 SORBS2 NM_003603.4 0.009831185 1.548113873 ILMN_2275533 DIAPH3 NM_030932.3 0.009833778 0.686553443 ILMN_1773645 GMPPB NM_021971.1 0.009837559 0.446130182 ILMN_1764091 R3HDM2 NM_014925.2 0.009843159 0.685043284 ILMN_2400500 LASS2 NM_181746.2 0.009847868 0.442253821 ILMN_2334350 BTBD3 NM_014962.2 0.00985416 0.459870001 ILMN_1660602 C1orf43 NM_015449.2 0.009874084 0.617987793 ILMN_2170353 PTPLB NM_198402.2 0.009918567 0.400585431 ILMN_1794492 HOXC6 NM_153693.3 0.00992158 0.721974031 ILMN_2364357 RPS6KB2 NM_003952.2 0.009937711 0.244179599 ILMN_2147503 ALG13 NM_018466.3 0.009946793 0.352771071 ILMN_2177460 AQR NM_014691.2 0.009953961 0.404663806 ILMN_1668525 NR3C1 NM_001018076.1 0.009992789 0.617215381 ILMN_2258543 PRDM2 NM_012231.3 0.009994008 1.364891701

实施例6：鉴定用于自我归一化(self-normalization)的参比基因(reference genes)

减少临床领域中发现的预后基因数目的方式之一是在每种情况下自我归一化，因为不 可能一次用整组患者作为对象进行归一化。目前，实时QRT-PCR(实时定量逆转录聚合 酶链反应)广泛地用来测量基因的表达水平，但是当使用QTR-PCR时，不能测量人类中 的全部基因以便进行分位数归一化，并且当使用旧石蜡块而非使用新样品时存在生成的实 时QRT-PCR信号显著较低的问题。

因此，为了在临床领域可靠使用鉴定的胃癌预后基因，本发明人尽力鉴定参比基因用 于测量的基因表达水平的自我归一化。因此，通过分析实施例3中用WG-DASL测量的 基因表达水平数据，鉴定了不具有预后特征并且在每种不同情况下均显示最小变化的50 种参比基因，并且表4中显示了该结果。表4中列出的50种参比基因中一个或多种基因 的组合可以用于胃癌预后基因的表达水平的归一化。

表4

探针编号 登录号 符号 ILMN_2403446 NM_007011.5 ABHD2 ILMN_1708502 NM_014423.3 AFF4 ILMN_1780806 NM_025190.3 ANKRD36B ILMN_2415467 NM_080550.2 AP1GBP1 ILMN_1722066 NM_018120.3 ARMC1 ILMN_2352934 NM_004318.2 ASPH ILMN_1808163 NM_022338.2 C11orf24 ILMN_1693431 NM_153218.1 C13orf31 ILMN_1733288 NM_016546.1 C1RL ILMN_2202940 NM_020244.2 CHPT1 ILMN_2188533 NT_007592.15 CICK0721Q.1 ILMN_1795754 NM_001289.4 CLIC2 ILMN_2373779 NM_198189.2 COPS8 ILMN_1796180 NM_021117.2 CRY2 ILMN_1651499 NM_020462.1 ERGIC1 ILMN_1751425 NM_024896.2 ERMP1 ILMN_1712095 NM_005938.2 FOXO4 ILMN_1747305 NM_175571.2 GIMAP8 ILMN_1737308 NM_002064.1 GLRX ILMN_2168215 NM_016153.1 HSFX1 ILMN_1789018 NM_012218.2 ILF3 ILMN_1809141 NM_016162.2 ING4 ILMN_1807767 NM_014615.1 KIAA0182 ILMN_1776963 NM_006816.1 LMAN2 ILMN_1743583 NM_130473.1 MADD

