用于预防或治疗糖尿病周围神经病变的包含草药组合提取物的组合物

摘要

本发明公开了用于预防和治疗糖尿病周围神经病变的药物组合物和健康功能食品，包含3.5:1(w/w)山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物。与来自单独草药或其他重量比的草药混合物的提取物相比，所述混合的草药提取物具有协同提高神经生长因子的体内水平的能力，有效防止神经细胞凋亡和促进神经再生。因此，其能用于预防和治疗糖尿病周围神经病变的药物组合物和健康功能食品。

说明书

技术领域

本发明涉及用于糖尿病周围神经病变的预防和治疗的组合物，其包含3.5:1 (w/w)山药(Dioscorea Rhizoma)：穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica)的混合物的草药 提取物。

感谢

本研究得到了韩国知识经济部资助的战略R&D企划办公室(Office of  Strategic R&D Planning)(OSP)全球领先技术项目的支持(No.10039303)。

背景技术

糖尿病发病率正在世界范围内迅速增长。世界卫生组织评估在2008年约 1.8亿人患有糖尿病，预期糖尿病患者数量到2030年增倍。因此，与糖尿病相 关的财政和社会成本已经提升了，并且糖尿病并发症引起的死亡率已经上升。 然而，通过严格控制血糖水平可以推迟糖尿病的发病或发展，由此重要的是通 过生活方式调整和适当治疗以保持血糖正常。

糖尿病是发达国家中神经病变的主要已知原因。糖尿病周围神经病变是用 来描述由糖尿病引起的周围神经系统失调的症状的术语。它是糖尿病遭遇的最 常见的并发症。

糖尿病周围神经病变使得糖尿病患者的生活质量下降，并且是患者死亡的 最大原因。糖尿病患者中糖尿病周围神经病变的发病率随着患者年龄和糖尿病 病程增加。糖尿病周围神经病变在1型和2型两种类型的糖尿病患者中都有发 生，且在2型糖尿病患者中的发病率(32.1%)高于在1型糖尿病患者中(22.7%) (Primary Care Diabetes Volume1,Issue3,September2007,Pages129-134, Diagnosis of diabetic peripheral neuropathy among patients with type1and type2 diabetes in France,Italy,Spain,and the United Kingdom)。

约10%的糖尿病患者自诉持续的疼痛，疼痛可能是自发的，或者可能是刺 激引起的。疼痛可能加剧或者变得不可治愈。糖尿病周围神经病变疼痛在夜间 尤其严重，且主要被描述为灼烧不适、刺痛、酸痛、拉紧的感觉等。此外，在 腿部比在手部更加经常感觉到糖尿病周围神经病变疼痛。通常，严重疼痛可导 致体重减轻或抑郁(Pain Medicine,Volume8Number S22007,Diabetic  Peripheral Neuropathic Pain:Recognition and Management)。

由肌肉力量测试，通过测定触觉、温度感觉、振动感觉、外周皮肤的血液 流速和神经传导来诊断糖尿病周围神经病变。当前，通过控制血糖水平、病因 治疗和对症治疗来治疗糖尿病周围神经病变。由于高血糖与神经病变发展之间 的关系已得到良好的确认，并且已由许多研究显示，详述了没有保持其血糖控 制的糖尿病患者中糖尿病周围神经病变的高发病率，所以，控制血糖被认为是 预防/治疗糖尿病周围神经病变的主要方法(N Engl J Med1993;329:977-86,The  effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of  long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus)。

糖尿病神经病变的病因学疗法中有代表性的是α类脂酸、醛糖还原酶抑制 剂和γ亚油酸。α类脂酸(硫辛酸)，是抗氧化剂，降低导致神经细胞死亡的高 血糖引起的氧化应激，从而阻止糖尿病神经病变的病因。通过发挥防止葡萄糖 进入神经细胞中的多元醇通路的作用，醛糖还原酶抑制剂能够抑制导致神经细 胞损伤的山梨醇聚集，以阻断糖尿病神经病变的发展。然而，这些中的大多数 的研发由于副作用和功效不足而中途停止。当前，仅依帕司他在日本使用。γ 亚油酸是神经膜磷脂的成分和前列腺素E的成分，其在神经细胞的血流平衡中 起到重要作用，发现γ亚油酸改善糖尿病神经病变的某些症状(BMJ.2007Jul 14;335(7610):87.Epub2007Jun11,Review.Effects of treatments for symptoms of  painful diabetic neuropathy:systematic review)。

用于缓解糖尿病神经病变疼痛的对症疗法包括三环类抗抑郁药、抗痉挛 药、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂和局部辣椒素。三环类抗抑郁药(TCA)作用 于抑制5-羟色胺和去甲肾上腺素在中枢神经系统的再摄取，以阻断疼痛传播， 并且提高内源内啡肽的水平以缓解疼痛。抗痉挛药和选择性5-羟色胺再摄取抑 制剂用作对与TCA不相容的患者的替代选择。局部辣椒素已知对于疼痛的感 觉障碍有用，其触发神经肽，P物质从C型痛觉纤维的释放，并抑制P物质的 供给，以干扰周围疼痛信号的传导和传播，这使得疼痛减轻。

