一种籼粳杂交水稻花药培养方法

摘要

本发明是一种高效的籼粳杂交水稻花药培养方法。包括取样、鉴定小孢子发育时期、低温预处理、幼穗灭菌、花药接种、在25±2℃下进行静止暗培养至胚性愈伤组织直径达2-3mm，之后经过再分化阶段形成完整的单倍体或双单倍体再生植株。双单倍体既是良好的育种材料，可直接用于新品种的选育或品种改良，大大缩短育种年限，提高选择效率，也是进行AFLP、RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制和进行物种进化、遗传分析、植物基因克隆筛选和基因工程育种等研究的理想材料。

说明书

技术领域

本发明涉及一种籼粳杂交水稻花药培养方法，主要用于籼粳杂交水稻育种、分子生物学研究和基因工程研究。

背景技术

水稻花药培养技术在水稻育种中具有重要作用。该技术是将发育到一定阶段的花药接种至人工培养基上，在一定的光照温度条件下进行离体培养，诱导小孢子形成愈伤组织进而分化出完整的单倍体再生植株。之后经过人工加倍或自然加倍产生双单倍体植株（DH植株）。它们在遗传上具有绝对的纯合性。在水稻育种实践中，利用花药培养可以快速获得纯系，大大缩短育种周期，提高选择效率，降低育种成本。在遗传育种理论研究中，通过花药培养获得的DH群体是进行AFLP、RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制研究的良好材料，也是进行物种进化研究、遗传分析和植物基因克隆筛选的理想材料。此外，从一些特殊材料中诱导获得的单倍体具有特异的染色体组成，如单体、三体和易位系等，譬如对远缘杂交种F1进行花药培养可以得到异源附加系、代换系和异位系等，这些材料都是非常好的染色体工程材料。

在籼粳杂交水稻育种研究方面，花药培养技术亦有重要的应用。籼粳杂交易产生超亲变异，蕴含着巨大的遗传潜力，早已被水稻育种家关注，是我国选育超高产杂交水稻的有效技术路线之一。但籼粳杂交属于远缘杂交范畴，存在着不亲和、结实率低、杂种后代高度不育等问题，因此籼粳杂种优势利用进展缓慢，仍是当代水稻育种面临的难题。花药培养技术可以克服远缘杂交的生殖障碍，快速稳定籼粳杂交的优良性状和超亲优势，解决水稻籼粳亚种间杂种优势难以直接利用的问题。同时，利用籼粳杂交水稻花药培养技术可以快速有效地筛选恢复系、提纯三系不育系。然而，目前有关籼粳杂交稻的花药培养研究较少，且愈伤组织诱导率低（仅为30%左右），绿苗分化率低（仅为20%左右）。这严重阻碍着花培技术在籼粳杂交水稻育种实践中的应用。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种高效的籼粳杂交水稻花药培养方法，有效地分离花药、进行花药离体培养获得再生植株。该方法可用于籼粳杂交水稻花药培养获得单倍体、双单倍体等育种材料，也为其他作物的花药培养提供参考。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种籼粳杂交水稻花药培养方法包括以下步骤：将小孢子发育处于单核靠边期的籼粳杂交水稻花药从花器中分离出来，之后在适宜的生长条件下进行花药离体培养，获得再生植株。具体步骤如下：

（1） 取样与预处理  

于籼粳杂交水稻孕穗期，选取叶枕距为8-12cm的健壮植株，取幼穗，保留两片叶和叶鞘。用流水冲洗幼穗，70%酒精进行表面消毒，然后用湿纱布包裹幼穗，放入保鲜袋中，最后置于4-6℃低温预处理。

（2）外植体灭菌

取出预处理后的幼穗，先用70%酒精进行表面消毒，之后剥去外鞘，幼穗用20%次氯酸钠灭菌20分钟，最后用无菌水冲洗干净。

（3）接种与胚性愈伤组织诱导

在无菌条件下，将花药接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，在25±2℃的温度范围内暗培养，直至胚性愈伤组织直径达2-3毫米。

