野菊多糖在农业上作为抗病诱导子的应用

摘要

本发明公开了一种野菊多糖在农业上作为抗病诱导子的应用。本发明的野菊多糖可制成植物抗病诱导剂，应用于植物土传病害的防治。本发明的抗病诱导剂能显著增加植物的诱导抗病性，降低植物土传病害的发生率。本发明的抗病诱导剂辅以常用的药用赋形剂，可制成水剂、乳剂、粉剂等剂型。

说明书

技术领域

本发明涉及农业上植物土传病害的生物防治领域，尤其涉及野菊多糖在农业上作为抗病诱导子的应 用。

背景技术

近年来，随着农业的迅速发展，植物土传病害也越来越严重，尤其是重茬地，更是产生了严重的植物 病害。植物土传病害对植物的质量与产量产生了很大影响，不利于农业生产。目前，为了控制植物 土传病害，方法主要有使用化学杀菌剂和培育抗性品种等，但都存在一些缺陷与不足。化学杀菌剂易导致 “三R”问题，不但引起环境污染，还危及人类健康。而培育抗性品种，由于抗性品种资源少、所需选育 时间长、耗资大、抗性品种易出现退化等原因而不被看好，所以寻求一种安全、环保、快速的控制植物土 传病害的方法成为当务之急。

植物诱导抗病性是指经过生物或非生物外界因子的诱导，植物体内产生的对有害病原菌的抗性作用 的现象。诱导抗病相较于其它病害防治的方法，具有对环境无污染、使用技术简单、抗病谱广、抗病持续 时间长等优点，将会成为一种具有极大发展潜力的防治植物病害的方法。通过诱导抗性来控制植物病害， 小分子量的诱导物受到特异性的限制对病害的防治效果现实依作物及病害种类不同而不同，目前已报道的 具有诱导抗病性的有葡寡糖、壳寡糖及寡聚半乳糖醛酸等，在生产过程中分子量和聚合度不易控制，且生 产成本高，且不同来源的寡聚糖针对不同的真菌病害具有一定的特异性，影响了其大规模推广应用。因此， 寻找高效、特异性诱导子是寡糖开发的重要内容。

野菊(Chrysanthemum indicum)为菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)、北野菊(C.boreale  Mak.)、岩香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)等的全草，分布在江苏、浙江、山西、云南、 湖南等地，具有较高的药用价值。野菊多糖，从野菊中提取得到，经现代药理学研究证明：野菊多糖具 有防衰老、抗菌消炎、增强免疫力等药理作用。目前，对于野菊多糖的研究中，还未见其作为植物抗病诱 导子，应用于防治植物土传病害的报道。本发明的目的是提供一种野菊多糖可以制成植物抗病诱导剂和生 长促进剂，用于植物土传病害防控和壮苗的新用途。

发明内容

本发明的目的在于提供一种野菊多糖作为抗性诱导子制成植物抗病诱导剂和生长促进剂，用于植物土 传病害防控和壮苗的新用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

野菊多糖可以从野菊中利用现有工艺提取纯化得到：

(1)采集野菊花蕾或野菊茎，并在烘箱中烘干，粉碎，过80-100目筛；

(2)在上述野菊粉末中分别加入野菊粉末质量6-8倍的体积量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小 时，取出，过滤，滤渣水浴加热挥干剩余石油醚，得到脱色后的野菊粉末；

(3)在脱色后的野菊粉末中分别加入野菊粉末质量18-20倍的体积量的纯水，煎煮2-3次，每次2-3 小时，取汁去渣，合并滤液，过滤，得野菊水提物溶液；

(4)减压低温浓缩野菊水提物溶液至比重为1.15-1.25；

(5)在浓缩后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液体积6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃静置过夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm离心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷冻干燥法干燥沉 淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖质量75-80倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙 酸∶正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20-25min，静置，待分层，取下清液，除去上层 正丁醇层及中层杂蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干。

(8)再重复上述(7)步骤5-6次，除去糖蛋白，得纯野菊多糖(硫酸-苯酚法测定纯度为98％)，干 燥后密封，备用。

以上野菊多糖辅以常用的药用赋形剂，制成水剂、粉剂等剂型，喷施与农作物植株上，用于提高植物 抗性，能够诱导植物的系统抗性并促进植物生长，激活植物的防御反应，防治植物土传病害。

上述野菊多糖作为抗病诱导子在农业上的应用，其特征在于，辅以常用的药用赋形剂，可制成水剂、 粉剂等剂型，该抗病诱导剂施用浓度为1-200g/L，优选浓度为1-20g/L。

