定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

摘要

本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。

背景技术

自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特 性后，Smith and Summer[Smith GE,MD Summers and MJ Fraser.Production of human beta  interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.Mol Cell Biol. 1983;3(12):2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统（Baculovirus Expression Vector System， BEVS）。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母 哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值：（1）作为超高效 的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白；（2）作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治 效率；（3）研究杆状病毒基因组的结构和功能；（4）研究真核基因的表达调控机制。杆状病 毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国, 王厚伟,牟志美,石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版). 2003,34(1):134-138]。

检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方 法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织 细胞感染量（TCID₅₀）来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[Dulbecco R.- Production of plaques in monolayer tissues by using single particles of animal virus.Proc Nat Acad  Sci1952;38(8):747-752]，Hink和Vial后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是 将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离 病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后， 这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病 毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。

对于野生型的昆虫杆状病毒而言，由于其可在感染细胞内形成肉眼可见的包涵体并在 短期内将周围细胞崩解形成明显的空斑，用终点稀释法和空斑法均可以确定其滴度。但是对 于重组昆虫病毒而言，由于其缺失了多角体蛋白基因，它不会像野生型的杆状病毒一样在感 染细胞内形成肉眼可见的包涵体，因此不能用终点稀释法而只能用空斑法测定重组杆状病毒 的滴度。

检测重组昆虫病毒的最常用的方法是空斑法，但是由于空斑法操作繁琐，耗时较长（由 于其缺失了多角体蛋白基因，其使受感染细胞发生崩解所需的时间也大大延长），且技术较难 掌握、误差较大。国外目前有两种检测重组昆虫病毒的方法：一种是通过免疫学方法检测重 组杆状病毒感染的细胞表面标志蛋白gp64的表达来确定重组杆状病毒滴度[Dee,K.U,Shuler, M.L.Optimization of an assay for baculovirus titer and design of regimens for synchronous  infection of insect cells.Biotechnol.Prog.1997;13(1):14-24]。该方法简便快速（48h内完成）， 但价格昂贵；一种是直接将水母绿色荧光蛋白（Green Flurescent Protein,GFP）作为报告基因 构建重组杆状病毒，使重组杆状病毒筛选和滴度测定都变得极为简单[Takehiko Saito a,Takashi  Dojima b,Masaru Toriyama a,Enoch Y.Park The effect of cell cycle on GFPuv gene expression  in the baculovirus expression system.Journal of Biotechnology.2002;93(2):121-129]。但该方法 涉及到从上游的构建工作做起，工作量巨大。目前尚没有简便、快速地定量测定重组昆虫病 毒滴度的方法。

因此，本领域中需要一种低成本、简便、快速的方法来定量测定重组昆虫病毒滴度， 以利于昆虫杆状表达系统的广泛研究及应用。

发明内容

本发明涉及一种定量、简便和快速的方法，用于检测重组杆状病毒的滴度，具体地说， 该方法通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量来定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。

因此，本发明的目的是提供定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组 昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的 数量来定量来实现。酸性磷酸酶法测定原理是活细胞内的酸性磷酸酶可以准确反映细胞数。 在一定条件下，用去垢剂使细胞膜破裂释放出酸性磷酸酶，再与底物pNPP(对硝基苯磷酸酯) 作用一段时间后，即可将其催化生成黄色的对硝基酚。这一呈色反映可以用酶标仪检测，所 测的吸光度即可代表酸性磷酸酶活性，也间接反映了活细胞数。

本发明提供了一种通过酸性磷酸酶法定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。包括下 列步骤：

（a）将对数生长期的昆虫细胞重悬，用培养基进行适当稀释后接种昆虫细胞于96孔细 胞培养板；

（b）将病毒滴度标准品与待检病毒液进行系列稀释，接种于昆虫细胞进行感染；

（c）加入底物液，显色一定时间后，酶标仪检测光吸收值；

（d）根据各系列稀释度病毒滴度标准品的光吸收值绘制标准曲线；

（e）采用标准曲线法，计算待检病毒液的滴度。

本发明的实施方案中，其中所述的重组昆虫杆状病毒是指缺失了多角体蛋白基因的昆 虫杆状病毒。

本发明的实施方案中，所述的昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞，包括但不限于Sf9细胞、 Sf21细胞、Hi5细胞，最优选Sf9细胞。使用前应调整细胞生长状态及生长周期，选择生长 状态良好、处于对数生长期的细胞用于实验。

