瘿蜂防治剂

摘要

本发明涉及昆虫物种中RNA介导的基因沉默领域。本发明部分地基于本发明人对来自桉树入侵物种瘿蜂害虫桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybe invasa)(Li)和桉干瘿姬小蜂(Ophelimus maskelli)(Om)的基因的测序。在某些方面，本发明提供Li和Om的核酸、其衍生物以及此类核酸和衍生物作为瘿蜂防治剂的用途。

说明书

序列表

本申请包含以ASCII格式经EFS-Web提交的序列表，在此将其全部内容 引入以作参考。将2012年3月30日制作的所述ASCII副本命名为 34702WO1.txt，其大小为312,664字节。

相关申请的交叉参考

本申请要求2011年3月30日提交的美国临时申请61/469,469和2012年1月 30日提交的美国临时申请61/592,175的优先权。将前述临时申请各自的全部 内容引入于此以作参考。

技术领域

本发明涉及昆虫物种中双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默领域。

背景技术

在南北半球均发生了桉树的瘿蜂(gall wasp)侵扰，并且对中国、澳大利 亚、以色列和巴西的商业桉树种植造成威胁。防治桉树感染瘿蜂的努力包括 尝试分离天然抗性植物和天然捕食者。这些努力已遇到了限制或并未成功。 瘿蜂产生的瘿瘤(gall)的保护性环境使化学杀虫剂防治瘿蜂产生困难。

即使可行，化学杀虫剂防治也具有劣势。化学杀虫剂可能不利于环境， 不是选择性的，且可能对非目标作物和动物群有害。化学杀虫剂存留于环境 中并通常代谢缓慢，或根本不代谢。化学杀虫剂在食物链中，特别是在较高 的捕食者物种内积累，它们可在较高的捕食者物种中充当诱变剂和/或致癌物 以引起不可逆且有害的遗传修饰。此外，由于重复使用相同的杀虫剂或具有 相同作用模式的杀虫剂可使作物害虫发展出对化学杀虫剂的抗性。

RNA干扰或“RNAi”为由与要下调的靶基因区序列互补的双链 RNA(dsRNA)引发的序列特异性下调基因表达的过程(还称作“基因沉默”或 “RNA介导的基因沉默”)。多细胞生物中借助RNA干扰(RNAi)的靶基因下 调已成为行之有效的技术。美国专利申请公布US 2009/0285784 A1和US 2009/0298787涉及dsRNA作为昆虫防治剂，并在此将其各自的全部内容引入 于此以作参考。美国专利6,506,559号、美国专利申请公布2003/00150017 A1、 国际公布WO 00/01846、WO 01/37654、WO 2005/019408、WO 2005/049841、 WO 05/047300涉及RNAi保护植物抵抗昆虫的用途。在此将前述专利和公布 的申请的全部内容分别引入于此以作参考。

发明内容

本发明部分地基于本发明人对来自桉树入侵物种瘿蜂害虫，桉树枝瘿姬 小蜂(Leptocybe invasa)(Li)和桉干瘿姬小蜂(Ophelimus maskelli)(Om)的基因 的测序。在某些方面，本发明由此提供Li和Om的核酸、其衍生物以及此类 核酸和衍生物作为瘿蜂防治剂的用途。

在某些方面，本发明提供在高严格杂交(high stringency hybridization)条 件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID  NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ  ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID  NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO:127-132、SEQ ID NO: 150-222和SEQ ID NO:234-244中所示的序列及其互补序列选择性杂交的分 离的核酸。

在某些方面，本发明提供与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID  NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID  NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO:150-222和SEQ ID NO:234-244中所示的序列及其互补 序列的同一性(identical)为90-99.99%的分离的核酸。

在某些方面，本发明提供包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID  NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID  NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO:150-222和SEQ ID NO:234-244中所示的序列及其互补 序列的至少17个邻接核苷酸(contiguous nucleotides)的分离的核酸。

在某些方面，本发明提供来自Li或Om的核酸，所述核酸包括如上所示 的与所述核酸的蜜蜂直向同源物(ortholog)的同一性为约80%以下的核酸。

在某些方面，本发明提供包括可操作地连接至表达调控序列(expression  control sequence)的来自Li或Om的核酸或此类序列的反向互补体的载体。

在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有包括可操作地连接至表达 调控序列的来自Li或Om的核酸或此类序列的反向互补体的载体的宿主细 胞。

在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有包括可操作地连接至表达 调控序列的来自Li或Om的核酸的载体的植物组织，例如叶组织和种子。

在某些方面，本发明提供抑制Li或Om核酸表达的分离的小抑制性核糖 核酸(siRNA)分子。

在某些方面，本发明提供分离的双链核糖核酸(dsRNA)分子，所述分子 包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID  NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ  ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ  ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO:127-132、SEQ ID NO: 150-222和SEQ ID NO:234-244中的至少17个邻接核苷酸基本上同一的第一 链核苷酸和与第一链核苷酸基本上互补的第二链核苷酸。

在某些方面，本发明提供双链核糖核酸(dsRNA)分子，其与来自Li或Om 的mRNA(Li或Om靶dsRNA)高度同源(大于80%)，包括与dsRNA的蜜蜂直向 同源物的同一性为约80%以下的上述所示的dsRNA分子。

在某些方面，本发明提供包括可操作地连接至为来自Li或Om的dsRNA 的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列的载体。

在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有载体的宿主细胞，所述载 体包括可操作地连接至为来自Li或Om的dsRNA的一条链或两条链的模板的 核苷酸序列的表达调控序列。

在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有载体的植物组织，所述载 体包括可操作地连接至为来自Li或Om的dsRNA的一条链或两条链的模板的 核苷酸序列的表达调控序列。

在某些方面，本发明提供抑制Li或Om的必需基因的表达的分离的小抑 制性核糖核酸(siRNA)分子。

在某些方面，本发明提供通过在植物中或者在植物的繁殖或生殖材料中 表达Li或Om的dsRNA来生产抗害虫植物的方法。

在某些方面，本发明提供通过在桉树中或者在桉树的繁殖或生殖材料中 表达Li或Om的dsRNA来生产抗害虫桉树的方法。

在某些方面，本发明提供通过在桉树中或者在桉树的繁殖或生殖材料中 表达Li或Om的靶向dsRNA来生产抗瘿蜂感染和/或侵扰的桉树的方法。

在某些方面，本发明提供抗植物病原害虫的植物的生产方法，所述方法 用表达dsRNA的重组DNA构建体或构建体的组合来转化植物细胞；由转化的 植物细胞再生植物；和在适于所述重组DNA构建体表达的条件下使转化的植 物细胞生长。

本发明的一个或多个实施方案的细节将于下述附图和说明书中示出。从 说明书和附图以及从权利要求来看，本发明的其他特征、目的和优势将显而 易见。

附图说明

图1描述了根据本发明的某些非限制性核酸。(A)构建有三个转基因的 核酸构建体#1(SEQ ID NO:37)的示意图。转基因P1-T1编码用于沉默Li外被 体(Coatomer)亚单位α-样(αCOP)、染色质域-解旋酶DNA-结合蛋白Mi-2同系 物(Cdh3)和毒羧酸酯酶-6同工型1(venom carboxylesterase-6isoform1) (VCE-F2)基因的发夹RNA(hpRNA)。转基因P2-T2编码用于沉默OmαCOP、 Cdh3和VCE-F2基因的hpRNA。转基因P3-T3编码具有LiαCOP、Cdh3和 VCE-F2基因以及OmαCOP、Cdh3和VCE-F2基因的正义序列的mRNA。由 转基因P3-T3转录的mRNA为细胞质增强沉默信号(cytoplasmic enhancement  of the silencing signal)的模板。(B)通过核酸构建体#1(左-Li RNAi1,SEQ ID  NO:137；右-Om RNAi1,SEQ ID NO:138)转录产生的hpRNA分子。定义： P1-CaMV35S启动子(SEQ ID NO:27)；P2-AtUBQ1启动子(SEQ ID NO: 28)；P3–At肌动蛋白7(AtActin7)启动子(SEQ ID NO:29)；T1-AtRiboProS40 终止子(SEQ ID NO:32)；T2-AtUBQ1终止子(SEQ ID NO:33)；T3-NOS终 止子(SEQ ID NO:34)；i1-100bp LiαCOP基因(SEQ ID NO:1)；i2-100bp Li  VCE-F2基因(SEQ ID NO:2)；i3-100bp Li Cdh3基因(SEQ ID NO:3)；带有 A93C置换(change)以消除预测的聚腺苷酸化位点的m1-100bp OmαCOP基 因(SEQ ID NO:7)；m1*(P3和T3之间的m1)-100bp OmαCOP基因(SEQ ID  NO:234)；m2-100bp Om Cdh3基因(SEQ ID NO:8)；m3-100bp Om VCE-F2 基因(SEQ ID NO:9)；带有XhoI位点的L1–环#1(SEQ ID NO:13)；带有AscI 位点的L2–环#2(SEQ ID NO:14)。Poly A尾如SEQ ID NO:245所公开。

图2描述根据本发明的某些非限制性核酸。(A)构建有三个基因的核酸 构建体#2(SEQ ID NO:38)的示意图。转基因P1-T4编码用于沉默Li几丁质合 成酶、铁蛋白和保幼激素环氧化物水解酶(JHEH)基因的发夹RNA(hpRNA)。 转基因P4至T5编码用于沉默Om几丁质合成酶、铁蛋白和JHEH基因的 hpRNA。转基因P5-T3编码具有Li几丁质合成酶、铁蛋白和JHEH基因以及Om 几丁质合成酶、铁蛋白和JHEH基因的正义序列的mRNA。由转基因P5-T3转 录的mRNA为细胞质增强沉默信号的模板。(B)通过核酸构建体#2转录产生 的hpRNA分子。(左-Li RNAi2,SEQ ID NO:141；右-Om RNAi2,SEQ ID NO: 142)。定义：P1-CaMV35S启动子(SEQ ID NO:27)；P4–AtγTI(AtGammTI) P2启动子(SEQ ID NO:30)；P5-sgFIMV启动子(SEQ ID NO:31)；T4–Atδ (AtDelta)TIP终止子(SEQ ID NO:35)；T5-AtGammTI P2终止子(SEQ ID NO: 36)；T3-NOS终止子(SEQ ID NO:34)；i4-100bp Li几丁质合成酶基因(SEQ  ID NO:4)；i5-100bp Li铁蛋白基因(SEQ ID NO:5)；i6-100bp Li JHEH基因 (SEQ ID NO:6)；m4-100bp Om几丁质合成酶基因(SEQ ID NO:10)；m5- 100bp Om铁蛋白基因(SEQ ID NO:11)；m6-100bp Om JHEH基因(SEQ ID  NO:12)；L1–环#1(SEQ ID NO:13)；L2–环#2(SEQ ID NO:14)。Poly-A 尾如SEQ ID NO:245所公开。

图3描述根据本发明的某些非限制性核酸。(A)构建有三个转基因的核 酸构建体#3(SEQ ID NO:124)的示意图。转基因P1-T6编码用于沉默Li mor-SWI/SNF复合体亚单位SMARCC2(MOR)、真核转录起始因子3亚单位I- 样(TIF)和蛋白质磷酸化酶PP2A 55 kDa调节亚单位样同工型1(PPR)基因的发 夹RNA(hpRNA)。转基因P6-T4编码用于沉默Om MOR、TIF和PPR基因的 hpRNA。转基因P5-T3编码具有Om MOR、TIF和PPR基因以及Li MOR、TIF 和PPR基因的正义序列的mRNA。由转基因P5-T3转录的mRNA编码非功能性 蛋白质并且为细胞质增强沉默信号的模板。(B)通过核酸构建体#3转录产生 的hpRNA分子。定义：P1-CaMV 35S启动子(SEQ ID NO:27)；P6-AtDelta  TIP启动子(SEQ ID NO:125)；P5-sgFIMV启动子(SEQ ID NO:31)；T6–At 肌动蛋白7(AtActin7)终止子(SEQ ID NO:126)；T4-AtDelta TIP终止子(SEQ  ID NO:35)；T3-NOS终止子(SEQ ID NO:34)；i7-100bp Li MOR(SEQ ID  NO:127)；i8-100bp Li TIF基因(SEQ ID NO:128)；i9-100bp Li PPR基因 (SEQ ID NO:129)；m7-100bp Om MOR基因(SEQ ID NO:130)；m8-100bp 带有C98G置换以消除SacI位点的Om TIF基因(SEQ ID NO:131；相当于把序 列中的C472G)；m9-81bp带有T2C置换以消除XbaI位点的Om PPR基因 (SEQ ID NO:132)；L1–环#1(SEQ ID NO:13)；L3–环#3(SEQ ID NO: 139)。Poly-A尾如SEQ ID NO:245所公开。