上述野菊多糖作为抗病诱导子在农业上的应用，其特征在于，通过浸种、灌根和喷施处理，野菊多糖 对不同苗期的植物生长有促进作用，促进壮苗的形成。

上述野菊多糖作为抗病诱导子在农业上的应用，其特征在于激活植物自身的防御反应，增强白术抗白 绢病、根腐病和浙贝母抗灰霉病的抗病力。

上述野菊多糖作为抗病诱导子在农业上的应用，其特征在于，野菊多糖用于增强植物体内防御酶的活 性，防御酶具体是PAL、PPO、POD、CAT，防御酶活性是植物抗病机制的重要生理指标，防御酶的活性提高 与植物的抗病机制的激活密切相关。

上述野菊多糖作为抗病诱导子在农业上的应用，其特征在于，该野菊多糖可以从菊科植物野菊 (Chrysanthemum indicum)包括野菊(Chrysanthemum indicum L.)、北野菊(C.boreale Mak.)或岩香 菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)等的全草包括根茎和花中提取得到。

本发明的有益效果是：本发明选择白术、贝母为样品植物，分别考察野菊多糖对白术的促生长作 用，以及对白术的白绢病和根腐病、贝母的灰霉病的抗性诱导效果。结果显示：野菊多糖生物制剂 能有效地诱导植物的系统抗性，药效试验表明对白术白绢病、根腐病和浙贝母抗灰霉病有显著的防治效果， 显示出良好的市场前景。本发明开辟了野菊多糖作为抗病诱导子提高农作物抗性，防治植物土传病害且促 进壮苗的新用途，并且成本低廉、使用方便、效果明显，在农业上具有很好的开发利用价值，应用空间广 阔。野菊多糖还可以配合其他成分制备无公害农药，达到对植物病害的综合防治效果。同时，还可以进一 步开发野菊多糖的衍生产品。

附图说明

图1：野菊多糖水溶液诱导后白术叶片POD酶的活性变化

图2：野菊多糖水溶液诱导后白术叶片PPO酶的活性变化

图3：野菊多糖水溶液诱导后白术叶片CAT酶的活性变化

图4：野菊多糖水溶液诱导后白术叶片PAL酶的活性变化

以下实验例用于进一步说明本发明

实验例1野菊多糖对植物抗病相关防御酶POD、PPO、CAT和PAL活性的诱导效应

本实验以白术为对象，研究野菊多糖对白术抗病相关防御酶POD、PPO、CAT和PAL活性的影响。

1.1野菊多糖的提取

(1)采集野菊花蕾并在烘箱中烘干，粉碎，过80-100目筛，称取500g备用；

(2)在上述野菊粉末中分别加入野菊粉末质量6-8倍的体积量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小 时，取出，过滤，滤渣水浴加热挥干剩余石油醚，得到脱色后的野菊粉末；

(3)在脱色后的野菊粉末中分别加入野菊粉末质量18-20倍的体积量的纯水，煎煮2-3次，每次2-3 小时，取汁去渣，合并滤液，过滤，得野菊水提物溶液；

(4)减压低温浓缩野菊水提物溶液至比重为1.15-1.25；

(5)在浓缩后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液体积6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃静置过夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm离心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷冻干燥法干燥沉 淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖质量75-80倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙 酸∶正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20-25min，静置，待分层，取下清液，除去上层 正丁醇层及中层杂蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重复上述(7)步骤8-9次，除去糖蛋白， 得纯野菊多糖13.56g，硫酸-苯酚法测定纯度为98％。

(8)野菊多糖水溶液的配制：取上述野菊多糖适量，配制成20g/L的水溶液，密封贮藏，备用。

1.2野菊多糖对白术抗病相关防御酶POD、PPO、CAT和PAL活性测定

1.2.1材料

罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，从种植区发生的白绢病白术植株上培养、分离并鉴 定得到；野菊多糖水溶液，浓度为20.0g/L。

1.2.2孢子悬浮液的制备

罗氏白绢小菌核菌于PDA培养基上培养7d后，用无菌水冲洗，一层灭菌过的滤纸过滤后，经血球计 数板计数，配成浓度为每毫升1×10⁵个的孢子悬浮液。

1.2.3实验方法

将白术种子浸入水中浸泡搅拌，漂洗剔除病、劣和杂粒，搓洗掉种子表面的污物，用75％的乙醇消毒， 无菌水冲洗干净，湿纱布包好种子，在20～35℃黑暗下催芽。当种子露白后，将被抑制而未发芽的病、劣 种子剔除，将发芽较好的种子播种，在气温20～35℃，最大自然光强750001x的室外条件下用15cm*45cm 白色长方形大花盆培养白术幼苗，每盆30株，营养基质用泥炭土∶珍珠岩=3∶1混合均匀。待白术幼苗长 到4-6叶期，用处理好的罗氏白绢小菌核菌的孢子悬浮液灌根处理，24h后再喷洒野菊多糖水溶液，对照 组喷洒等量自来水，溶液均匀喷洒于白术叶片正、背面，以形成可见的液珠为度，每一组处理1盆。分别 采集接菌前、接菌一天后样品，再于喷药后1d、3d、5d、7d、9d随机选取一定量的叶片，叶片剪碎并充 分混匀后平行取3份进行酶活性测定。