探针编号 登录号 符号 ILMN_1774844 NM_032960.2 MAPKAPK2 ILMN_1761858 NM_033290.2 MID1 ILMN_1670801 NM_000254.1 MTR ILMN_1780937 NM_025128.3 MUS81 ILMN_1784113 NM_020378.2 NAT14 ILMN_2147133 NM_173638.2 NBPF15 ILMN_2361185 NM_024878.1 PHF20L1 ILMN_1704529 NM_021130.3 PPIA ILMN_2357577 NM_006251.5 PRKAA1 ILMN_2353202 NM_152882.2 PTK7 ILMN_1813753 NM_002825.5 PTN ILMN_1677843 NM_001031677.2 RAB24 ILMN_1773561 NM_021183.3 RAP2C ILMN_1749006 NM_052862.2 RCSD1 ILMN_2373266 NM_139168.2 SFRS12 ILMN_2117716 NM_005088.2 SFRS17A ILMN_2379835 NM_003352.4 SUMO1 ILMN_1712075 NM_015286.5 SYNM ILMN_1674866 NM_006354.2 TADA3L ILMN_2390227 NM_015043.3 TBC1D9B ILMN_1657983 NM_018975.2 TERF2IP ILMN_1705213 NM_022152.4 TMBIM1 ILMN_1756696 NM_207291.1 USF2 ILMN_2054442 NM_001099639.1 ZNF146 ILMN_2352590 NM_006974.2 ZNF33A

随后，为了证实采用参比基因进行的自我归一化的有效性，研究了针对WG-DASL 数据的分位数归一化和自我归一化数据之间的相关性。图1中显示了基于两种归一化方法 的风险比(hazard ratio)。作为结果，确定了分位数归一化和自我归一化方法之间的密切 相关性(图1)。

实施例7：开发和评价基于胃癌预后基因的预后预测模型-(1)

7-1：使用监督主成分分析的预后预测模型

为了建立预后预测模型，使用由Bair和Tibshirani开发的改进的主成分分析法(rvised  Principal Component analysis，SuperPC)(PLoS Biol.2004Apr；2(4)：E108.Epub2004Apr 13)。为了开发和评价基于SuperPC分析的胃癌预后预测模型，使用Richard Simon开发 的BRB矩阵工具(SimonR等人，Cancer Inform2007；3：11-7)程序。

在SuperPC分析中，可以确定用于以所需水平预测预后的p-值阈值，并且在BRB矩 阵工具程序中，默认p-值是0.001。临界P值可以在任何区域中小于0.01，并且通过预定 义的p-值和计算有效成分，SuperPC分析可以包括表2和表3中列出的预后基因的子集。 为了以被认可的有效性建立预后预测模型，将10倍交叉验证法和SuperPC分析与BRB 矩阵工具组合。作为SuperPC分析的例子，为了建立预后预测模型，使用0.00001的临界 p-值和两种有效成分，并且SuperPC预后预测模型由7个预后基因组成，并且在图16中 显示这种预测模型(表5和图16)。此外，在图2至图5中显示了代表根据7个所选择的 预后基因的表达水平的存活率的Kaplan-Meier曲线。

表5

  基因编号 基因符号 权重(wi) 1 ILMN_1713561 C20orf103 0.152677 2 ILMN_1672776 COL10A1 0.038261 3 ILMN_1663171 MATN3 0.016428 4 ILMN_1732158 FMO2 0.08681 5 ILMN_1811790 FOXS1 0.068965 6 ILMN_2402392 COL8A1 0.060799 7 ILMN_1736078 THBS4 0.088377

图2至图5确定，根据表5中列出的7种基因中每一种的表达水平，将患者队列划分 成积极预后组或消极预后组，并且与消极预后组的存活率相比，积极预后组的存活率显得 高。这些结果在临床上代表，可以通过测量本发明中胃癌预后基因的表达水平精确地预测 胃癌患者的预后。

此外，根据图16，建立表5中列出的7种基因的预后预测模型并且将患者根据所述 模型进行划分的结果显示，与消极预后组（高风险）的存活率相比，划分至积极预后组（低 风险）中的组的存活率显著更高，这与实际临床结果对应（图16）。这些结果显示，表5 中列出的7种预后基因可以用于预测胃癌预后。

另外，将已经根据该预后预测模型划分的患者中的Ib/II期胃癌患者再划分成积极预 后组或消极预后组，并且图17中显示了代表所划分组的无疾病存活率的Kaplan-Meier曲 线。作为结果，与划分入消极预后组的Ib/II期胃癌患者的存活率相比，根据SuperPC预 后预测模型划分入积极预后组的Ib/II期胃癌患者的存活率显著更高（图17）。

具体而言，在SuperPC预后预测模型（使用表5中7种基因的表达水平）中，可以 通过下式计算预后指数。如果通过下式计算的确定预后指数大于-0.077491，则从中采集 样品的患者可以划入消极预后组中。