各图中相似的参考符号表示相似的元件。

具体实施方式

本发明涉及使用双链RNA(dsRNA)介导的技术来防治植物的昆虫感染 和侵扰。本发明人已进行了天然桉树害虫桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小 蜂(Om)的转录组测序，并发掘各自的转录组来鉴定对应于Li和Om mRNA的 Li和Om基因的开放阅读框。Li和Om RNA的鉴定允许设计介导Li和Om基因 下调(沉默)的siRNA和dsRNA。因此，将此类siRNA和dsRNA用作生物防治剂 来杀灭或抑制Li和Om进展，并抑制由Li和Om造成的植物感染。

因此，本发明描述基于核酸来防治瘿蜂害虫的方法。活性成分为核酸， 例如双链RNA(dsRNA)或可促进或导致产生dsRNA的核酸，可将其用作杀虫 制剂。dsRNA可在宿主植物、植物部分(plant part)、植物细胞或种子中表达 以保护植物抵抗瘿蜂。dsRNA的序列对应于瘿蜂必需基因的部分或全部，并 经RNA干扰(RNAi)引起昆虫靶基因的下调。作为mRNA下调的结果，dsRNA 阻止昆虫靶蛋白的表达并引起昆虫的死亡、生长停滞或不育。

本发明的方法发现在期望抑制瘿蜂的活力、生长、发育或生殖，或者降 低昆虫的病原性或感染性的任何技术领域实际应用。本发明的方法进一步发 现在期望具体下调瘿蜂昆虫中的一种或多种靶基因表达的情况中实际应用。 特别有用的实际应用包括，但不限于保护植物抵抗瘿蜂害虫侵扰(pest  infestation)。

用于防止昆虫侵扰敏感细胞或植物的昆虫侵扰的siRNA对昆虫生长的 防治通过使昆虫与通过退火互补链产生的dsRNA接触来起作用，所述互补链 之一具有与昆虫靶基因的至少部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。dsRNA在 被昆虫摄食然后由昆虫经肠吸收的植物组织中表达，从而控制生长或防止侵 扰。参见Huvenne等,2010,J Insect Physiol56:227-35。

用于siRNA介导的干扰的瘿蜂靶基因包括优选非冗余的活力基因(vital  gene)。活力靶基因可为当被抑制时干扰昆虫生长或存活或病原性或感染性的 任何基因。此类活力靶基因对于昆虫的活力、生长、发育或生殖是必需的， 或者是参与昆虫病原性或感染性，以致特异性抑制靶基因导致致死表型或降 低或停止昆虫侵扰的任何基因。此类活力靶基因的下调(其活性不能由其他 相关基因补充)导致害虫幼虫的严重损伤并提供针对无柄(sessile)瘿蜂害虫的 有效的害虫防治系统。靶基因可为在此所述的任何靶基因，例如害虫活力、 生长、发育或生殖所必需的靶基因。靶基因的实例包括，例如参与蛋白质合 成和/或新陈代谢和/或RNA合成和代谢和/或细胞进程的基因。这些靶基因的 微小敲除将对许多其它基因和进程产生影响，最终导致对靶害虫的致死效 应。此类下调靶基因将导致昆虫的死亡，或停止或延迟昆虫的生殖或生长。 此类靶基因对于昆虫活力是至关重要的并称为活力基因。

潜在的靶基因可基于与其它昆虫物种基因的同源性来鉴定。公布的全基 因组RNAi介导的基因干扰库(15,16)可用于鉴定当基于这些基因的RNAi表 达并通过摄食或任何其它手段引入靶害虫有机体时使其它有机体致死的基 因。因此，果蝇中鉴定为RNAi-致死的基因可用于筛选膜翅目物种的直向同 源物。此类膜翅目直向同源物可进一步用于筛选用于潜在靶标的瘿蜂物种。

Li和Om是无柄害虫。因此，Li和Om活力靶基因不能仅基于在非无柄害 虫中显示为活力基因的基因来预测。无柄害虫，例如不能迁徙至可替代的进 食源(feed source)。在Li和Om的情况中，发育中的害虫禁闭于瘿瘤且在80-120 天内进食相同的来源。这种发育模式导致缓慢但持续吸收dsRNA的可能性， 其可具有对非无柄害虫不起作用的累积效应。因此，尽管如此，推定的靶基 因，例如蠕虫中并未描述为活力的靶基因，也可为瘿蜂中的活力靶基因。

靶基因的实例包括但不限于αCOP，COPI囊泡外被体复合体的α亚单位； 染色质域-解旋酶-DNA-结合蛋白3(Cdh3)；几丁质合成酶，毒羧酸酯酶-6同 工型1；保幼激素环氧化物水解酶；和铁蛋白。瘿蜂靶基因的核苷酸序列包 括，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ  ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15、SEQ ID  NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID  NO:25或SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO:127-132、SEQ ID  NO:150-222和SEQ ID NO:234-244中所列的序列，此类序列的互补体，以及 在高严格杂交条件下与此类序列和互补体选择性杂交的序列。

用于dsRNA介导的瘿蜂靶基因下调的核苷酸序列包括，例如(i)SEQ ID  NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ  ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、 SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID  NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID  NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO:127-132、SEQ ID NO:150-222和 SEQ ID NO:234-244中所列的序列，和此类序列的互补体；(ii)与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID  NO:11或SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID  NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26， SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO:127-132、SEQ ID NO:150-222和SEQ ID NO: 234-244中所列的序列同一性为至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%or99.9%的序列，和此类序列的互补体；(iii)包括 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ  ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID  NO:26、SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO:127-132、SEQ ID NO:150-222和 SEQ ID NO:234-244的至少17个邻接核苷酸的序列，和此类序列的互补体； 和(iv)在高严格杂交条件下与此类序列和互补体选择性杂交的序列。

本文所使用的“分离的”核酸为已从其天然环境的组分中鉴定并分离和/ 或回收的核酸。

本文所使用的“防治害虫”是指杀死害虫，或防止害虫发育或生长，或防 止害虫感染或侵扰。本文所使用的防治害虫还包括防治害虫的后代(发育的 卵)。本文所使用的防治害虫还包括抑制害虫活力、生长、发育或生殖，或 降低害虫的病原性或感染性。本文所使用的化合物和/或组合物可用于保持有 机体健康并可治疗性、预防性或系统性地用于防治害虫或避免生长或发育或 感染或侵扰。

特别地，设想的通过本文所述方法防治的害虫为植物病原性有害昆虫。 因此本文所使用的“防治昆虫”包括防治昆虫后代(例如发育中的卵)。本文所 使用的防治昆虫包括抑制昆虫的活力、生长、发育或生殖，或降低昆虫的病 原性或感染性。如本文所使用的，防治昆虫可指抑制昆虫的生物学活性，产 生一种或多种下列属性：昆虫进食减少、昆虫活力减少、昆虫死亡、昆虫的 分化和发育抑制、昆虫有性生殖能力的缺失或降低。

本文所述的化合物和/或组合物可用于保持有机体健康并可治疗性、预 防性或系统性地用于防治昆虫或避免昆虫生长或发育或感染或侵扰。因此， 本发明可允许预先易感的有机体发育出抵抗昆虫有机体侵扰的抗性。

术语“与……的至少部分互补”是指与在超过10个核苷酸上，例如在至少 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个邻接核苷酸上的靶标的 核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。尽管有上述，但“与……的至少部分互 补”还可包括在超过20个核苷酸的长度上，例如在至少20、21、22、23、24 或更多个邻接核苷酸长度上与靶标序列的核苷酸序列的互补大于80%的互 补序列[13,14]。

在某些方面，本发明提供下调昆虫中靶基因表达的方法，所述方法包括 使昆虫与dsRNA接触，其中，dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与要 下调的昆虫靶基因的核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列，从而使dsRNA 摄入昆虫内，进而下调昆虫靶基因的表达。

术语“昆虫”包括所有类型和处于包括卵、幼虫或稚虫、蛹和成虫阶段的 所有发育阶段的昆虫。

如本文所使用的，术语“植物”包括期望治疗以预防或降低昆虫生长和/ 或昆虫侵扰的任何植物材料。其包括尤其是全植物、秧苗、繁殖或生殖材料 如种子、插条、接枝、外植体等，以及植物细胞和组织培养物。植物材料应 表达或具有表达RNA分子的能力，所述RNA分子包括为害虫有机体的至少一 种靶基因的正义链的至少部分核苷酸序列的RNA互补体或表示其RNA等同 物(equivalent)的至少一种核苷酸序列，以使RNA分子在植物-害虫相互作用时 被害虫吸收，所述RNA分子能够通过RNA干扰抑制靶基因或下调靶基因的表 达。

术语“基因表达下调”和“基因表达抑制”可交换使用，并且是指在来自靶 基因的蛋白质产物和/或mRNA产物水平上，基因表达的可测量或可观察的减 少，或可检测的基因表达的完全消除。dsRNA对基因表达的下调效果可计算 为与正常基因表达相比时的至少30%、40%、50%、60%，优选70%、80%， 或甚至更优选90%或95%。根据靶基因的性质，昆虫细胞中基因表达的下调 或抑制可通过细胞或整个昆虫的表型分析，或者通过使用分子技术如RNA液 相杂交(solution hybridization)、PCR、核酸酶保护、RNA杂交(Northern  hybridization)、反转录、利用微阵列的基因表达监控、抗体结合、酶联免疫 吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(Western blotting)、放射免疫测定(RIA)、其他 免疫测定或荧光激活细胞分析(FACS)测量mRNA或蛋白质表达来证实。

必需基因的下调导致生长抑制。取决于所使用的试验，与已用对照 dsRNA处理的害虫有机体相比，生长抑制可定量为大于约5%、10%，更优选 约20%、25%、33%、50%、60%、75%、80%，最优选约90%、95%，或约 99%。

“靶基因”可为期望受到抑制的必需的任何基因，因为其干扰昆虫的生长 或病原性或感染性。例如，如果本发明的方法被用于防止昆虫生长和/或侵扰， 则优选筛选对昆虫活力、生长、发育或生殖必需的靶基因，或者参与昆虫病 原性或感染性的任何基因，以致靶基因的特异性抑制导致致死表型或降低或 停止昆虫侵扰。

根据一个非限制性实施方案，靶基因为当使用本发明的方法其表达下调 或受抑制时昆虫死亡或者昆虫的生殖或生长停止或迟缓的此类靶基因。这种 靶基因被认为是对昆虫活力所必需的，并称为必需基因。因此，本发明包括 如此处所述的方法，其中所述靶基因为必需基因。

在不受理论束缚下，靶基因为当其下调时使得昆虫的侵扰或感染、昆虫 引起的损害、和/或昆虫侵扰或感染宿主有机体和/或引起此类损害的能力降 低的此类靶基因。术语“侵扰”(动词，infest)和“感染”(动词，infect)或者 “侵扰”(名词，infestion)和“感染”(名词，infection)通常全文可交换使用。 这种靶基因被认为参与昆虫的病原性或感染性。因此，本发明延伸至此处所 述的方法，其中所述靶基因参与昆虫的病原性或感染性。选择后一种类型的 靶基因的优势在于，阻断昆虫进一步感染植物或植物部分，并且抑制形成下 一代。

在防治特定昆虫在宿主细胞或宿主有机体内或上生长或侵扰的dsRNA- 介导的方法中，优选dsRNA不与任何宿主基因分享，或至少不与宿主的任何 必需基因分享任何显著同源性。由此而言，优选dsRNA显示小于30%、更优 选小于20%、更优选小于10%和甚至更优选小于5%的与与宿主细胞的任何基 因的核酸序列同一性。百分序列同一性应以dsRNA区的全长计算。如果宿主 有机体的基因组序列数据是可获得的，则可使用标准生物信息学工具再确认 与dsRNA的序列同一性。在一个实施方案中，在dsRNA和宿主序列之间的21 个邻接核苷酸上没有序列同一性，意味着由此而言，优选dsRNA的21个邻接 碱基对未出现在宿主有机体的编码序列(CDS)中。在另一实施方案中，在 dsRNA的24个邻接核苷酸上与来自宿主物种的任何核苷酸序列的序列同一 性小于约10%或小于约12%。

dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与要下调的靶基因的靶核苷酸 序列相对应的核苷酸序列。dsRNA的另一链能够与第一链碱基配对。

靶昆虫基因的“靶区”或“靶核苷酸序列”的表述可为基因的任何适合的 区域或核苷酸序列。靶区应包括靶基因的至少17、至少18或至少19个连续核 苷酸(consecutive nucleotide)，更优选靶基因的至少20或至少21个核苷酸，仍 更优选靶基因的至少22、23或24个核苷酸。

优选(至少部分)dsRNA将与昆虫靶基因的靶区分享100%的序列同一性。 然而，将理解，在双链区全长上的100%序列同一性对于功能性RNA抑制不 是必需的。相对于靶基因具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现对 RNA抑制是有效的。