1.2.4酶液提取方法

称取1g样品，放入预冷的研钵中，加入5mL提取液(0.1mol/L pH8.8硼酸钠缓冲液，内含5mmol/L 巯基乙醇，1mmol/L EDTANa₂)，0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，冰浴研成匀浆后，转入离心管，在4℃下振荡 2min后以12000r/min离心15min。上清液即为POD、PPO、CAT和PAL酶粗提液，置于-20℃冰箱中保存 备用。

1.2.5POD酶的活性测定方法

采用愈创木酚法。配制酶的反应体系中，包括2.9mL(0.05mol/L，pH5.5)磷酸缓冲液、1.0mL2％H₂0₂、 1.0mL0.05mol/L愈创木酚溶液和0.1mL酶粗提液。以煮过失活的酶液为对照，于470nm下测定吸光度。 以OD₄₇₀值变化0.01为1个过氧化物酶活力单位，并按每分钟每克鲜重换算成酶比活力。

POD活性(U)=ΔOD₄₇₀×V_T/W_F×t×V₁

1.2.6PPO酶的活性测定方法

用比色法测定。取0.05mL酶粗提液加入比色杯中，与2.95mL含0.02mol/L邻苯二酚的磷酸缓冲液 (0.1mol/L，pH6.8)混合。于30℃水浴中反应2min后，记录398nm处的光密度值，以不加酶粗提液而加 相同体积提取缓冲液为空白对照。以每分钟OD₃₉₈值变化0.01为1个酶活性单位U，计算酶比活性U/g。

1.2.7CAT酶的活性测定方法

采用紫外分光光度计法。在玻璃比色杯皿中依次加入3mL CAT反应液(0.01mol·L^-1磷酸缓冲液，pH 7.0，内含0.035mL H₂0₂)、0.1mL酶粗提液，以不加酶粗提液而加相同体积提取缓冲液为空白对照。迅速 颠倒混匀后立即比色，每隔30s读取A₂₄₀值，共3min，以A₂₄₀每分钟下降0.1为1U。

CAT活性(U)=△OD₂₄₀×V_T/0.1×W_F×t×V₁

1.2.8PAL酶的活性测定方法

反应体系中包括2mL pH8.8的硼酸缓冲液，0.8mL0.02mol·L^-1L-苯丙氨酸，0.2mL酶粗提液，对照 不加酶粗提液，改加0.2mL提取缓冲液。30℃下水浴30min后，加入0.2mL6mol·L^-1盐酸终止反应，于 290nm波长下测OD值。酶活单位定义为OD₂₉₀改变0.01为比活性单位U。用U·mg^-1FW·h^-1表示酶活力。

酶的比活力(0.01ΔA/mg·FW·h)=ΔA×D/0.01×W×T，其中，ΔA为反应时间内光密度的变化，W 为样品鲜重，T为反应时间，D为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数。

1.2.9四种酶活性测定的结果

图1、图2、图3和图4结果显示：野菊多糖水溶液诱导后的白术叶片的PAL、CAT、POD、PPO四种酶 的活性在施药后5天均呈上升趋势，且较对照组水平都有明显提高。

结论：PAL、CAT、POD、PPO这四种酶与植物抗病性存在着密切的关系，结合结果显示，野菊多糖能增 加白术植株的与抗性相关酶的活性，增强了抗病性，且效果明显。

实验例2野菊多糖对白术抗白绢病的诱导效应

2.1实验方法

将白术种子浸入水中浸泡搅拌，漂洗剔除病、劣和杂粒，搓洗掉种子表面的污物，用75％的乙醇消毒， 无菌水冲洗干净，湿纱布包好种子，在20～35℃黑暗下催芽。当种子露白后，将被抑制而未发芽的病、劣 种子剔除，将发芽较好的种子播种，在气温20～35℃，最大自然光强75000lx的室外条件下用15cm*45cm 白色长方形大花盆培养白术幼苗，每盆30株，营养基质用泥炭土∶珍珠岩=3∶1混合均匀。待白术幼苗长 到4-6叶期，用实验例1处理好的罗氏白绢小菌核菌的孢子悬浮液灌根处理，24h后再喷洒实验例1的野 菊多糖水溶液，对照组喷洒等量自来水，溶液均匀喷洒于白术叶片正、背面，以形成可见的液珠为度。每 个处理3个重复，每重复30株植物。观察记录接种了罗氏白绢小菌核菌后的白术病害的严重程度，病害 严重度根据接种罗氏白绢小菌核菌50天后的白术叶片黄化萎蔫程度进行区分，按0-4级严重度分级，标 准如下：