（4）分化培养与植株再生

将直径达2-3毫米的胚性愈伤组织转接入分化培养基上，在25±2℃的温度范围内和12小时7500lx光照环境下进行分化培养，直至形成株高9-11厘米、根叶芽俱全的再生植株。

（5）驯化与移栽

打开具有完整再生植株的培养瓶瓶盖，加入适量自来水，置于室温下炼苗、驯化2-3天。之后洗去根部残留的培养基，将再生植株移栽入大田，再进行4-6天缓苗。

（6）染色体鉴定 

参照杨旭和代西梅《简易压片法观察水稻有丝分裂和减数分裂行为》（《安徽农业科学》，2009，37（14）：6325-6327）的方法对再生植株进行体细胞染色体计数，确定其倍性。

（7）田间鉴定 

通过对花培植株当代（H₁）的田间观察，从植株的株高、株型、叶型、花器、育性特征可以区别鉴定出单倍体、二倍体和多倍体。其中单倍体通过留宿根进行秋水仙素处理可加倍形成二倍体。而对其中的二倍体通过花培植株二代（H2）进行株系田间鉴定，株系内表现一致的则为双单倍体，反之不是。

本发明的积极效果：

（1） 利用本发明进行籼粳杂交水稻花药培养两步即可成苗，即经过花药接种诱导愈伤和愈伤分化成苗两个步骤可获得单倍体和双单倍体再生植株。本发明显著提高了籼粳杂交水稻的花培效率，胚性愈伤组织诱导率为82.1%，胚性愈伤组织分化率为86.7%。双单倍体可作为育种材料，也可用于遗传分析、遗传图谱绘制等理论研究。

（2）利用本发明方法可快速获得纯系和突变体，在水稻育种中具有重要意义。不仅可以，提高育种效率，而且可以提供新的种质资源，使新品种在抗性和品质等方面得到显著提高。第一，传统育种通过自交来获得纯系作为育种材料，需要6-7年甚至更长的时间才能实现，而应用本发明获得的双单倍体中性状优良的个体当代即可直接作为育种材料用于新品种的培育，大大缩短育种年限。第二，花粉小孢子基因型丰富、发育同步、群体数量大，因此通过花药培养可以获得基因型十分丰富的纯合的育种材料，显隐性基因可以在当代完全表达，可以显著提高选择效率。第四、提供了一种快速有效的恢复系筛选和三系不育系提纯复壮的途径。第三，与传统育种相比，花药培养或将其与其他育种手段如辐射诱变育种等相结合更易发生基因突变，因此它是种质创新的有效途径之一，为育种开辟新种质。最后，利用本发明获得的双单倍体是绝对纯合的，因此是进行分子辅助育种和基因工程育种的理想材料。

（3）利用本发明方法可以有效解决水稻籼粳亚种间杂种优势难以直接利用的问题。在水稻育种中，籼粳杂交易产生超亲变异，蕴含着巨大的遗传潜力，早已被水稻育种家关注，是我国选育超高产杂交水稻的有效技术路线之一。但籼粳杂交属于远缘杂交范畴，存在着结实率低、杂种后代高度不育等问题，因此籼粳杂种优势利用进展缓慢，仍是当代水稻育种面临的难题。花药培养技术可以克服远缘杂交的生殖障碍，快速稳定籼粳杂交的优良性状和超亲优势，解决水稻籼粳亚种间杂种优势难以直接利用的问题。同时，利用籼粳杂交水稻花药培养技术可以快速有效地筛选恢复系、提纯三系不育系。

（4）利用本发明方法获得的双单倍体在遗传上是纯合的，可避免二倍体由于来自双亲的两条染色体在DNA碱基序列的细微差异，从而大大提高基因定位标图的准确性；也是进行AFLP、RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制研究以及物种进化研究、遗传分析和植物基因克隆筛选等的理想材料。