术语“对应于”或“与……互补”在此可交换使用，并且当这些术语用于 指dsRNA与靶基因的靶区之间的序列对应性(sequence correspondence)时，它 们可以相应地解读为，即不绝对要求100%的序列同一性。然而，dsRNA与 靶区之间的百分序列同一性通常为至少80%或85%同一，优选至少90%、 95%、96%，或更优选至少97%、98%，并仍更优选至少99%。当两条核酸链 的至少85%的碱基配对时，这两条核酸链“基本上互补”。

本文所使用的术语“互补”涉及DNA-DNA互补、RNA-RNA互补和 DNA-RNA互补的全部。在同此类推中，术语“RNA等同物”基本上是指在 DNA序列中，碱基“T”可由核糖核酸中通常存在的相应碱基“U”所代替。

尽管dsRNA包含对应于靶基因的靶区的序列，但对应于靶区序列的整个 dsRNA不是必要的。例如，dsRNA可包含位于特异性靶序列侧翼的短的非靶 区，条件是此类序列在RNA抑制中不对dsRNA的性能影响到实质程度 (material extent)。

dsRNA可包含一种或多种置换碱基以便优化在RNAi中的性能。如何依 次改变dsRNA的各碱基并(例如在适合的体外试验体系中)测试所得dsRNA的 活性从而优化所的dsRNA的性能，对于本领域普通技术人员来说将是显而易 见的。

dsRNA可进一步包含DNA碱基、非天然碱基或糖-磷酸骨架的非天然骨 架连接或修饰，从而例如增强保存期间的稳定性或增强被核酸酶降解的抗 性。

约21bp的干扰RNA(siRNA)对于基因沉默的是有用的。优选将dsRNA的 长度增加到至少约80-100bp可提高dsRNA被害虫有机体吸收的效率。此类较 长的片段可在基因沉默中更加有效，可能是由于这些长dsRNA被无脊椎动物 更有效地吸收。

由具有29bp茎区(stem)和2-nt3’突出端的27-mer平端的或短发夹 (sh)RNA的RNA双链体(duplex)也可用作siRNA。因此，基于上述鉴定的靶标 且为具有29bp茎区和2-nt3’突出端的27-mer平端或短发夹(sh)RNA的靶标的 分子也包括在本发明的范围内。

因此，在一个实施方案中，dsRNA片段(或区域)本身将优选为至少17bp 长，优选18或19bp长，更优选至少20bp，更优选至少21bp、或至少22b、或 至少23bp、或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp长。“双链RNA片段”或“双 链RNA区”的表述是指对应于靶基因(的部分)的dsRNA的小实体(entity)。

更普遍地，双链RNA优选在约17-1500bp之间、甚至更优选在约 80-1000bp之间，并最优选在约17-27bp之间或在约80-250bp之间；例如约 17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、 80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、 550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、 1400bp或1500bp的双链RNA区。

dsRNA长度的上限可取决于i)dsRNA被昆虫吸收的要求和ii)dsRNA在 细胞中被加工成指导RNAi的片段的要求。所选长度还可受到RNA合成方法 和RNA运送至细胞的模式的影响。优选在本发明的方法中要使用的dsRNA将 为小于10,000bp长，更优选1000bp以下、更优选500bp以下、更优选300bp以 下、更优选100bp以下。对于任何给定的靶基因和昆虫，为了有效抑制的 dsRNA的最佳长度可通过实验确定。

dsRNA可完全或部分双链化。部分dsRNA可在双链部分的一端或两端包 含短单链突出端，条件是RNA仍能够被昆虫吸收并指导RNAi。dsRNA还可 包含内部非互补区。

本发明的方法包括向同一昆虫同时或连续供给两种或更多种不同的 dsRNA或RNA构建体，以便实现多种靶基因的下调或抑制，或者实现单个靶 基因更强有力的抑制。

可选地，通过提供中多种靶序列的一种dsRNA来命中多种靶标，通过存 在对应于靶基因的双链RNA片段的超过一个拷贝来更有效地抑制单个靶标。 因此，在某些方面，dsRNA构建体包括多个dsRNA区，每一个dsRNA区的至 少一条链包括与昆虫靶基因的靶核苷酸序列的至少部分互补的核苷酸序列。 RNA构建体中的dsRNA区可与相同或不同的靶基因互补和/或dsRNA区可与 来自相同或不同昆虫物种的靶标互补。

术语“命中(hit、hits和hitting)”是表示至少一条dsRNA链与靶基因或核苷 酸序列互补并且其本身可结合至靶基因或核苷酸序列的可选词汇。

在一个实施方案中，双链RNA区包括与靶基因互补的核苷酸序列的多个 拷贝。可选地，dsRNA命中相同靶基因的超过一个靶序列。本发明因而包括 包含与昆虫靶标的核苷酸序列的至少部分互补的所述核苷酸序列的至少两 个拷贝的分离的双链RNA构建体。

如本文所述的术语“多个(种)”是指至少两个(种)、至少三个(种)、至少四 个(种)、至少五个(种)、至少六个(种)等。

“其它靶基因”或“至少一种其它靶基因”的表述是指例如第二种、第三种 或第四种等靶基因。

开发命中超过一种上述靶标的dsRNA或者与上述靶标不同的不同 dsRNA的组合并用于本发明的方法。

双链RNA中的dsRNA区(或片段)可如下组合：a)当靶向单个靶基因的多 个dsRNA区组合时，它们可以在RNA构建体中以原始顺序组合(即，其中所 述区域出现在靶基因中的顺序)；b)可选地，片段的原始顺序可忽略，以便 它们以任何顺序随机或有意地颠倒(scrambled)和组合为双链RNA构建体中； c)可选地，在dsRNA构建体中一个单独片段可重复多次，例如1-10次，如1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或d)dsRNA区(靶向单个或不同靶基因)可 以以正义或反义方向组合。

靶向单个或不同弱基因(weak gene)的多个dsRNA区可组合来获得更强 的RNAi效果。“昆虫特异性”基因或序列，例如瘿蜂特异性、特别是Li或Om 特异性基因和序列，包括当可通过生物信息学同源性检索，例如通过BLAST 检索来确定时，在非昆虫有机体中不具有实质上同源的对应物(counterpart) 的基因。特异性靶基因的选择产生种特异性RNAi效果，而对非靶标有机体 (non-target organism)没有效果或没有实质(不利)效果。“保守基因”包括在靶标 有机体和非靶标有机体之间保守(在氨基酸水平上)的基因。为了减少对非靶 标物种可能的作用，分析此类有效但保守的基因，并选择来自这些保守基因 的可变区的序列被RNA构建体中的dsRNA区靶向。在核酸序列水平上评价保 守性。此类可变区因而至少包括保守靶基因的在核酸序列水平上的保守部 分。根据本发明的RNA构建体从不同的生物学途径靶向多基因，导致广泛的 细胞RNAi效果和更佳有效的昆虫防治。在某些实施方案中，dsRNA由例如 与蜜蜂直向同源物，例如但不限于SEQ ID NO:39-44和SEQ ID NO:134-136 中所列的本文所公开的Li和Om序列的蜜蜂直向同源的序列的同一性为80% 以下的Li和Om转录组的序列构建。

在某些方面，dsRNA构建体构建有影响不同类型细胞功能的基因序列。 此类细胞功能类型的实例包括，但不限于，(i)蛋白质合成和代谢，(ii)RNA 合成和代谢，和(iii)细胞进程。在某些实施方案中，dsRNA构建体包括来自 前述各权利要求即三种类型的序列。在某些实施方案中，dsRNA构建体包括 来自前述类型中的两种类型，如蛋白质合成和代谢以及RNA合成和代谢；蛋 白质合成和细胞进程；或RNA合成和代谢以及细胞进程的序列。

dsRNA区包括与本文所记载的任一种靶基因的核苷酸序列的至少部分 或一部分互补的至少一条链。然而，假如双链RNA区之一包括与本文所记载 的任一种靶基因的核苷酸序列的一部分互补的至少一条链，则其它双链RNA 区可包括与任何其它昆虫靶基因(包括已知的靶基因)的一部分互补的至少一 条链。

在某些构建体中，dsRNA可包括附加序列和任选的连接子。附加序列可 包括，例如(i)促进dsRNA构建体大规模生产的序列；(ii)影响dsRNA稳定性 的提高或降低的序列；(iii)允许蛋白质或其他分子结合以促进RNA构建体被 昆虫吸收的序列；(iv)为结合昆虫表面上或胞质中的受体或分子以促进被昆 虫吸收、内吞和/或胞转的适配体(aptamer)的序列；或(v)催化dsRNA区加工 的附加序列。在一个实施方案中，连接子为附有条件地自剪切RNA序列，优 选pH敏感性连接子或疏水敏感性连接子。

dsRNA构建体的多个dsRNA区可直接连接或者通过一个或多个连接子 连接。连接子可存在于RNA构建体中的位点，将dsRNA区与另一个感兴趣区 分隔。dsRNA构建体的多个dsRNA区可在没有连接子的情况下连接。

当连接子存在时，其可用于断开害虫有机体中的较小的dsRNA区。有利 地，在该情况下，连接子序列可在特定情况下促使长dsRNA分成较小的 dsRNA区，导致在这些情况下分离的dsRNA区的释放，并由这些较小的 dsRNA区产生更有效的基因沉默。适合的附有条件的自剪切连接子的实例为 在高pH条件下自剪切的RNA序列。此类RNA序列的适合的实例由Borda等人 记载(Nucleic Acids Res.2003May15；31(10):2595-600)，将该文献引入于此 以作参考。该序列源自锤头状核酶HH16的催化中心。

连接子还可定位于dsRNA构建体的位点，将dsRNA区与另一例如感兴趣 的附加序列分隔，所述感兴趣的附加序列优选为RNA构建体提供某些附加功 能。

dsRNA构建体可包括适配体以促进dsRNA被昆虫吸收。将适配体设计结 合被昆虫吸收的物质。此类物质可来自昆虫或植物来源。适配体的一个具体 实例为结合跨膜蛋白，例如昆虫的跨膜蛋白的适配体。可选地，适配体可结 合被昆虫吸收的(植物)代谢物或营养素。

连接子可在内涵体中进行自剪切。当本发明的构建体经胞吞或胞转被昆 虫吸收，并且因而在昆虫物种的内涵体中被区室化时这可是有利的。内涵体 可具有低pH环境，导致连接子的剪切。

当疏水条件下自剪切的连接子用于经细胞壁运输从一个细胞转移至另 一个细胞时，例如当穿过有害昆虫有机体的细胞壁时，其在dsRNA构建体中 特别有用。

内含子可用作连接子。本文所使用的“内含子”可为信使RNA的任何非编 码RNA序列。

还可将范围在约1碱基对至约10,000碱基对的非互补性RNA序列用作连 接子。

在不希望受任何特定理论或机理的束缚下，认为长dsRNA被昆虫从它们 的附近环境中吸收。dsRNA被吸收进入肠并转移至肠上皮细胞，然后在细胞 中通过内源核酸内切酶的作用加工成短dsRNA，称为小干扰RNA(siRNA)。 所得siRNA然后通过形成称为RISC或RNA干扰沉默复合体的多组分RNase复 合体来介导RNAi。

为了实现昆虫细胞内靶基因的下调，添加至细胞壁外部的dsRNA可为可 吸收进入细胞，接着在细胞内加工成siRNA，进而介导RNAi的任何dsRNA 或dsRNA构建体，或者添加至细胞外部本身可为可吸收进入细胞且从而指导 RNAi的siRNA的RNA。

siRNA通常为长度在19-25碱基对或20-24碱基对范围内的短的dsRNA。 在优选实施方案中，可使用对应于要下调的靶基因，具有19、20、21、22、 23、24或25个碱基对、特别是21或22个碱基对的siRNA。然而，本发明不意 欲限制此类siRNA的用途。

siRNA可包括在双链部分的侧翼的一端或两端的单链突出端。siRNA可 包含3’突出核苷酸，优选两个3’突出胸苷(dTdT)或尿苷(UU)，如果包括在 dsRNA双链部分中的序列的紧接上游靶基因序列为AA，则3’TT或UU突出端 可包括在siRNA中。这使得siRNA中的TT或UU突出端与靶基因杂交。尽管3’ TT或UU突出端还可位于siRNA的另一端，但是包括在siRNA双链部分中序列 的靶序列的下游序列不必具有AA。由此而言，为RNA/DNA嵌合体的siRNA 也是预期的。这些嵌合体包括，例如如上所述包括具有DNA碱基3’突出端 (如，dTdT)的dsRNA以及为其中一个或多个RNA碱基或核糖核苷酸、甚至整 个链上的所有核糖核苷酸被DNA碱基或脱氧核糖核苷酸代替的多聚核苷酸 的dsRNA的siRNA。

dsRNA可由两个单独的(正义和反义)RNA链通过(非共价)碱基配对退火 在一起而形成。可选地，dsRNA可具有折回茎-环或发夹结构，其中dsRNA 的两个退火链共价连接。在该实施方案中，dsRNA的正义和反义链由部分自 补的单个多核苷酸分子的不同区域形成。如果dsRNA通过在体内例如在宿主 细胞或有机体中表达，或者通过体外转录来合成，则具有该结构的RNA是便 利的。连接两个RNA链的“环”的确切性质和序列，除了不应损害分子的双链 部分介导RNAi的能力以外，对本发明通常是不重要的。用于RNAi的“发夹” 或“茎-环”RNA的特征通常是本领域已知的(例如参见WO 99/53050，将其内 容引入于此以作参考)。在本发明的其他实施方案中，环结构可包括如上所 述的连接子序列或附加序列。