∑Iwi xi-4.51425

[wi和xi分别代表基因的第i位权重（weight）和对数表达水平]

7-2：采用常规预后系数的对比评价

本发明人使用多变量Cox分析作为标准统计分析以确定基于本发明中预后基因的预 后预测是否比常规预后系数提供更有意义的预后信息。具体而言，研究了多变量Cox模 型，所述模型显示由SuperPC预后指数（表5）和10倍交叉验证法评价的无疾病存活率、 肿瘤细胞侵入深度（pT期(pTstage)）、由肿瘤细胞转移的淋巴结的数目（P Node）。

多变量分析结果确定，与pT期和P Node无关的7种预后基因是接受治疗型胃切除 术和辅助化疗的胃癌患者的无疾病存活率的优异预测物（HR=1.9232，95%CI，1.4066， 2.6294，P<0.0001，表6）。

表6

协变量 b SE P 期望(b) 期望(b)的95％置信区间 HER2＝阳性 -0.3020 0.2510 0.2289 0.7393 0.4531to1.2062 PNODE 0.5548 0.08754 ＜0.0001 1.7415 1.4683to2.0657 Tstage 0.7339 0.1696 ＜0.0001 2.0831 1.4965to2.8997 预测的风险＝“高” 0.6540 0.1604 ＜0.0001 1.9232 1.4066to2.6294

实施例8：开发和评价基于胃癌预后基因的预后预测模型-(2)

8-1：使用梯度套索方法的预后预测模型

使用梯度套索算法(Sohn I等人：Bioinformatics2009；25：1775-81)筛选在实施例5中 鉴定的369种胃癌预后基因中可以用于预测胃癌预后的基因。在梯度套索预后模型中，可 以使用下式计算预后评分，并且如果随机样品的预后评分为正，可以预测为积极(positive) 预后。

是从训练集估计的回归系数(regression coefficient)，X是训练集的基因表达水平的 向量。]

在使用梯度套索选择基因后，必需使用独立数据集(data set)验证易感性。为此目 的，使用留一交叉验证法(leave one out cross validation，LOOCV)。具体而言，留一交叉 验证法将在通过梯度套索产生预后预测算法时使用N-1份样品(训练数据)，不包括来自 患者组的一份样品(测试数据)，并且用来通过将相同样品应用于预后算法将剩余一份样 品划入积极预后组或消极预后组。这种过程反复对患者组的N份样品进行。在完成将全 部样品划分入积极预后组或消极预后组后，通过统计分析比较积极预后组和消极预后组之 间的存活率。

在进行留一交叉验证法期间通过梯度套索算法筛选出26种预后基因并且表7中列出 了筛选的基因。此外，在图5至图15中显示了代表根据26种筛选的预后基因的表达水平 的存活率的Kaplan-Meier曲线。根据图5至图15，确定了根据表7中列出的26种基因中 每一种的表达水平将患者组划分成积极预后组或消极预后组，并且与消极预后组的存活率 相比，积极预后组的存活率显得更高。这些结果临床上代表，可以通过测量本发明中胃癌 预后基因的表达水平来精确地预测胃癌患者的预后。

表7

随后，使用26种选择的基因（梯度套索和留一交叉验证法）、根据这种预后预测模型， 将患者组划分成积极预后组或消极预后组。另外，根据病理学分期，将已经划分成积极预 后组或消极预后组的患者组再划分，从而可能根据病理学分期预测预后。

8-2：评价使用梯度套索方法的预后预测模型

为了确定是否使用26种预后基因预测的预后是否与实际临床结果重合，在 Kaplan-Meier曲线中显示划分成积极预后组和消极预后组的组的无疾病存活率（图18）。 作为结果，与消极预后组（高风险）的5年无疾病存活率相比，积极预后组（低风险）的 5年无疾病存活率显著更高（71.7%对47.7%），并且该结果似乎对应于复发率2.12的风险 比（95%CI，1.57，2.88，P=0.04，图18）。因此，确定使用26种预后基因进行分类的 胃癌患者的预后与实际临床结果重合。