0级：无叶片黄化萎蔫，植株健康；

1级：0.1％-25％的叶片黄化萎蔫；

2级：25.1％-50％的叶片黄化萎蔫；

3级：50.1％-75％的叶片黄化萎蔫；

4级：75.1％以上的叶片黄化萎蔫。

病情指数与相对防效按以下公式计算：

病情指数=100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)

相对防效(％)=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

2.2实验结果

表1野菊多糖作用于白术后的病情指数

结果显示：野菊多糖水溶液能显著降低白术的病情指数，其相对防效达到49.98％

实验例3野菊多糖对白术抗根腐病的诱导效应

3.1实验方法

将白术种子浸入水中浸泡搅拌，漂洗剔除病、劣和杂粒，搓洗掉种子表面的污物，用75％的乙醇消毒， 无菌水冲洗干净，湿纱布包好种子，在20～35℃黑暗下催芽。当种子露白后，将被抑制而未发芽的病、劣 种子剔除，将发芽较好的种子播种，在气温20～35℃，最大自然光强75000lx的室外条件下用15cm*45cm 白色长方形大花盆培养白术幼苗，每盆30株，营养基质用泥炭土∶珍珠岩=3∶1混合均匀。待白术幼苗长 到4-6叶期，将从种植区发生的根腐病白术植株上培养分离得到的尖孢镰刀菌按实验例1孢子悬浮液的制 备方法制备孢子悬浮液，并用处理好的尖孢镰刀菌的孢子悬浮液灌根处理，24h后再喷洒实验例1的野 菊多糖水溶液，对照组喷洒等量自来水，溶液均匀喷洒于白术叶片正、背面，以形成可见的液珠为度。每 个处理3个重复，每重复30株植物。观察记录接种了尖孢镰刀菌后的白术病害的严重程度，病害严重度 根据接种尖孢镰刀菌50天后的白术叶片枯萎程度进行区分，按0-4级严重度分级，标准如下：

0级：无叶片枯萎，植株健康；

1级：0.1％-25％的叶片枯萎；

2级：25.1％-50％的叶片枯萎；

3级：50.1％-75％的叶片枯萎；

4级：75.1％以上的叶片枯萎。

病情指数与相对防效按以下公式计算：

病情指数=100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)

相对防效(％)=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

3.2实验结果

表2野菊多糖作用于白术后的病情指数

结果显示：野菊多糖水溶液能显著降低白术的病情指数，其相对防效达到48.13％

实验例4野菊多糖对浙贝母抗灰霉病的诱导效应

4.1实验方法

在种子田里选取质优的浙贝母鳞茎，用50％的多菌灵10g加2.5kg水混匀浸泡10分钟左右，稍晾干 后播种在装有灭菌土的15cm×45cm的花盆中，每盆3株。待浙贝母幼苗长到3-5叶期，将从种植区发生 的灰霉病浙贝母植株上培养分离得到的椭圆葡萄孢按实验例1孢子悬浮液的制备方法制备孢子悬浮液，并 用处理好的椭圆葡萄孢的孢子悬浮液灌根处理，24h后再喷洒实验例1的野菊多糖水溶液，对照组喷洒 等量自来水，溶液均匀喷洒于浙贝母叶片正、背面，以形成可见的液珠为度。每个处理3个重复，每重复 3株植物。观察记录接种了椭圆葡萄孢后的浙贝母病害的严重程度，病害严重度根据接种椭圆葡萄孢50 天后的浙贝母叶片出现病斑程度进行区分，按0-4级严重度分级，标准如下：

0级：无病斑，植株健康；

1级：0.1％-25％的叶片出现病斑；

2级：25.1％-50％的叶片出现病斑；

3级：50.1％-75％的叶片出现病斑；

4级：75.1％以上的叶片出现病斑。

病情指数与相对防效按以下公式计算：

病情指数=100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)