在某些方面，本文公开的Li和Om序列及此类序列的互补体还可通过使 用本领域内已知的方法表达反义RNA或过表达正义RNA来用于抑制Li或Om 核酸的表达。所述已知方法，参见例如Frizzi等，Plant Biotech J,(2010) 8:655-677；Brodersen等,Trends in Genetics,(2008)22:268-280；和美国专利 5,759,829号。使用本文所述的表达元件、载体和方法，针对Li和Om靶基因 的反义RNA或正义RNA在桉树植物中表达。在被Om或Li害虫摄食后，反义 或正义RNA抑制靶基因的表达，从而防治害虫侵扰。

用于设计dsRNA构建体的靶核苷酸序列优选至少17个，优选至少18、19、 20或21个，更优选至少22、23或24个核苷酸长。优选的靶核苷酸序列的非限 制性实例示于实施例中。

靶序列可包括与本文所述序列同源的序列。靶基因的同源物可使用本领 域普通技术人员公知的方法来发现。优选的同源物为包括与本文所公开的序 列的同一性为至少约85%或87.5%、仍更优选至少约90%、仍更优选至少约 95%和最优选至少约99%或99.9%的序列的基因，或其互补体。用于确定序列 同一性的方法在本领域是常规的，并包括使用Blast软件和EMBOSS软件(The  European Molecular Biology Open Software Suite(2000),Rice,P.Longden,I.和 Bleasby,A.Trends in Genetics16,(6)pp276-277)。本文所使用的术语“同一性” 是指核苷酸水平上序列之间的关系。“%同一性”的表述通过在比较窗口上比 较例如两个或更多个最佳比对序列来确定，其中比较窗口中的序列部分可包 括与序列最佳比对用参考序列相比的插入或缺失。参考序列不包括插入或缺 失。参考窗口选自至少10个邻接核苷酸至约50、约100或至约150个核苷酸之 间，优选选自约50和150个核苷酸之间。然后通过确定窗口中序列之间相同 的核苷酸数，将相同的核苷酸数除以窗口中的核苷酸数，再乘以100来计算 “百分率同一性”。

术语“选择性杂交”包括涉及在严格杂交条件下的核酸序列与特定核酸 靶序列的杂交使得可检测程度大于其与非靶核苷酸序列的杂交(例如相对于 背景至少2倍)，并基本上排除非靶核酸。选择性杂交序列典型地彼此具有约 至少40%的序列同一性，优选60-90%的序列同一性，和最优选100%的序列 同一性(即，互补)。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括涉及在该条件下探针将与其靶 序列杂交使得可检测程度大于其他序列(例如，相对于背景至少2倍)的条件。 严格条件是序列依赖的并且由不同环境而不同。通过控制杂交的严格性和/ 或洗涤条件，可识别可与探针达100%互补的靶序列(同源探测)。可选地，可 调整严格条件来允许序列中的某些错配从而检测较低程度的相似性(异源探 测)。最佳地，探针长度为约500个核苷酸，但长度可从小于500个核苷酸至 等于靶序列全长大幅变化。

典型地，严格条件将是其中在pH7.0至8.3和温度为至少约30(短探针， 例如10至50个核苷酸)和至少约60℃(长探针，例如大于50个核苷酸)下盐浓度 小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)的那些。 严格条件还可添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性低严格条 件包括用在37℃下的30至35%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS(十二烷基硫酸钠) 的缓冲溶液杂交并在50至55℃下的1X至2X SSC(20X SSC=3.0M NaCl/0.3M 柠檬酸三钠)中洗涤。示例性温和严格条件包括在37℃下的40至45%甲酰胺、 1M NaCl、1%SDS中杂交并在55至60℃下的0.5X至1X SSC中洗涤。示例性 高严格条件包括在37℃下的50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中杂交并在60至 65℃的0.1X SSC中洗涤。

特异性典型地起到后杂交洗涤的作用，关键因素为最终洗涤液的离子强 度和温度。对于DNA-DNA杂交，T_m可从Meinkoth和Wahl,(1984)Anal. Biochem.,138:267-84等式估算：T_m=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61 (%form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，%GC为鸟嘌呤和胞嘧啶 核苷酸在DNA中的百分比，%form为甲酰胺在杂交液中的百分比，和L为碱 基对中杂交体的长度。T_m为(在确定的离子强度和pH下)其中50%的互补靶序 列与优选匹配的探针杂交的温度。T_m相对于每1%的错配降低约1℃；因此， 可调整T_m、杂交和/或洗涤条件来与期望同一性的序列杂交。例如，如果搜 寻到>90%同一性的序列，T_m可降低10℃。通常，严格条件选择在确定的离 子强度和pH下比特异序列及其互补体的热熔点(T_m)低约5℃。然而，非常严 格条件可在比热熔点(T_m)低1、2、3或4℃下用于杂交和/或洗涤；温和严格条 件可在比热熔点(T_m)低6、7、8、9或10℃下用于杂交和/或洗涤；低严格条件 可在比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃下用于杂交和/或洗涤。使用 该等式、杂交和洗涤组成以及期望的T_m，普通技术人员将理解杂交和/或洗 涤液的严格性的变化是固有描述。如果期望的错配程度产生低于45℃(水溶 液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，则优选增加SSC浓度以便可使用更高的温度。

对核酸杂交的广义指导见Tijssen,Laboratory Techniques in Bihemistry  and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第 2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid  probe assays”，Elsevier,N.Y.(1993)；和Current Protols in Molecular Biology， 第2章，Ausubel等，eds,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York (1995)。除非另有说明，在本申请中，高严格性定义为在65℃下的4X SSC、 5X Denhardt’s(500ml水中5g聚蔗糖、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、 0.1mg/ml煮沸的鲑鱼精子DNA和25mM磷酸盐钠中杂交和在65℃下的0.1X  SSC、0.1%SDS中洗涤。

dsRNA可通过宿主细胞或宿主有机体表达(例如在其中转录)。宿主细胞 或有机体可以是或可以不是对昆虫侵扰敏感或易受其侵害的宿主细胞或有 机体。如果宿主细胞或有机体为对昆虫侵扰敏感或易受其侵害的宿主细胞或 有机体，作为控制昆虫在宿主有机体内或上生长和/或防止或减少宿主有机体 的昆虫侵扰的机理，可使用RNAi介导的一种或多种靶基因在昆虫中的基因 沉默。因此，dsRNA在宿主有机体的细胞内的表达可因此赋予对特定昆虫或 对一类昆虫的抗性。假如dsRNA命中超过一个昆虫靶基因，dsRNA在宿主有 机体的细胞中的表达可赋予对超过一个昆虫或超过一类昆虫的抗性。

在优选的实施方案中，宿主有机体为植物，昆虫为植物病原昆虫。在该 实施方案中，通过在受植物昆虫侵扰或对昆虫侵扰敏感或被植物昆虫摄食的 植物、植物组织或植物细胞中表达dsRNA而使昆虫与dsRNA相接触。优选的 植物宿主有机体为桉树。桉树的实例包括，但不限于以下物种：葡萄桉(E. botryoides)、苹果桉(E.bridgesiana)、赤桉(E.camaldulensis)、灰桉(E.cinerea)、 蓝桉(E.globule)、巨桉(E.grandis)、西达桉(E.gunii)、尼克尔桉(E.nicholii)、 圆叶桉(E.pulverulenta)、大叶桉(E.robusta)、野桉(E.rudis)、柳叶桉(E. saligna)、细叶桉(E.Tereticornis)、尾叶桉(E.Urophilla)、多枝桉(E.viminalis) 和前述物种的任一种特别是巨桉和尾叶桉的杂交种。优选的植物病原昆虫为 瘿蜂，例如Li或Om。

术语“植物”包括期望处理以防止或减少昆虫生长和/或昆虫侵扰的任何 植物材料。其包括尤其是全植物、秧苗、繁殖或生殖材料如种子、插条、接 枝、外植体等，以及植物细胞和组织培养物。植物材料应当表达对应于昆虫 的一种或多种靶基因的dsRNA或具备表达对应于昆虫的一种或多种靶基因 的dsRNA的能力。

在某些方面，本发明提供表达或能够表达至少一种dsRNA的植物，优选 转基因植物、或(转基因)植物用繁殖或生殖材料、或植物细胞培养物，其中 dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与昆虫的靶基因的至少部分靶核苷 酸序列互补的核苷酸序列，以便使dsRNA在植物-昆虫相互作用时被昆虫吸 收，所述双链RNA能够通过RNA干扰抑制靶基因或下调靶基因的表达。靶基 因可为本文所述靶基因的任一种，例如昆虫活力、生长、发育或生殖所必须 的靶基因。

植物可以以在一种或多种细胞、细胞类型或组织中活跃表达(转 录)dsRNA的形式提供。可选地，植物可为“能够表达”的，意指其利用编 码期望的dsRNA的转基因转化，但当提供该植物时(并且以其中提供植物的 形式)转基因在该植物中不活跃。包括编码dsRNA或dsRNA构建体的核苷酸 序列的重组DNA构建体可因而可操作地连接至至少一个调控序列。优选地， 调控序列选自包括如下所述的组成型启动子或组织特异性启动子的组。

靶基因可为本文所述的任一种靶基因。优选地，调控元件为在植物细胞 中活跃的调控元件。更优选地，调控元件源自植物。术语“调控序列”将在广 义上理解，并指能够影响可操作地连接的序列表达的调控核酸。

前述术语包括启动子和激活或增强核酸的转录的所谓的激活子或增强 子的核酸或合成融合分子或其衍生物。本文所使用的术语“可操作地连接”是 指启动子序列与目标基因之间的功能性连接，以使启动子序列能够起始目标 基因的转录。

举例来说，编码dsRNA的转基因核苷酸序列可位于诱导性或者生长或发 育阶段-特异性启动子控制下，通过添加诱导型启动子的诱导物或当达到生 长或发育特定阶段时所述启动子允许dsRNA转录的开启。

可选地，编码dsRNA的转基因位于强组成型启动子如选自包括 CaMV35S启动子、CaMV35S双启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核 酮糖二磷酸羧化酶(rubisco)启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒(Figwort  mosaic virus,FMV)34S启动子、木薯叶脉(cassaya vein)花叶病毒(CsVMV)启 动子的组的任一种的调控下(Verdaguer B.等，Plant Mol.Biol.1998 37(6):1055-67)。

可选地，编码dsRNA的转基因位于组织特异性启动子如选自包括编码 PsMTA类型III几丁质酶基因的根特异性启动子，光合组织特异性启动子如 cab1和cab2、rbcS、gapA、gapB和ST-LS1蛋白的启动子，JAS启动子，查耳 酮合成酶启动子和来自草莓的RJ39的启动子的组的任一种的调控下。

编码dsRNA的转基因还可位于昆虫诱导型启动子，例如马铃薯蛋白酶抑 制剂II(PinII)启动子(Duan X等,Nat.Biotechnol.1996,14(4):494-8))；或伤害 诱导型启动子，例如茉莉酸(jasmonate)和乙烯诱导型启动子、PDF1.2启动子 (Manners J M等，Plant Mol.Biol.1998,38(6):1071-80)的调控下；或者防御相 关的启动子，例如水杨酸诱导型启动子和植物病原相关蛋白(PR蛋白)启动子 (PR1启动子(Cornelissen B J等，Nucleic Acids Res.1987,15(17):6799-811； COMT启动子(Toquin V等，Plant Mol.Biol.2003,52(3):495-509)下。

当使用本文所述的方法用于开发抗昆虫的转基因植物时，将编码dsRNA 的核酸位于组织特异性启动子控制下可以是有益的。为了改善dsRNA从植物 细胞向昆虫的转移，植物可优选在首先被植物害虫接近或破坏的植物部分表 达。在植物病原性昆虫的情况下，优选的表达dsRNA的组织为叶、茎、根和 种子。因此，在本文所公开的方法中，可使用植物组织-优选的启动子，例 如叶特异性启动子、茎特异性启动子、韧皮部特异性启动子、木质部特异性 启动子、根特异性启动子或种子特异性启动子(蔗糖转运蛋白基因(sucrose  transporter gene)AtSUC启动子(Baud S等，Plant J.2005,43(6):824-36)、小麦 高分子量麦谷蛋白基因启动子(Robert L S等，Plant Cell.1989,1(6):569-78.))。