为了确定通过以下方式预测的预后结果是否与实际临床结果重合，所述方式为将已经 根据病理学分期划分成积极预后组和消极预后组的患者再划分以便可以根据病理学分期 预测预后，在图19中显示了Kaplan-Meier曲线，所述曲线代表根据预后划分的处于每种 病理学分期的患者组的无疾病存活率。作为结果，由总计432位患者组成的队列划分成 145位患者处于低风险Ib/II期（low-risk，stage Ib/II）（5年无疾病存活率为84.8%）；90 位患者处于高风险Ib/II期（high-risk，stage Ib/II）（5年无疾病存活率为61.1%）；83位患 者处于低风险III/IV期（low-risk，stage III/IV）（5年无疾病存活率为48.9%），和114位 患者处于高风险III/IV期（high-risk，stage III/IV）（5年无疾病存活率36.9%）。具体而言， 确定在Ib/II期中，与消极预后组（高风险Ib/II）的存活率相比，积极预后组（低风险Ib/II） 的存活率显著地更高，并且甚至在III/IV期，与消极预后组（高风险III/IV）的存活率相 比，积极预后组（低风险III/IV）的存活率显著地更高（图19）。

结果表明，可以通过采用统计分析算法处理预后基因的表达水平、根据所述预后精确 地将处于病理学分期的患者分类，并且可以根据预测的预后，通过选择适宜的治疗改善胃 癌患者的存活率。例如，从诊断为Ib/II期的患者测量预后基因的表达水平，通过测量相 对于参比基因的相对表达水平自我归一化，并且，随后如果根据梯度套索算法划分入消极 预后组Ib/II期，则可以确定患者的预后与III期的预后相似，并且可以通过使用针对III 期患者的治疗方法延长患者的存活。

8-3：采用常规预后系数的对比评价

预测胃癌预后的已知预后因素为确定肿瘤细胞侵入深度（pT期）和由肿瘤细胞转移 的淋巴结的数目（P Node）。本发明人使用多变量Cox分析作为标准统计分析来确定基于 本发明中预后基因的预后预测是否比常规预后系数提供更有意义的预后信息。具体而言， 研究了多变量Cox模型，所述模型显示由梯度套索指数（7表中列出的26种预后基因） 和留一交叉验证法评价的无疾病存活率、肿瘤细胞侵入深度（pT期）、由肿瘤细胞转移的 淋巴结的数目（P Node）或病理学分期（AJCC第6版）。在这种情况下，pT期被分为pT1/T2 和T3，并且通过用0.1替换0求得P Node的对数。

多变量分析结果确定，与pT期和P Node无关的26种预后基因是接受治疗性胃切除 术和辅助化疗的胃癌患者的无疾病存活率的优异预测物（HR=1.859，95%CI，1.367，2.530， P=0.000078，表8）。同样地，如表9中所示，确定可以利用26种预后基因独立地预测 处于最末病理学分期的无疾病存活率（HR=1.773，95%CI，1.303，2.413，P<0.00001， 表9中的Pstage是pTstage和PNode的组合）。

表8

表9

实施例9：开发和评价基于胃癌预后基因的预后预测模型-（3）

9-1：使用nCounter测定法开发和评价用于II期胃癌患者的胃癌预后评分

通过将梯度套索算法应用于从WG-DASL测定法内所用的队列中获得的II期胃癌患 者(N＝186)的肿瘤样品，鉴定到提供稳健(robust)预后信息的8种胃癌预后基因的组 合(表10)。利用8种基因的归一化表达水平和Cox回归估计值的线性组合(linear  combination)开发了胃癌预后评分(Gastric Cancer Prognostic Score，GCPS)。使用nCounter 分析试剂盒(系统；NanoString Technologies)进行基因表达水平的测量。

表10

基因符号 回归估计值 C20orf103 0.0636 CDC25B -0.0175 CDK1 -0.1005 CLIP4 0.4822 LTB4R2 -03950 MATN3 0.2982 NOX4 0.0288 TFDP1 -0.2886

通过分析临界值(cut-off)，确定将25％患者分配入消极预后组的GCPS为最稳健 (robust)的(图28)。选择该临界值用于将来的独立验证队列中的验证。作为应用优化 的临界值至该队列的结果，如图29中所示，与低风险组84.3％的5年无疾病存活率(顶 部图)相比，基于该预测模型，通过基因表达水平确定高风险组的5年无疾病存活(底部 图)为42.6％(p＜0.0001)。