相对防效(％)=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

4.2实验结果

表3野菊多糖作用于浙贝母后的病情指数

结果显示：野菊多糖水溶液能显著降低浙贝母的病情指数，其相对防效达到49.16％

实验例5野菊多糖对植物的促生长作用

本实验以白术为对象，使用对叶喷施处理，以此观察野菊多糖对白术生长的影响。

5.1实验方法

将白术种子浸入水中浸泡搅拌，漂洗剔除病、劣和杂粒，搓洗掉种子表面的污物，用75％的乙醇消毒， 无菌水冲洗干净，湿纱布包好种子，在20～35℃黑暗下催芽。当种子露白后，将被抑制而未发芽的病、劣 种子剔除，将发芽较好的种子播种，在气温20～35℃，最大自然光强75000lx的室外条件下用15cm*45cm 白色长方形大花盆培养白术幼苗，每盆30株，营养基质用泥炭土∶珍珠岩=3∶1混合均匀。待白术幼苗长 出第一片叶子时，用实验例1的野菊多糖水溶液喷施叶面，之后每长出一片叶子喷施一次，共喷施三次， 末次喷施三天后测生长指标。同时设对照组，喷施等量的清水，处理组与对照组均设3个重复，每重复1 盆共30株。

5.2实验结果

结果表明：白术幼苗株高增加17.21％，茎粗增加19.56％。

下述实施例均能实现以上实验例的效果

具体实施方式

实施例1：野菊多糖的提取方法

(1)采集野菊茎并在烘箱中烘干，粉碎，过100目筛，称取1kg备用；

(2)在上述野菊粉末中分别加入野菊粉末质量6-8倍的体积量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小 时，取出，过滤，滤渣水浴加热挥干剩余石油醚，得到脱色后的野菊粉末；

(3)在脱色后的野菊粉末中分别加入野菊粉末质量18-20倍的体积量的纯水，煎煮2-3次，每次2-3 小时，取汁去渣，合并滤液，过滤，得野菊水提物溶液；

(4)减压低温浓缩野菊水提物溶液至比重为1.15-1.25；

(5)在浓缩后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液体积6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃静置过夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm离心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷冻干燥法干燥沉 淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖质量75倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙酸∶ 正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20min，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层 及中层杂蛋白，加2NNa0H至中性，蒸干，再重复上述(7)步骤8次，除糖蛋白，得纯野菊多 糖26.76g，经采用硫酸-苯酚法测定野菊多糖的纯度为98％，备用。

实施例2：水剂的制备与应用

取实施例1中提取得到的野菊多糖，取野菊多糖适量，加入硅油适量，加水配制成100g/L的水 剂，摇匀，密封储藏。在白术生长的苗期喷施与叶面上，常规管理，但不施用其他农药，结果与对照组比 较，能显著降低白术的病情指数，并具有显著的壮苗作用。

实施例3：粉剂的制备与应用

按实施例1法制备得到野菊多糖(纯度为98％)，干燥，按照野菊多糖∶硅藻土质量比为10∶∶1的比 例加入干燥的硅藻土搅拌混匀，备用。临用时，将该诱导剂按照每亩5kg的量加入普通有机肥中混匀， 在贝母小苗载入大田时，作为基肥施入土壤，常规栽培管理，但不施用其他农药，结果与对照组比较， 能显著降低贝母的病情指数

实施例4：水剂的制备与应用

按实施例1法制备得到野菊多糖(纯度为98％)，干燥，加蒸馏水配置成含野菊多糖为1g/L的溶液， 摇匀，贮藏备用。在贝母生长的苗期，喷施与叶面上，常规管理，但不施用其他农药，结果与对照组比较， 能显著降低贝母的病情指数。

实施例5：水乳剂的制备与应用

取实施例1中提取得到的野菊多糖，按如下比例配制成含1g/L野菊多糖的水乳剂，作为植物抗病诱 导剂。在白术生长的苗期喷施与叶面上，常规管理，但不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低 白术的病情指数，并具有显著的壮苗作用。该诱导剂的配制成分与比例如下：

实施例6：水剂的制备与应用

取实施例1中提取得到的野菊多糖，取野菊多糖适量，加水配制成100g/L的水剂，摇匀，密封储藏。 取一年生白术苗置于其中做浸泡处理后，栽入大田，常规管理，但不施用其他农药，结果与对照组比较， 能显著降低白术的病情指数，并具有显著的壮苗作用。

实施例7：水剂的制备与应用

取实施例1中提取得到的野菊多糖，取野菊多糖适量，加水配制成10g/L的水剂，摇匀，密封储藏。 取一年生白术栽入大田，根灌处理后常规管理，但不施用其他农药，结果与对照组比较，能显著降低白术 的病情指数，并具有显著的壮苗作用。