根特异性启动子的适合的实例为PsMTA(Fordam-Skelton,A.P.,等，1997 Plant Molecular Biology34:659-668.)和类型III几丁质酶启动子。同样被光活 化的叶和茎特异性或光合组织特异性启动子的实例为来自甜菜的两种叶绿 素结合蛋白(cab1和cab2)的启动子(Stahl D.J.,等，2004BMC Biotechnology 20044:31)、由rbcS编码的核酮糖-二磷酸羧化酶(Rubisco)(Nomura M.等，2000 Plant Mol.Biol.44:99-106)、叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(gapA)和B(gapB) 亚单位(Conley T.R.等.1994Mol.Cell.Biol.19:2525-33；Kwon H.B.等. 1994Plant Physiol.105:357-67)、编码叶和茎特异性蛋白的马铃薯(Solanum  tuberosum)基因的启动子(Zaidi M.A.等，2005Transgenic Res.14:289-98)、茎 调控的防御诱导性基因，如JAS启动子(专利公布号20050034192/US-A1)。花 特异性启动子的实例为例如，查耳酮合成酶启动子(Faktor O.等.1996Plant  Mol.Biol.32:849)，果实特异性启动子的实例为例如来自草莓的RJ39(WO 98 31812)。

使用用于表达dsRNA的其他启动子，其包括但不限于来自RNA Poll、 RNA Poll、RNA PolIII、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子。这些 启动子典型地用于体外生产dsRNA，之后将dsRNA诱导入抗杀虫剂，例如诱 导入抗杀虫液、喷雾剂或粉剂中。

本文所描述的dsRNA或RNA构建体可通过以下步骤产生：(i)使分离的 核酸或重组DNA构建体与无细胞组分接触；或(ii)在允许核酸或重组DNA构 建体转录的条件下将分离的核酸或重组DNA构建体导入(例如，通过转化、 转染或注射)细胞中，从而产生dsRNA或RNA构建体。

任选地，还可将一种或多种转录终止序列引入重组构建体中。术语“转 录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其传导初级转录本的3’加工和多 聚腺苷酰化以及转录终止的信号。可将额外的调控元件，例如转录或翻译增 强子引入表达构建体中。

重组构建体可进一步包括特定的细胞类型中保持和/或复制所需的复制 起点。一个实例为当需要表达构建体作为细胞中的附加型遗传元件(例如， 质粒或柯斯质粒分子)保持于细菌细胞中时，优选的复制起点包括，但不限 于f1-ori和colE1ori。

重组构建体可任选地包括选择标记基因。如本文所述，术语“选择标记 基因”包括任一种基因，其在细胞上赋予表型，其中该基因的表达促进转染 或转化有本发明的表达构建体的细胞的识别和/或选择。适合的选择标记的实 例包括抗氨苄青霉素(Amp^r)、四环素(Tc^r)、卡那霉素(Kan^r)、膦丝菌素 (phosphinothricin)和氯霉素(CAT)基因的抗性基因。其它适合的标记基因提供 代谢特性，例如manA。还可使用可视化标记基因，并且包括例如β-葡糖醛酸 酶(GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。

已稳定转化有编码dsRNA的转基因的植物可提供为不活跃表达dsRNA 但具有活跃表达dsRNA的能力的种子、生殖材料、繁殖材料或细胞培养材料。 植物可以以其中在一种或多种细胞、细胞类型或组织中活跃表达(转录)RNA 分子的形式提供。可选地，植物可为“能够表达”的，意指利用编码期望的RNA 分子的转基因转化，但当提供该植物时(并且以其中提供植物的形式)转基因 在该植物中不活跃。许多载体可用于该目的，并且适合的载体的选择将主要 取决于插入载体的核酸大小和要转化有载体的特定宿主细胞。

出于RNAi的目的在植物中表达外源dsRNA的通用技术是本领域已知的 (参见Baulcombe D,2004,Nature.431(7006):356-63.RNA silencing in plants， 将其内容共引入于此以作参考)。更特别地，出于下调植物害虫如线虫或昆 虫中的基因表达的目的而在植物中表达dsRNA的方法也是本领域已知的。类 似的方法可以以类似的方式应用，从而在植物中表达dsRNA用于下调植物病 原昆虫中靶基因的表达。为了实现该效果，对于植物来说，必须仅在要与昆 虫接触的植物的部分表达(转录)dsRNA，由此dsRNA可被昆虫吸收。取决于 昆虫的性质及其与宿主植物的关系，dsRNA的表达可发生在昆虫在其生命周 期期间存在的植物细胞或组织内，或者RNA可分泌至细胞之间，例如在昆虫 的生命周期期间被昆虫占据的质外体。此外，dsRNA可位于植物细胞如细胞 溶胶中，或者位于植物细胞细胞器如叶绿体、线粒体、液泡或内质网中。

发育期间，瘿蜂幼虫由于摄食(例如摄食质外体)或细胞溶解而暴露于细 胞外环境以及细胞内的内容物。因此，瘿蜂幼虫可暴露于存在于瘿瘤细胞中 的dsRNA或由瘿瘤内部或周围的细胞分泌的dsRNA。

可选地，dsRNA可由植物细胞分泌，并由植物分泌至植物外部。由此， dsRNA可在植物表面上形成保护层。

在另一方面，本发明还提供用于预防或保护植物免受害虫侵扰的方法和 组合物的组合。例如，一种手段提供使用植物转基因方法与使用dsRNA分子 表达的方法和使用此类Bt杀虫蛋白表达的方法相结合。

在进一步的实施方案中，本发明涉及用于控制昆虫生长和/或防止或减 少昆虫侵扰的组合物，其至少包括包含至少一种dsRNA的植物部分、植物细 胞、植物组织或种子，其中所述dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与 昆虫靶基因的至少部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。任选地，组合物进一 步包括至少一种适合的载体、赋形剂或稀释剂。靶基因可为本文所述的任何 靶基因。优选地，昆虫靶基因对于昆虫的活力、生长、发育或生殖是必须的。

其中术语“一种”在“一种靶基因”的语境中使用，这是指“至少一种”靶基 因。对于“一种”靶有机体是指“至少一种”靶有机体，和“一种”RNA分子或宿 主细胞是指“至少一种”RNA分子或宿主细胞同样适用。

根据一个实施方案，本发明的方法依赖于存在于昆虫外部的dsRNA被昆 虫吸收(如，进食)，并且不需要在昆虫细胞内表达dsRNA。此外，本发明还 包括如上所述的其中昆虫与包括dsRNA的组合物接触的方法。瘿蜂幼虫典型 地不在瘿瘤外部进食，因而优选经转基因植物材料将瘿蜂幼虫暴露于 dsRNA。

本发明进一步提供用于下调靶有机体(其能够摄食植物、植物部分、植 物细胞或种子)中至少一种靶基因表达的方法，所述方法包括向靶有机体喂 养植物、植物部分、植物细胞或种子，所述植物、植物部分、植物细胞或种 子表达dsRNA。

在更优选的方面，本发明提供用于下调靶有机体(其能够摄取宿主细胞 或其提取物)中至少一种靶基因的方法，所述方法包括向靶有机体喂养宿主 植物、植物部分、植物细胞或种子，所述宿主植物、植物部分、植物细胞或 种子表达dsRNA，所述dsRNA包括与至少一种靶基因的至少部分核苷酸序列 的RNA等同物互补或表示至少一种靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等 同物的核苷酸序列，从而宿主植物、植物部分、植物细胞或种子被靶有机体 的摄食引起和/或导致至少一种靶基因的表达下调。

本发明提供如本文所定义的植物、植物部分、植物细胞或种子用于下调 昆虫靶基因表达的用途。在更详细的方面，本发明提供如本文所定义的宿主 细胞和/或包括核苷酸序列的RNA分子用于下调靶基因表达的用途，所述核 苷酸序列包括来自靶有机体的靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物 的RNA互补体或表示来自靶有机体的靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA 等同物，所述包括核苷酸序列的RNA分子通过，例如在商品制造时，在植物、 植物部分、植物细胞或种子中转录核酸分子来生产。

根据一个实施方案，本发明的方法依赖于遗传改良生物(GMO)法，其中 dsRNA通过受昆虫侵扰或对昆虫侵扰敏感的细胞或有机体表达。优选地，所 述细胞为植物细胞或所述有机体为植物。

对于siRNA介导的昆虫基因的下调，dsRNA直接或间接地引入和/或表达 于昆虫细胞中。dsRNA可人工添加至昆虫食物或通过转基因食物来源如细菌 和植物来生产[2,8]。包含昆虫基因特异性序列的反向重复RNA被转基因植物 转录，可将其加工成dsRNA并稍后加工成siRNA(为沉默通路中的第一产物的 小干扰RNA)。消化此类转基因植物的昆虫受植物合成的dsRNA和siRNA的影 响[5]。该昆虫防治法可用于保护植物有效对抗特定的害虫[2,8]。然而，不需 要在植物材料中将dsRNA加工成siRNA。dsRNA可被有害昆虫摄食并在昆虫 细胞内首次加工成siRNA。

用于向植物引入外源基因的许多方法是已知的，并可用于将NT多核苷 酸插入植物宿主中，包括生物学和物理植物转化法。例如，参见Miki等， “Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants,”in Methods in Plant  Molecular Biology and Biotechnology,Glick and Thompson,eds.,CRC Press, Inc.,Boca Raton,pp.67-88(1993)。所选方法根据宿主植物而变化，并包括化 学转染法如磷酸钙、微生物介导的基因转移如农杆菌属(Horsch等，Science  227:1229-31(1985))、电穿孔、显微注射和生物射弹轰击(biolistic  bombardment)。

用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方 法是已知且可获得的。参见例如Gruber等，“Vectors for Plant Transformation,” in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,supra,pp.89-119。

分离的多核苷酸或多肽可通过一种或多种典型用于直接递送进入细胞 的技术引入植物中。此类方法可取决于基因修饰所靶向的有机体、细胞、植 物或植物细胞的类型，即单子叶植物或双子叶植物而变化。适合的转化植物 细胞的方法包括显微注射(Crossway,等，(1986)Biotechniques4:320-334；和 U.S.Pat.No.6,300,543)、电穿孔(Riggs,等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606、直接基因转移(Paszkowski等，(1984)EMBO J.3:2717-2722) 和弹道粒子加速(参见，例如Sanford,等，美国专利号4,945,050；WO 91/10725； 和McCabe,等，(1988)Biotechnology6:923-926)。还参见，Tomes等，“Direct  DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment”.第 197-213页，Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Fundamental Methods.eds.O. L.Gamborg&G.C.Phillips.Springer-Verlag Berlin Heidelberg N.Y.,1995；美 国专利号5,736,369(分生组织)；Weissinger,等，(1988)Ann.Rev.Genet. 22:421-477；Sanford,等，(1987)Particulate Science and Technology5:27-37(洋 葱)；Christou,等，(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；Datta,等，(1990) Biotechnology8:736-740(水稻)；Klein,等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309(玉米)；Klein,等，(1988)Biotechnology6:559-563(玉米)；WO 91/10725(玉米)；Klein,等，(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm, 等，(1990)Biotechnology8:833-839；和Gordon-Kamm,等，(1990)Plant Cell 2:603-618(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren&Hooykaas(1984)Nature(英国) 311:763-764；Bytebierm,等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349 (Liliaceae)；De Wet,等，(1985)In The Experimental Manipulation of Ovule  Tissues,ed.G.P.Chapman,等，pp.197-209.Longman,N.Y.(花粉)；Kaeppler, 等，(1990)Plant Cell Reports9:415-418；和Kaeppler,等，(1992)Theor.Appl. Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；美国专利号5,693,512(声处理)； D'Halluin,等，(1992)Plant Cell4:1495-1505(电穿孔)；Li,等，(1993)Plant Cell  Reports12:250-255；和Christou and Ford,(1995)Annals of Botany75:407-413 (水稻)；Osjoda,等，(1996)Nature Biotech.14:745-750；农杆菌介导的玉米转 化(美国专利号5,981,840)；碳化硅晶须法(Frame,等，(1994)Plant J. 6:941-948)；激光法(Guo,等，(1995)Physiologia Plantarum93:19-24)；声处理 法(Bao,等，(1997)Ultrasound in Medicine&Biology23:953-959；Finer and  Finer,(2000)Lett Appl Microbiol.30:406-10；Amoah,等，(2001)J Exp Bot 52:1135-42)；聚乙二醇法(Krens,等，(1982)Nature296:72-77)；单子叶和双 子叶植物细胞的原生质可使用电穿孔(Fromm,等，(1985)Proc.Natl.Acad. Sci.USA82:5824-5828)和显微注射(Crossway,等，(1986)Mol.Gen.Genet. 202:179-185)转化；将其所有引入于此以作参考。