由于过度拟合问题，必需用修订算法和临界值，用未用于鉴定基因的独立患者队列作 为对象验证GCPS。为此目的，首先获得用于验证的患者队列。将GPS应用于2期胃癌 患者的独立验证队列，所述2期胃癌患者接受与用于鉴定患者胃癌预后基因的患者 (n＝186，发现队列)相同的化疗-放疗。作为结果，风险评分分布与图30十分相似，所 述图30代表这种测定法(assay)的稳健分析性能。

应用从发现队列获得的预定义的GCPS临界值(0.2205)至验证队列并且基于等级分 布产生Kaplan-Meier曲线的结果确定，这种算法可以精确鉴定接受化放疗的2期胃癌患 者中患胃癌风险较高的患者(图31)。如图31中所示，这8种预后基因的GPS成功预测 出高风险组(5年DFS，58.7％，底部图)和低风险组(5年DFS，86.3％，顶部图)中 216位患有2期胃癌的患者(P＝.00004，HR＝3.15)。

9-2：GCPS的优化

根据该实施例，在验证可以通过胃癌预后基因的表达概况鉴定接受化放疗的2期患者 中的高风险患者后，将发现队列和验证队列合并为一个队列以开发第二代GCPS。为了基 于无疾病存活率的Cox比例风险模型开发预测模型，使用梯度套索(最小绝对收缩和选 择算子)算法。表11代表使用2期数据集(phase2data set，N＝402)时所获得的构成预 测模型的13种基因(探针)，其中所述2期数据集是发现集合和验证集合的组合。

表11

基因符号 回归估计值 ADRA2C -0.0156 C20orf103 0.1082 CLIP4 0.3891 CSK -0.6654 FZD9 -0.0829 GALR1 -0.0509 GRM6 -0.0244 INSR 0.0251 LPHN1 -0.0126 LYN -0.0012 MATN3 0.2134 MRGPRX3 -0.0009 NOX4 0.0951

将患者的GCPS计算为[S=β₁x₁+...+β_nx_n]。其中，x_n是第n位基因的定量表达值， β_n是表10和表11中列出的第n位基因的回归估计值（Regression estimate），并且S代表 胃癌预后评分。随后，从2期数据集估计风险评分分布的第一个四分位数和第三个四分位 数的临界值（Q1=-0.9842，Q3=-0.4478）。通过应用该临界值至最终验证集合的306位患 者中，分别将GCPS低于Q1的患者和GCPS大于Q3的患者分配至低风险组和高风险组 中。作为结果，如图24中所显示，Kaplan-Meier曲线确定，与其他组的患者相比，被预 测为高风险组的患者的存活率（底部图）显著地较低（图32）。

9-3：在仅接受手术的II期胃癌患者中验证第二代GCPS

为了测试GCPS对仅接受手术而未接受化疗或放射疗的患者的性能，检查了306位诊 断患有2期胃癌的患者的癌组织，其中所述患者在三星医学中心仅接受根治性胃切除术而 不接受辅助化疗（adjuvant chemotherapy）或手术后放射疗法。根据以下标准选择患者。

在诊断患有2期病理学分期的476位胃癌患者中（这些患者从1995年4月至2006 年9月在三星医学中心仅接受根治性胃切除术（curative gastrectomy）而不接受辅助化疗 或手术后放射疗法），根据以下标准选择306位患者。

1）腺瘤组织学诊断，

2）切除肿瘤，无残余肿瘤，

3）D2淋巴结清扫术，

4）年满18岁，

5）根据AJCC（美国癌症联合委员会）第6版，病理学分期II（T1N2、T2aN1、T2bN1 和T3N0），

6）完整保留手术记录和治疗记录。

在476位患者的队列中170位患者被从本分析中排除，归因于如下原因：

1）无完整医疗记录的患者（N=66），

2）无疾病死亡或无法解释的死亡（N=43），

3）纠正的病理学分期（N=45）

4）石蜡块不可获得（N=15），

5）双重原发性癌症（N=1）。

如图33中所示，作为应用第二代GCPS至仅接受手术的2期胃癌患者队列的结果， 虽然使用接受化放疗的患者队列开发了GCPS，但是与低风险组相比，根据GCPS划入高 风险组的患者（底部图）经鉴定具有不良预后（p=0.00287）。这个结果表明，由GCPS定 义的高风险患者基本上具有未被抗癌药物和放射疗法改善的不良预后，并且需要为这些患 者开发新疗法。