（5）本发明是以对籼粳杂交水稻花药培养影响因素（包括基因型、小孢子发育时期、温度处理和培养基成分等）的系统研究为工作基础。花粉小孢子具有单倍性、结构简单、基因型丰富、发育同步和群体数量大等优点，因此对花药进行离体培养可以快速获得多种基因型的单倍体或双单倍体材料，且与传统育种相比更易发生基因突变，扩大水稻基因池，提供新种质。

总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性强、方法较简便，易于操作和实际应用，在育种实践和理论研究方面都具有显著意义。

附图说明

图1为本发明实施例籼粳杂交水稻花药培养的流程图。

图2为本发明实施例籼粳杂交水稻发育处于单核靠边期的小孢子示意图。

图3为本发明实施例籼粳杂交水稻的部分染色体计数示意图，图中n = 12 (1000 ×)。

图4为本发明实施例籼粳杂交水稻的另一部分的染色体计数示意图，图中2n=24 (1000 ×)。

图5为本发明实施例籼粳杂交水稻花药离体发育过程和植株再生过程示意图，供实审审查员参考。

图中：A、接种后置于暗室培养；B、胚性愈伤组织；C、在光照条件下对胚性愈伤组织进行分化培养；D、分化培养5-7天后，形成肉眼可见的芽点；E、培养25天后形成的完整再生植株；F、室内常温炼苗、驯化。 

图6为本发明实施例籼粳杂交水稻移栽定植后的再生植株示意图，供实审审查员参考。

具体实施方式

单倍体及双单倍体在作物遗传理论研究和育种实践中均具有重要意义和广阔的应用前景。单倍体材料的获得途径包括自然发生及人工诱导。前者发生频率极低，后者以花药培养应用最为广泛。花药培养是以从花器中分离出的花药作为外植体进行离体培养，诱导小孢子细胞进行离体雄核发育，形成胚性愈伤组织，之后经过再分化获得单倍体或双单倍体的一种方法。在籼粳杂交水稻育种中利用花药培养技术可以快速获得多种基因型的籼粳杂交水稻的单倍体或双单倍体育种材料，也更易发生基因突变，获得新种质。我们应用本发明的方法，获得了单倍体和双单倍体水稻育种材料。

本实施例即以由中国水稻研究所和浙江农科种业有限公司联合选育的籼粳杂交水稻‘春优84’为供试材料，在所述供试材料基础上采用本发明方法获取了籼粳杂交水稻‘春优84’的单倍体和双单倍体。具体实施过程由以下步骤组成：取样与预处理、外植体灭菌、接种与胚性愈伤组织诱导、分化培养与植株再生、驯化与移栽；然后本发明实施例获得的产物可通过染色体鉴定、田间鉴定来确定并证明其实施效果。

所述取样与预处理进行以下步骤：

（1）在孕穗期，于晴天上午9：00～10：00或傍晚，选取叶枕距为8-12cm的健壮植株幼穗（花药伸长至1/2-2/3颖花），保留上部两片叶和鞘。采用显微镜镜检的方法鉴定小孢子发育时期。即将花药从颖花中剥出，置于载玻片上，滴蒸馏水浸没花药，用镊子轻轧花药使小孢子游离出来，去除残留的花药组织，盖上盖玻片，在OLYMPUS显微镜下鉴定小孢子发育时期并拍照。选取小孢子发育处于单核靠边期（图 2）的幼穗用于花药培养。

将幼穗冲洗干净，用70%酒精表面消毒，之后用湿纱布包裹，放置于保鲜袋内，在4-6 ℃下低温预处理7d。 

所述外植体灭菌进行以下步骤：

取出预处理后的幼穗，置于超净工作台上，在无菌条件下先用70%酒精进行表面消毒，之后剥去外鞘，然后用20%次氯酸钠溶液灭菌20 min，最后用无菌水冲洗4次，每次30～60s。