用于将表达载体引入植物的最广泛利用的方法是基于农杆菌的自然转 化系统。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)为植物病原 土壤细菌，其在遗传学上转化植物细胞。根癌农杆菌和毛根农杆菌的Ti和Ri 质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。参见，例如Kado,(1991)Crit.Rev. Plant Sci.10:1。农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移的方法的描述提供 于Gruber,等，上述；Miki,等，上述；和Moloney,等，(1989)Plant Cell Reports 8:238。

类似地，基因可插入分别来源于根癌农杆菌或毛根农杆菌的Ti或Ri质粒 的T-DNA区。因此，表达盒可使用这些质粒如上构建。已知许多调控序列当 其与异源编码序列结合并转化至宿主有机体中时相对于原始编码序列的组 织/器官特异性在基因表达中显示保真性。参见例如Benfey和Chua,(1989) Science244:174-81。特别适合的用于这些质粒的调控序列为在各种靶植物中 的基因的组成型叶特异性表达的启动子。其它有用的调控序列包括来自胭脂 碱合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒 pARC2，可由美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获 得并指定为ATCC67238。如果使用此类系统，则来自Ti或Ri质粒的毒性(vir) 基因也必须与T-DNA部分或者经其中vir基因存在于单独载体的二元体系而 存在。在其中使用的此类系统、载体和转化植物细胞的方法记载于美国专利 4,658,082号；1986年10月1日提交的美国专利申请系列号913,914，参考1993 年11月6日公布的美国专利5,262,306号；和Simpson,等，(1986)Plant Mol.Biol. 6:403-15m，将其全部内容引入于此以作参考。

一旦构建，这些质粒可置于毛根农杆菌或根癌农杆菌中以及用于转化通 常对镰刀菌属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染敏感的植物物种的细胞 的这些载体中。根癌农杆菌或毛根农杆菌的选择将取决于由此转化的植物。 通常根癌农杆菌是优选的转化用有机体。大多数双子叶植物、一些裸子植物 和少数单子叶植物(如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根癌 农杆菌感染敏感。毛根农杆菌还具有广泛的宿主范围，包含大多数双子叶植 物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科 (Chenopodiaceae)的成员。如今可转化单子叶植物已取得了一些成功。欧洲专 利申请604 662 A1号公开了使用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申 请672 752 A1号公开了使用未成熟胚胎的盾片(scutellum)利用农杆菌转化单 子叶植物的方法。Ishida等讨论了通过将未成熟胚胎暴露于根癌农杆菌来转 化玉米的方法(Nature Biotechnology14:745-50(1996))。

一旦转化，这些细胞可用于再生转基因植物。例如，可通过造成植物创 伤然后将载体引入伤口部位，用这些载体感染整个植物。植物的任何部分可 造成创伤，包括叶、茎和根。可选地，外植体形式的植物组织，例如子叶组 织或叶盘可接种这些载体，并在促进植物再生的条件下培养。通过用包含编 码伏马菌素(fumonisin)降解酶基因的毛根农杆菌或根癌农杆菌接种植物组织 而转化的根或嫩枝可用作植物组织来源，从而经体细胞胚胎发生或器官发生 来再生伏马菌素-抗性转基因植物。此类用于再生植物组织的方法的实例公 开于Shahin,(1985)Theor.Appl.Genet.69:235-40；美国专利号4,658,082； Simpson,等，上述；和美国专利申请913,913和913,914号，二者均于1986年10 月1日提交，参考1993年11月16日公布的美国专利5,262,306号，将其中全部 公开内容引入于此以作参考。

作为农杆菌-介导的转化的替代方法已开发了几种植物转化方法(统称为 直接基因转移)。

植物转化的普遍适用的方法为微粒-介导的转化，其中地尺寸为约1至 4μm的微粒表面上携带DNA。利用将微粒加速至300至600m/s速度，足以穿 透植物细胞壁和膜的生物射弹装置(biolistic device)将表达载体引入的植物组 织(Sanford,等，(1987)Part.Sci.Technol.5:27；Sanford,(1988)Trends Biotech 6:299；Sanford,(1990)Physiol.Plant79:206；和Klein,等，(1992)Biotechnology 10:268)。

物理递送DNA至植物的另一方法为如Zang等描述的靶细胞的声处理 ((1991)BioTechnology9:996)。可选地，脂质体或原生质体融合已用于将表达 载体引入植物中。参见例如Deshayes等，(1985)EMBO J.4:2731；和Christou, 等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3962。也已报道了使用CaCl2沉淀、 聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接吸收进入原生质体中。参见例如Hain等， (1985)Mol.Gen.Genet.199:161；和Draper等，(1982)Plant Cell Physiol. 23:451。

还已记载了原生质体和整个细胞和组织的电穿孔。参见例如Donn等， (1990)Abstracts of the VIIth Int'l.Congress on Plant Cell and Tissue Culture  IAPTC,A2-38,p.53；D'Halluin等，(1992)Plant Cell4:1495-505；和Spencer 等，(1994)Plant Mol.Biol.24:51-61。

稳定转化后，进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而， 通过种子繁殖的再生具有由于因种子根据孟德尔法则支配的遗传变化由植 物产生，所以使作物中缺少均匀性的杂合性引起的缺陷。基本上，每个种子 在遗传学上是不同的，且每个将以其自身特有的特征生长。因此，优选转化 植物以使再生植物具有亲本转基因植物同一的特征和特性这样的方式产生。

转化植物可通过微体繁殖(micropropagation)来再生，所述微体繁殖提供 转化植物的迅速、一致的生殖。微体繁殖为由从选择的亲本植物或培养植物 中切离的单块组织长成新一代植物的方法。该方法允许具有表达融合蛋白的 优选组织的植物的规模化繁殖。所产生的新一代植物在遗传学上与原始植物 同一，并具有原始植物所有的特性。微体繁殖使得优质植物材料在短时间内 规模化生产，并使所选栽培植物快速增殖，保留原始转基因或转化植物的特 性。克隆植物的优势为植物增殖速度和所产生植物的品质和一致性。

微体繁殖为多阶段步骤，需要在阶段之间改变培养基或生长条件。因此， 微体繁殖方法涉及四个基本阶段：阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培 养增殖；阶段三，分化和植物形成；和阶段四，温室培养和强化(hardening)。 在阶段一初始组织培养期间，建立组织培养并证实无污染物。在阶段二期间， 繁殖初始组织培养物，直至产生足以满足生产目标数量的组织样品。在阶段 三期间，将在阶段二中生长的组织样品分离并生长为单独的小植株。在阶段 四中，将转化的小植株转移至温室来强化，其中植物对光的耐受性逐渐增加， 从而可在自然环境中生长。

在某些方面，本发明提供抗植物病原害虫的植物的生产方法，所述方法 为用重组DNA构建体或表达dsRNA的构建体的组合转化植物细胞；由转化的 植物细胞再生植物；和在适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化植物 细胞生长。

本发明的方法适用于瘿蜂物种，例如对由RNA干扰产生的基因沉默敏感 且能够从其周围环境内在化dsRNA的桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂 (Om)。本发明适用于处于任何发育阶段的昆虫。由于昆虫具有非生命的外骨 骼，它们不能以均一的速度生长，而是在通过周期性脱落其外骨骼的各阶段 中生长。该过程称为蜕皮或换羽。蜕皮之间的阶段称为“龄”，且根据本发明 可靶向这些阶段。另外，根据本发明还可靶向昆虫的卵或幼虫。根据本本发 明可靶向包括有翅昆虫的变形在内的发育周期中的所有阶段。因此，个体阶 段如幼虫、蛹、稚虫等发育阶段都可靶向。

Li和Om为桉树的害虫。因此，本文所述的核酸、dsRNA和方法对于处 理或抑制Li和Om感染和侵染桉树是有用的。

在优选的方面，本发明提供RNAi介导的害虫防治以产生抗瘿蜂的转基 因桉树。两种桉树瘿蜂入侵物种桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂(Om) 目前已蔓延出澳大利亚分布至全世界的种植园中[6,9]。雌性可有性或孤雌生 殖，且全部生命周期经历约130天。这些害虫在树的叶脉和叶表面下产下卵， 诱导靶组织中瘿瘤形成来充当发育中的幼虫的宿主掩蔽所和食物储存。诱导 瘿瘤形成的确切化合物或信号还未阐明。因此，化合物从卵和幼虫中而不是 从母体中的分泌与瘿蜂形成相关。幼叶中的分生组织或全能细胞(omnipotent  cell)受引发其增殖的化学、机械、病毒或DNA操作的诱导。瘿瘤发展与幼虫 发育相对应，因此瘿瘤的大小和年龄可与幼虫发育阶段相关。Stone等，2002, “The population biology of oak gall wasps(Hymenoptera:Cynipidae)”.Annu. Rev.Entomol.47:633-68。幼虫成熟诱导瘿瘤的进一步发展直至蛹期。当成年 瘿蜂出现时，它们能够飞走并产下数百只卵，在它们死亡前的3-6天期间感 染同一棵树以及附近和远处的树木。大量瘿蜂攻击引起生长停滞、叶子脱落 和死亡，结果可能导致大量森林产量损失。无柄发育的幼虫，在产生对活力 基因有活性的RNAi的转基因植物上进食，受到持续且相对长期地吸收为沉 默特定活力瘿蜂基因而定制设计的si/dsRNA分子的影响。最后沉默作用导致 早期生长阶段中的幼虫死亡，由此保护宿主并使瘿蜂种群大小最小化，保护 宿主植物免受损害。

瘿蜂在非转基因树中的幼虫阶段可长达130天，因此dsRNA的致死效果 可在整个潜在的幼虫生长期累积。一旦幼虫死亡，瘿瘤的发展被遏止，并减 少成虫数量，随后防止对该树木、邻近或远处的树木的感染。

转基因抗性树的特征在于对“瘿蜂发育规模”的如下结果中的一个或多 个：

1.无瘿瘤发展。

2.与WT相比，发展小型瘿瘤(低幼虫质量测量的指标)[测量最大长度、 直径、面积和/或体积]。

3.与WT相比的低幼虫质量测量：与WT相比，总幼虫重量降低。

4.与WT相比，更多的瘿瘤聚集死亡的幼虫。

5.与WT相比，更多的瘿瘤聚集死亡的蛹。

6.与WT相比，未从瘿瘤中出现成虫。

7.与WT相比，发育上受损的成虫，与在野生型树上生长的成虫相比 缺乏繁殖或传播的能力。

实施例

实施例1

瘿蜂转录组测序

从来自以色列埃梅克(Emek)的感染的赤桉中收集瘿蜂感染的叶。通过在 双目显微镜下用尖刀切割并打开瘿瘤来从在树叶和/或叶柄中发现的瘿瘤中 除去瘿蜂幼虫。使用来自各种幼虫发育阶段的幼虫混合物。将各批100只幼 虫置于冰上的微管中。然后将管密封并立即冷冻于液氮中并保存在-80℃直 至进一步处理。使用MasterPure RNA纯化试剂盒和操作手册 (MRC85102-Epicentere Biotechnologies)分离总RNA。总RNA体积为50μl。然 后用DNAse处理总RNA以除去任何剩余的残留DNA，接着分离poly A mRNA (MicroPoly(A)Purist,小规模mRNA纯化试剂盒,AM1919Ambion)。mRNA终 体积为20μl。纯化的mRNA保存在-80℃直至进行454测序。根据标准操作手 册进行454测序，从而提供靶害虫的转录组。

实施例2

Li和Om靶基因和序列的鉴定

选择对特定组织或整个有机体的细胞进程或适当的发育进程至关重要 的唯一的活力Li和Om基因作为基因沉默的靶标。首先，将使用基于已知同 源膜翅目序列的简并引物的标准步骤来鉴定靶基因的片段。其后，将Li和Om 瘿蜂幼虫的各转录组使用454测序仪深度测序平台测序(454Life Sciences； Branford,CT,USA；now Roche,Basel)。使用Roche软件包并使用Blast2Go程 序注释(可于http://www.blast2go.org/获得)，基于与已知公开的膜翅目昆虫转 录组的序列比对来组装序列并对结果进行注释。