本发明的实施方案中，Sf9细胞接种数量为2×10³～3×10³个细胞/孔，优选3×10³个 细胞/孔。

本发明的实施方案中，所述的感染为，15～25℃条件下感染1～2h，优选在25℃条件下 感染2h。

本发明的实施方案中，所述的培养基为TC-100或Sf-900Ⅱ培养基，优选TC-100培养 基。TC-100培养基中可含有1～20%（V/V）胎牛血清，优选含有10%（V/V）胎牛血清。

本发明的实施方案中，所述病毒滴度标准品稀释后浓度范围是1.9×10⁴～3.0×10⁵pfu/mL。

本发明的实施方案中，所述显色条件为在37℃条件下作用1h。

本发明的实施方案中，是在405nm下测定光吸收度值。

本发明克服了现有技术中的缺点，以滴度对数值和吸光度为坐标轴作图绘制标准曲 线，通过计算确定重组昆虫杆状病毒滴度。具体方法为：以标准品的滴度对数值为横坐标， 以对应的405nm的吸光度值为纵坐标，根据实验数据绘制标准曲线，求直线回归方程。将测 得待检样品的吸光度代入直线回归方程，将计算结果乘以稀释倍数即为滴度。将所有位于标 准曲线范围内的待检样品的吸光度值分别计算滴度，相加后取平均数，即为该待检样品的滴 度。

该方法排除了空斑法通过肉眼打点计数空斑易导致主观误差的缺点，获得的结果更加 可观、准确。此方法通过检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。灵敏度高， 准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。

附图说明

图1为根据实施例3所述的检测结果绘制的标准曲线。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于 解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中 所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没 有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1：细胞接种

（1）材料Sf9细胞，购自中国典型物菌种保藏中心；TC-100培养基和胎牛血清，购 自GIBCO公司；96孔板，购自NUNC公司。

（2）操作方法

取对数生长期的Sf9贴壁生长细胞，轻柔吹打，使细胞重悬。1,000g（水平转头）离 心8min。弃上清，将细胞用含10%（V/V）胎牛血清的TC-100培养基重悬，制成细胞悬液。 取样，台盼蓝染色计数。

用含10%（V/V）胎牛血清的TC-100培养基将细胞稀释至3×10⁴个/mL，加入到96 孔细胞培养板中，每孔100微升。27℃静置2h。

实施例2：重组杆状病毒滴度标准品及待检样品的稀释

（1）材料TC-100培养基和胎牛血清，购自GIBCO公司；微量移液器，购自 EPPENDORF公司；EP管、枪头，购自AXYGEN公司。

（2）操作方法

用TC-100培养基稀释重组杆状病毒滴度标准品，最高浓度为320倍稀释，以下使用 640倍稀释、1280倍稀释等2倍梯度稀释，共8个稀释度；用TC-100培养基稀释待检样品， 最高浓度为20倍稀释，以下使用80倍稀释、320倍稀释等4倍梯度稀释，共5个稀释度。

实施例3：定量测定重组昆虫杆状病毒滴度

（1）材料胎牛血清，购自GIBCO公司；pNPP，购自Amersco公司；Triton X-100、 乙酸钠、NaOH购自国药；EDTA，购自沪试。

（2）操作方法

将96孔细胞培养板中培养液吸去，每孔依次加入系列稀释的病毒液50μL，室温孵育 2h，让病毒吸附。往各孔中加入含20%（V/V）胎牛血清的TC-100培养基50μL，放27℃培 养72h。吸尽各孔中培养液，依次加入pNPP溶液（1mg/mL pNPP，0.06mol/L乙酸钠，0.001mol/L EDTA，0.2%Triton X-100，pH6.0）100μL，37℃放置1h。每孔各加入1mol/L NaOH10μL， 混合均匀，室温放置5～20min。在BIO-TEK酶标仪405nm处读取吸光度值，如表1、表2所 示。根据获得的数据作如图1所示标准曲线。以标准曲线的滴度对数值对应其吸光度，求直 线回归方程。将测得待检样品的吸光度代入直线回归方程，将计算结果乘以稀释倍数即得待 检样品的滴度。将所有位于标准曲线范围内的待检样品的吸光度分别计算滴度，相加后取平 均数，测得该待检样品的滴度为3.1×10⁷pfu/mL。与空斑法检测该待检样品的滴度比较，结 果完全吻合。

表1：标准品（已知滴度的病毒）

稀释倍数 320 640 1280 2560 5120 10240 20480 40960 滴度的对数 5.477 5.176 4.875 4.574 4.273 3.972 3.671 3.370 A405 1.369 1.686 1.937 2.352 2.651 OUT^※OUT OUT

※：检测结果为3.0以上，超出读数范围。

表2：待检病毒及对照

#：用TC-100代替重组杆状病毒进行感染。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下 在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。