所述接种与胚性愈伤组织诱导进行以下步骤：

在无菌条件下，采用剪颖抖花药法，将花药接种于配方为M8+15mg/L PAA+3 mg/L NAA+3mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+5%蔗糖+0.8%琼脂，pH值为5.8的胚性愈伤组织诱导培养基上。即在保证花药完整的情况下将颖花从幼穗上剪下，然后用镊子夹起颖花顶端，敲击培养瓶口处，将花药抖落入直径为65mm、装有愈伤诱导培养基的培养瓶内。之后将其置于25±2℃的温度下暗培养，直至诱导获得的胚性愈伤组织直径达2-3mm。每瓶接种花药150个，共计接种50瓶。共计获得胚性愈伤组织6159块，胚性愈伤组织诱导率为82.1%。胚性愈伤组织诱导率 = 形成胚性愈伤组织的花药数 / 接种花药总数×100%。

所述分化培养与植株再生进行以下步骤：

将直径达2-3mm的胚性愈伤组织转接入配方为MS+1.5 NAA+4mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂、pH值为5.8的分化培养基上，于25±2℃、1000lx、12h光照条件下进行分化培养，直至形成株高达10cm左右的完整再生植株。共获得再生植株5340丛，绿苗分化率为86.7%。绿苗分化率 = 有绿苗分化的胚性愈伤组织数 / 胚性愈伤组织总数×100%。

所述驯化与移栽进行以下步骤：

打开具有完整再生植株的培养瓶盖子，加入适量自来水，置于温室下炼苗、驯化3d左右。之后除去根部残留的培养基，将再生植株移栽入大田。如遇恶劣天气如高温烈日或低温天气，则搭遮阳网遮阳或塑料膜保温，4-6天缓苗后，移除即可，之后花培植株健壮生长。

所述染色体鉴定进行以下步骤：

参照杨旭和代西梅《简易压片法观察水稻有丝分裂和减数分裂行为》（《安徽农业科学》，2009，37（14）：6325-6327）的方法对再生植株进行体细胞染色体计数，确定其倍性（图5-6）。随机抽取100株再生植株进行染色体计数，结果显示其中17株单倍体，83株二倍体。

所述田间鉴定进行以下步骤：

通过对花培植株当代（H₁）的田间观察，从植株的株高、株型、叶型、花器、育性等特征可以区别鉴定出单倍体、二倍体和多倍体等。其中单倍体通过留宿根进行秋水仙素处理可加倍形成二倍体。而对其中的二倍体通过花培植株二代（H2）进行株系田间鉴定，株系内表现一致的则为双单倍体，反之不是。对花培植株当代（H₁）随机抽查100株，发现其中9株单倍体，88株二倍体，3株其他倍性植株。88株二倍体中65株为双单倍体。

本发明实施例采用籼粳杂交水稻‘春优84’经过5次重复实验，其中胚性愈伤组织诱导率在68.9%~ 85.3%之间，双单倍体占绿苗分化率为80.6%~ 90.2%之间，大幅度提高了籼粳杂交水稻的培养成功率和效率。

本发明实施例所述培养方法适用于各种籼粳杂交水稻的花药培养方法，例如：浙优18、春优618、甬优9、甬优12、甬优15、甬优17、甬优538、甬优1540、甬优 1640和甬优2640等。

应用本发明获得的双单倍体，其中性状优良的可直接作为育种材料，进行新品种培育或改良品种，而采用传统育种手段需要自交6～7代才能够获得纯系，因此利用本发明获得双单倍体能够大大缩短育种年限。本发明也提供了一种快速有效的恢复系筛选和三系不育系提纯复壮的途径。同时，因为双单倍体具有纯合性，显隐性基因当代就可以得到完全表达，所以可以提高目标性状的选择效率。此外，双单倍体群体是稳定纯合的群体，因此该群体是进行AFLP、RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制、物种进化、遗传分析、植物基因克隆筛选和基因工程育种等研究的优良材料，可大大提高基因定位标图的准确性，同时又可以稳定保存以进行长时间连续研究。