表1给出SEQ ID NO：来自Li和Om的所鉴定的基因1-9的完整或部分基因 序列。

表1.Li和Om基因

基因1-9与以下各种意蜂(A.mellifera)基因相比较：αCOP序列 (XM_623195,SEQ ID NO:39中所示编码区)、Cdh3序列(XM_624411,SEQ ID  NO:40中所示编码区)、毒羧酸酯酶-6同工型1(VCE-F2)(XM_391943,SEQ  ID NO:44中所示编码区)、几丁质合成酶(XP_395677,SEQ ID NO:43中所示 编码区)、铁蛋白序列(XM_624041,SEQ ID NO:41中所示编码区)、JHEH (XM_394922,SEQ ID NO:42中所示编码区)、SWI/SNF复合体亚单位 SMARCC2(MOR)(XM_393008,SEQ ID NO:134中所示编码区)、真核翻译 起始因子3亚单位I-样(TIF)(XM_392780,SEQ ID NO:135中所示编码区)和蛋 白磷酸酶PP2A55kDa调节亚单位-样同工型1(XM_394082,SEQ ID NO: 136中所示编码区)。使用公开可用的NCBI Bl2Seq分析程序(可于 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF =blastn&BLAST_PROG_DEF=megaBlast&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_ SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq获得)进行比较，以鉴定与对应于Li 和Om基因共享有限(即小于80%)同一性的100bp的各基因序列(或者，当对于 OM蛋白磷酸酶PP2A55kDa调节亚单位-样同工型1而言不可鉴定小于80% 同一性的100bp序列时，鉴定较小的片段，例如81bp序列)。所鉴定的区域全 部表现出与各蜜蜂序列的同一性为33-76%。表2中鉴定出各基因的各100bp 序列(OM蛋白磷酸酶PP2A 55 kDa调节亚单位-样同工型1为81bp)，具有与 相对应的蜜蜂基因有限同一性，示出各片段与相对应的蜜蜂序列的百分率同 一性。

表2.与蜜蜂(意蜂(Apis mellifera))序列具有有限同一性的Li和Om的100bp基因片段.¹

¹各片段与对应的蜜蜂序列的百分率同一性在圆括号中表示

²C472G置换以消除SacI位点

³识别的有限同源性的81bp序列和T2C置换以消除Xba I位点

⁴A93C置换以消除预测的聚腺苷酸化位点

与各蜜蜂序列的同一性<80%的另外的Li和Om靶序列及用作比较的蜜 蜂的登录号以及各片段显示的与相对应的蜜蜂序列的百分率同一性列于表 3。

表3.与蜜蜂(意蜂)序列具有有限同一性的另外的Li和Om100bp基因片段。¹

基因(意蜂登录号)桉树枝瘿姬小蜂桉干瘿姬小蜂blw(XM_392639) SEQ ID NO:150(53) SEQ ID NO:191(63) CG10881(XM_391934) SEQ ID NO:151(57) SEQ ID NO:192(65) RagA(XM_001119898) SEQ ID NO:152(73)   CG2931(XM_392161) SEQ ID NO:153(60)   CG31524(XM_392392) SEQ ID NO:154(52)   fred(XM_396867) SEQ ID NO:155(66) SEQ ID NO:193(65) CG3590(XM_393961) SEQ ID NO:156(64) SEQ ID NO:194(62) CG5451(XM_393446) SEQ ID NO:157(71) SEQ ID NO:195(67) wls(XM_003250465) SEQ ID NO:158(67)   CG6690(XM_001121155) SEQ ID NO:159(51) SEQ ID NO:196(51) Cic(XM_395004) SEQ ID NO:160(51) SEQ ID NO:197(68) Crc(XM_394892) SEQ ID NO:161(47) SEQ ID NO:198(75) D(XM_624095) SEQ ID NO:162(44) SEQ ID NO:199(69) Dad(XM_396056) SEQ ID NO:163(72) SEQ ID NO:200(51) Dhc64C(XM_003251584) SEQ ID NO:164(63) SEQ ID NO:201(65) Dlg1(XM_393395) SEQ ID NO:165(44) SEQ ID NO:202(51) Dnc(XM_394762) SEQ ID NO:166(60) SEQ ID NO:203(67) Ds(XM_393497) SEQ ID NO:167(46)   E[r](XM_001119900) SEQ ID NO:168(69)   E(z)(XM_003249869) SEQ ID NO:169(50)   Ebi(XM_003251282) SEQ ID NO:170(71) SEQ ID NO:204(65) EcR(NM_001159355) SEQ ID NO:171(53)   Ef1α48D(NM_001014993) SEQ ID NO:172(70) SEQ ID NO:205(75) Ef1gamma(XM_623679) SEQ ID NO:173(68) SEQ ID NO:206(70) eIF-2α(XM_001122232) SEQ ID NO:174(46) SEQ ID NO:207(68) eIF3-S8(XM_623577) SEQ ID NO:175(52) SEQ ID NO:208(46) eIF5(XM_392511) SEQ ID NO:176(68) SEQ ID NO:209(65)

Faf(XM_395447) SEQ ID NO:177(59) SEQ ID NO:210(70) Hel25E(XM_624891) SEQ ID NO:178(70) SEQ ID NO:211(65) HLH106(XM_396866) SEQ ID NO:179(44) SEQ ID NO:212(50) Hr38(NM_001011634) SEQ ID NO:180(51) SEQ ID NO:213(56) La(XM_395300) SEQ ID NO:181(53) SEQ ID NO:214(55) Lin19(XM_394044) SEQ ID NO:182(72) SEQ ID NO:215(64) NAT1(XM_394628) SEQ ID NO:183(49) SEQ ID NO:216(52) Noi(XM_397399) SEQ ID NO:184(66) SEQ ID NO:217(68) Pit(XM_397167)   SEQ ID NO:218(42) Psi(XM_624670 SEQ ID NO:185(51) SEQ ID NO:219(44) Rb(XM_624443) SEQ ID NO:186(54) SEQ ID NO:220(74) Sas(XR_120050) SEQ ID NO:187(51)   SCAR(XM_394398) SEQ ID NO:188(45) SEQ ID NO:221(55) Shi(XM_394399) SEQ ID NO:189(66)   su(w[a])(XM_392191) SEQ ID NO:190(64) SEQ ID NO:222(63)

¹各片段与对应的蜜蜂序列的百分率同一性在圆括号中表示

实施例3

Li和Om靶基因和序列的鉴定

将使用当在果蝇中作为RNAi表达时为致死因子的141个基因的BLAST (NCBI)比较(15,16)用于在丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitiripines)(Nv)中鉴定 127个直向同源序列。将所鉴定的Nv序列进一步用于筛选实施例1中制备的 Om和Li转录组库的致死基因。该筛选分别鉴定了包括至少500个核苷酸的连 续阅读框的来自Om转录组库的39个潜在靶序列和来自Li转录组库的48个潜 在靶标，以及1个包括309个核苷酸的连续开放阅读框的来自Li的潜在靶基因 (SEQ ID NO:76)，或者为各预测的全长基因的至少50%。在一个实例中，将 使用已鉴定为RNAi-致死因子的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)基因 ADV37321(CG18740)(15)的BLAST(NCBI)比较用于鉴定Nv同源基因 XP_001605573。使用BLAST的Nv同源基因XP_001605573来鉴定Li同源基因 部分序列，来自Li454转录组库的SEQ ID NO:104。

使用Nv基因的简并引物通过基于PCR的步骤鉴定三个另外的靶标。该步 骤用于鉴定列于SEQ ID NO:17、23和24的潜在靶标。

使用引物GATACCNTTYAGACCTGTWATTGARCC(SEQ ID NO:143， 基于Nv基因XM_001599205的核苷酸1026-1052)和引物 GGATTTCCAGAWTTKGCRAARTTRTACC(SEQ ID NO:144，基于Nv基因 XM_001599205的核苷酸1628-1655)扩增Li VCE-F2(SEQ ID NO:17)和Om  VCE-F2(SEQ ID NO:23)。将片段测序，然后通过巢式特异性引物二次扩增 以核实序列。

使用引物GGRAYCCACCGCCGAAGATCG(SEQ ID NO:145，基于Nv 基因XM_001602240.2的158-178)和引物 GCGAATTTACCGAAKATGTACATG(SEQ ID NO:146，基于Nv基因 XM_001602240.2的核苷酸1197-1220)扩增Om几丁质合成酶基因(SEQ ID  NO:24)。将片段测序，然后通过巢式特异性引物二次扩增以核实序列：

在Om和Li中鉴定的预期的靶序列分别列于SEQ ID SEQ ID NO:15-26、 45-123和235-244。

将所鉴定的基因分成以下类别：

蛋白质合成和代谢：SEQ ID NO:15、21、47、48、76、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、105、106、120和121。

细胞进程：SEQ ID NO:16-20、22-26、45、46、49、51、52、53、54、 55、58、59、60、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、78、 79、97、98、101、102、112、113、114、115、116、117、122、123、235、 237、238、239、240、242、243和244。

RNA合成和代谢：SEQ ID NO:50、56、57、61、62、63、64、93、94、 95、96、99、100、103、104、107、108、109、110、111、118、119、236 和241。

实施例4

dsRNA沉默构建体的制备

αCOP、Cdh3、VCE-F2沉默构建体(构建体#1)

构建体1的结构示于图1A。将LiαCOP、VCE-F2和Cdh3基因各自的100bp 片段(即，100bp Li基因1、3和2；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3)融合并合成于在被35S CaMV启动子(SEQ ID NO:27)与AtRiboProS40终止 子(SEQ ID NO:32)之间的106bp的第一环序列(环1；SEQ ID NO:13)分隔的 反向重复序列中。将OmαCOP、Cdh3和VCE-F2基因各自的100bp片段(即， 100bp Om基因1-3；SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)融合并合 成于在被AtUBQ1启动子(SEQ ID NO:28)与AtUBQ1终止子(SEQ ID NO:33) 之间的第二环序列(环2；SEQ ID NO:14)分隔的反向重复序列中。将Li基因 1、3和2的所选的100bp(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3)与所 选的Om基因1-3(SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)融合并合成 于在At肌动蛋白7启动子(SEQ ID NO:29)与NOS终止子(SEQ ID NO:34)之间 的正义向上。

构建体1的转录将产生三种mRNA：(1)Li基因1、3和2的3x100bp序列的 发夹RNA(hpRNA)以沉默相对应的Li基因(参见图1B)；(2)Om基因1-3的3x 100bp序列的hpRNA以沉默相对应的Om基因(参见图1B)；和(3)与Om基因 1-3的3x100bp正义序列融合的mRNALi基因1、3和2的3x100bp正义序列。 几丁质合成酶、铁蛋白、JHEH沉默构建体(构建体#2)

构建体2的结构示于图2A。将Li几丁质合成酶、铁蛋白和JHEH基因各自 的100bp片段(即，100bp Li基因4-6；SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID  NO:6)融合并合成于在被35S CaMV启动子(SEQ ID NO:27)与AtDelta TIP终 止子(SEQ ID NO:35)之间的106bp的第一环序列(环1；SEQ ID NO:13)分隔 的反向重复序列中。Om几丁质合成酶、铁蛋白和JHEH基因各自的100bp片 段(即，100bp Om基因4-6；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12) 融合并合成于在被AtGammTI P2启动子(SEQ ID NO:30)与AtGammTI P2终 止子(SEQ ID NO:36)之间的第二环序列(环2；SEQ ID NO:14)分隔的反向重 复序列中。所选的100bp Li基因4-6(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6)与所选的Om基因4-6(SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12)融 合并合成于在sgFIMV启动子(SEQ ID NO:31)与NOS终止子(SEQ ID NO:34) 之间的正义向上。

构建体2的转录将产生三种mRNAs：(1)Li基因4-6的3x100bp序列的发 夹RNA(hpRNA)以沉默相对应的Li基因(参见图2B)；(2)Om基因4-6的3x 100bp序列的hpRNA以沉默相对应的Om基因(参见图2B)；和(3)Li基因4-6的3 x100bp正义序列与Om基因4-6的3x100bp正义序列的mRNA。

将构建体1和2产生的正义mRNA用作细胞质增强沉默信号的模板，产生 被靶幼虫消化的二级siRNA和更长的dsRNA[10]。植物细胞使用某些siRNA 来引发利用具有相同正义序列的mRNA作为模板的RNA依赖性RNA聚合。

实施例5

另外的瘿蜂dsRNA沉默序列

Li RNAi3

通过组合分别来自Li mor-SWI/SNF复合体亚单位SMARCC2(MOR) (SEQ ID NO:104)、Li真核翻译起始因子3亚单位I-样(TIF)(SEQ ID NO:121) 和Li蛋白磷酸酶PP2A 55 kDa调节亚单位-样同工型1(PPR)(SEQ ID NO: 123)的各自来自上述不同功能类别的Li序列以及Li几丁质合成酶内含子来构 建Li dsRNA沉默构建体，从而产生包括SEQ ID NO:133所述序列的构建体。 分别由以下Li基因序列获得SEQ ID NO:133中的各核苷酸：

核苷酸1-100(SEQ ID NO:127)和607-706(SEQ ID NO:127的反向互补 体):SEQ ID NO:104的核苷酸493-592

核苷酸101-200(SEQ ID NO:128)和507-606(SEQ ID NO:128的反向互 补体):SEQ ID NO:121的核苷酸840-939

核苷酸201-300(SEQ ID NO:129)和407-506(SEQ ID NO:129的反向互 补体):SEQ ID NO:123的核苷酸682-781

核苷酸301-406：Li几丁质合成酶内含子(SEQ ID NO:13)

Om RNAi3

通过组合来自Om mor-SWI/SNF复合体亚单位SMARCC2(MOR)(SEQ  ID NO:103)、Om真核翻译起始因子3亚单位I-样(TIF)(SEQ ID NO:120)和 Om蛋白磷酸酶PP2A 55 kDa调节亚单位-样同工型1(PPR)(SEQ ID NO: 122)的序列以及Li几丁质合成酶内含子来构建Om dsRNA沉默构建体，从而 产生包括SEQ ID NO:147中所述序列的构建体。分别由以下Om基因序列获 得SEQ ID NO:147中的各核苷酸：

核苷酸1-100(SEQ ID NO:130)和571-670(SEQ ID NO:130的反向互补 体):SEQ ID NO:103的核苷酸955-1054

核苷酸101-200(SEQ ID NO:131)和471-570(SEQ ID NO:131的反向互 补体):SEQ ID NO:120的核苷酸375-474，具有C472G突变

核苷酸201-281(SEQ ID NO:132)和4390-470(SEQ ID NO:132的反向互 补体):SEQ ID NO:122的核苷酸1247-1327，具有T1332C突变

核苷酸282-389:Li几丁质合成酶内含子，具有Asc1位点(SEQ ID NO: 139)

单基因调控序列

使用包括100bp正义-100bp(大约)环-100bp反义的第一序列(其中“100bp 正义”和“100bp反义”是指来自靶基因的互补序列)和第二100-bp正义扩增序 列的序列的组合来产生单基因调控序列。

Li调控序列

使用基于SEQ ID:104的以下序列作为Li调控序列：

互补-环构建体(100bp正义–106bp环–100bp反义)：

AGAGGCGACGGCAGCAAGAGCGATGAGCCCGAGGATAACGTGACCGAGC  AGACTCATCACATTGTGATTCCGAGCTACTCGGCGTGGTTTGACTACAACT  GGCTCGAACGAGCCGACTAATTGTCTTTAAACGCGCGATATAAGCGCACAA  TGCTCGAGAAACGATAAACTCTATCGCTCTGTCGCGTGCGTGGCATCTTCG  CGCGAGTTGTAGTCAAACCACGCCGAGTAGCTCGGAATCACAATGTGATGA  GTCTGCTCGGTCACGTTATCCTCGGGCTCATCGCTCTTGCTGCCGTCGCCTC 

扩增正义100bp：

AGAGGCGACGGCAGCAAGAGCGATGAGCCCGAGGATAACGTGACCGAGC  AGACTCATCACATTGTGATTCCGAGCTACTCGGCGTGGTTTGACTACAACT (SEQ ID NO：140)

Om的调控序列

使用基于SEQ ID：103的以下序列作为Om调控序列：

互补-环构建体(100bp正义-108bp环-100bp反义)：

ATCGACACTTATCGTTTGAACCCAACAGAGTACATCACGTCAACAGCGTGC  AGGCGAAATTTGGCTGGTGATGTTTGTGCGATAATGCGCGTACATGCTTGC  GCGCGAAACAACGGTAATCAACCGGCAATTATTAATCGTACATGCGCGGCG  CAGGCGCGCCTGCATTATCCCTCGTCATCACCAAAGCGCCACATTATGCTTC  TTCAAGCATGTACGCGCATTATCGCACAAACATCACCAGCCAAATTTCGCCT  GCACGCTGTTGACGTGATGTACTCTGTTGGGTTCAAACGATAAGTGTCGAT  (SEQ ID NO：148)

扩增正义100bp：

ATCGACACTTATCGTTTGAACCCAACAGAGTACATCACGTCAACAGCGTGC  AGGCGAAATTTGGCTGGTGATGTTTGTGCGATAATGCGCGTACATGCTT  (SEQ TD NO：149)

实施例6

RNAi构建体在桉树中的表达

使用基本上在Prakash等(In Vitro Cell Dev Bi0l.-Plant，2009，45：429-434) 中描述的操作手册将dsRNA构建体#1和#2转化入桉树。简单地说，将桉树的 嫩枝在由3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)琼脂组成的穆拉希吉克(Murashige)和斯 科克(Skoog)(MS)基本盐培养基上体外繁殖。所有体外植物材料在25±2℃下 在利用强度为30μEm^-2s^-1的冷白色荧光灯的16-h光周期下培养。将载有包含 nptII基因的二元载体pBI121的根癌农杆菌菌株LBA4404用于转化。在晚对数 生长期收集的细菌培养物压成丸并重悬于MS基本盐培养基。收集来自体外 材料的叶并用作转化实验用外植体。

外植体在补充有0.5mg/l BAP和0.1mg/l NAA的MS再生培养基中预培养 2d。在细菌悬浮液中温和振荡预培养的叶外植体10min并在无菌滤纸上吸干。 然后在预培养条件下在培养基中共培养外植体2d。共培养后，将外植体在 MS液体培养基中洗涤，在无菌滤纸上吸干，并转移至补充有40mg/l卡那霉素 和300mg/l头孢噻肟的包含0.5mg/l BAP和0.1mg/l NAA的MS再生培养基。4-5 周培养后，观察再生并将外植体转移至在纸桥上的液体伸长培养基(liquid  elongation medium)(补充有0.5mg/l BAP、40mg/l卡那霉素和300mg/l头孢噻肟 的MS培养基)。将细长的嫩枝(1.5-2cm)在含0.1mg/l BAP的MS培养基上繁殖。 通过PCR和蛋白质印迹分析来自再生和伸长的嫩叶的叶段。将阳性嫩枝在包 含0.04mg/L BAP的MS培养基上增殖至10个拷贝。从嫩枝切离几许叶并通过 RT-PCR分析。

使用RT-PCR测定dsRNA的表达。使用EPICENTRE MasterPure^TM植物 RNA纯化试剂盒(Cat.#MPR09010)纯化来自50mg新鲜转基因植物组织的总 RNA，接着用Ambion TURBO DNA-free^TMDnase(Cat.#AM1907)进行DNAse 处理。通过RT PCR分析1μl来自各样品的总RNA。利用Platinum Taq DNA聚 合酶试剂盒(Cat.#12574-018)使用Invitrogen SuperScript III一步RT-PCR体系 进行RT PCR。作为对照，将Platinum Taq DNA聚合酶试剂盒(Cat.#12574-018 和#10966-018)用于识别痕量DNA污染。该对照不期望有片段扩增。

为了检测来自构建体#1的RNA表达，准备RT-PCR，将引物对 CGAACGAGCCGACTAATTGTCTT(SEQ ID NO:223)和 CACGCGACAGAGCGATAGAGTTTA(SEQ ID NO:224)用于从存在于 hpRNA Li RNAi 1中的L1中检测85bp的片段(参见图1B)； CAAGAATCCCATCTCTTGCTTGC(SEQ ID NO:225)和 AGCAAGAATCTTCCGTAATCG(SEQ ID NO:226)用于从存在于hpRNA Om  RNAi 1中的终止子AtUBQ1的3’UTR检测91bp的片段(参见图2B)；以及 GAAGATGGTTCTGGGTGCCATAAG(SEQ ID NO:227)和 CTGGAGTAACTGGAACTGCTGAAC(SEQ ID NO:228)用于从转基因P3-T3 表达所产生的线性RNA中检测360bp的片段(参见图1A)。

为了检测来自构建体#2的RNA表达，准备RT-PCR，将引物对 CGAACGAGCCGACTAATTGTCTT(SEQ ID NO:223)和 CACGCGACAGAGCGATAGAGTTTA(SEQ ID NO:224)用于从存在于 hpRNA Li RNAi2中的L1中检测85bp的片段(参见图2B)； GCGCGAAACAACGGTAATCAAC(SEQ ID NO:229)和 CGCTTTGGTGATGACGAGGGATAA(SEQ ID NO:230)用于从存在于 hpRNA Om RNAi2中的L2检测97bp的片段(参见图2B)；以及 GATCTGTTCGAGATACTGCCCAAC(SEQ ID NO:231)和 CTAGATCGACGAGTACCAGCACAA(SEQ ID NO:232)用于从转基因 P5-T3表达所产生的线性RNA中检测348bp的片段(参见图2A)。

RT-PCR结果显示，对于每个构建体的三个独立的转基因事件，40个扩 增循环后检测出来自构建体#1和构建体#2二者的预测片段。这些结果表明， hp RNA和正义mRNA分别由构建体#1和构建体#2各自转录，并且沉默机理活 化。

实施例7

Li和Om dsRNA构建体的生物分析

为了制备瘿瘤组织匀浆，打开瘿瘤并移除所有幼虫。然后将无幼虫的瘿 瘤及周围的叶面用研钵和研杵在液氮中均质化直至获得细粉匀浆。通过将琼 脂(50mg)在100℃下溶解在缓冲液中，冷却至45℃并添加5g瘿瘤组织匀浆并 使总体积达到10ml来制备以琼脂为基本成分的瘿蜂幼虫人工饲料。将等分的 人工饲料(10μl)置于可密封的管中并使其冷却至室温。通过从植物组织表面 切割含有还未出现成年瘿蜂的活的幼虫的瘿瘤的盖(gall lid)以暴露瘿瘤内 部，并使用尖头倾斜的杆轻轻接触幼虫来收集幼虫，从而将瘿蜂幼虫从瘿瘤 中分离。将单个幼虫置于各人工饲料管中。通过在各管中放入一滴水来润湿 管，将管密封并在25℃下培养。

由从转化有构建体1(SEQ ID NO:37)、构建体2(SEQ ID NO:38)、构建 体3(SEQ ID NO:124)的桉树植物或对照植物(即，野生未转化植物或单独转 化有载体而不插入Li或Om核酸或没有可形成siRNA的核酸的植物)制备的瘿 瘤组织制备人工饲料。通过检查与由野生和对照转化的桉树组织制备的人工 饲料上生长的幼虫相比，对在由转化的桉树组织制备的人工饲料上生长的瘿 蜂幼虫发育的影响，来确定Li和Om dsRNA的效果。

实施例8

Li和Om dsRNA构建体的保护效应的试验

用构建体1(SEQ ID NO:37)、构建体2(SEQ ID NO:38)或构建体3转化桉 树植物并建立转基因株系。通过单独转化载体而不插入Li或Om核酸或没有 可形成siRNA的核酸来构建对照株系。

转基因、野生和对照桉树植物在温室中的防虫笼(insect proof cage)中与 成年瘿蜂一起生长。防虫笼保持接种体在内同时防止外部害虫进入笼。接种 蜂后，评价在叶脉中和叶片中瘿瘤的外观。检查植物以确定瘿瘤数量、瘿瘤 大小(最大长度)、瘿瘤中活力幼虫的数量和出现成熟瘿蜂的数量。测试转录 dsRNA的转基因桉树植物的五个独立转化事件。在3次独立的重复中将各转 化事件中的10株株系用成年瘿蜂接种。接种后的1、2、3和4个月记录瘿瘤数 量、瘿瘤大小、每10个瘿瘤中活力幼虫和(通过出口孔)出现的成虫。

示例性预测结果：转录靶向瘿蜂基因的dsRNA的转基因植物与对照相比 显示较少的瘿瘤和/或较小尺寸的瘿瘤，并且瘿瘤不进一步发展。在小瘿瘤中 没有检测出活力幼虫，并且无成蜂出现。转基因植物株系与感染有充分发展 的瘿瘤的对照和野生植物相比抗瘿蜂感染。

已描述许多本发明的实施方案。然而，将理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可进行各种修改。因此，其他实施方案在下述权利要求的范围 内。

在此将说明书中参考的所有专利、专利申请和非专利文献的全部内容引 入于此以作参考。

序列表的备注：以下示出的序列表中的某些序列被认为是一个基因的不 连续片段，如下：

SEQ ID NO:60和235分别是一个基因的不连续的5’和3’片段；

SEQ ID NO:64和236分别是一个基因的不连续的5’和3’片段；

SEQ ID NO:69和237分别是一个基因的不连续的5’和3’片段；

SEQ ID NO:73和238分别是一个基因的不连续的5’和3’片段；

SEQ ID NO:75、239和240分别是一个基因的不连续的5’、中间和3’片段；

SEQ ID NO:107和241分别是一个基因的不连续的5’和3’片段；

SEQ ID NO:115、242和243分别是一个基因的不连续的5’、中间和3’片 段；和

SEQ ID NO:117和244分别是一个基因的不连续的5’和3’片段。

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