然而，难以找到适合治疗患糖尿病周围神经病变患者的疗法，因为在病因 和症状上具有高度多变性。实践中，相对于病因治疗，优先提供用于缓解疼痛 和抑制糖尿病周围神经病变发展的对症治疗。因此，对于能通过再生糖尿病破 坏的神经而治愈糖尿病周围神经病变的疗法的需求不断增加。发挥有利于神经 元再生的功能的神经生长因子正成为用于糖尿病周围神经病变疗法的强效候 选物。

许多先前研究表明在患糖尿病的对象中，神经生长因子的生物合成和在神 经元上的逆运输都降低了，因此，这被认为是糖尿病神经病变的一个病因。在 健康人中，NGF在真皮角质细胞中产生，与trkA受体相互作用。另一方面， 在糖尿病患者的真皮角质细胞中观察到低水平的NGF，这已知与感觉神经纤维 的代偿失调相关(Diabetes Obes Metab.2008Feb;10(2):99-108.Epub2007Jun26, Review.Diabetic neuropathy:new strategies for treatment)。

先前研究表明施用NGF降低了糖尿病周围神经病变诱导动物的疼痛以及 症状。基于这个结果，也在糖尿病神经病变患者中进行了临床试验。在随机化 安慰剂对照的2期临床试验中，在6个月内每周三次施用重组人NGF后，糖 尿病周围神经病变患者的症状和疼痛减轻了。然而，在48周内进行的随机化 安慰剂对照的3期临床试验，由于注射部位的疼痛以及不显著的药物效果而不 是显著有效。因此，后续研究已转向促进内源NGF的生物合成，而不是外源 NGF的供给(Am J Med.1999Aug30;107(2B):34S-42S,Review.Neurotrophic  factors in the therapy of diabetic neuropathy)。

山药(Dioscorea Rhizoma)，是属于薯蓣科的植物，在草药中是用于脚板薯 (Dioscorea batatas Decaisne)或日本薯蓣(Dioscorea japonica Thunberg)的无周皮 的新鲜根茎的术语，或是用于将所述新鲜根茎蒸熟并干燥之后的所获得物的术 语。

穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica)，是多年生攀爬植物穿龙薯蓣(Dioscorea  nipponica Makino)的根茎，含有多种甾醇型皂苷，包括薯蓣皂苷、原皂苷元 (prosapogen)A和原皂苷元C。

在草药中，这些草药已单独使用或与其他草药结合使用。在先前文献中， 在任何地方都还没有报道过来自这两种草药组合的提取物对于糖尿病周围神 经病变的药用功效。

韩国专利No.854621提供了用于预防和治疗周围神经病变的组合物，其包 含来自选自穿龙薯蓣、五裂叶薯蓣(Dioscorea quinqueoloba)、脚板薯、日本薯 蓣和山萆薢(Dioscorea tokora)的植物的提取物，公开了所述组合物诱导轴突的 生长，并提高内源神经生长因子的分泌，由此有效用于预防和治疗周围神经病 变。

本发明人证实了来自选自穿龙薯蓣、五裂叶薯蓣、脚板薯、日本薯蓣和山 萆薢的植物的提取物的作用是如韩国专利No.854621所公开的，诱导轴突的显 著生长并提高内源NGF的分泌。出人意料地，本发明人通过动物模型试验发 现来自特定比例的山药和穿龙薯蓣的混合物的提取物，通过提高体内(例如血 浆和唾液腺中)的NGF至高度显著的水平，并通过缓解糖尿病神经病变引起的 对热和机械刺激高度敏感的疼痛，保证了对于糖尿病周围神经病变的治疗协同 效果，而来自这些草药每一种或组合的提取物在轴突生长和内源神经生长因子 分泌方面具有几乎相同的效果，这在本发明中达到顶峰。

发明内容

技术问题

本发明目的是提供一种草药组合物，其源于在韩国专利No.854621中公开 的草药，其展现出显著提高体内神经生长因子(NGF)水平的活性，对于糖尿病 周围神经病变是治疗有效的。

本发明另一目的是提供用于预防和治疗糖尿病周围神经病变的包含所述 草药组合物的药物组合物和健康功能食品。

技术方案

本发明目的可通过提供药物组合物和健康功能食品实现，所述药物组合物 和健康功能食品包含由3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物制备的草药提取 物，所述提取物可用于预防和治疗糖尿病周围神经病变。

根据其一个方面，本发明提供了来自山药和穿龙薯蓣的混合物的草药提取 物。更具体地，由本发明提供的草药提取物是从含有重量比为3.5:1(w/w)的山 药和穿龙薯蓣的混合物获得的。

根据本发明的草药提取物可从干燥的山药和穿龙薯蓣的混合物制备，其 中，通过在室温下在50%乙醇中冷沉淀48小时，之后真空浓缩。具体地，将 山药和穿龙薯蓣洗净、干燥、切断并以3.5:1山药：穿龙薯蓣的重量比混合， 将草药混合物在5倍重量的50%乙醇中在室温一次冷沉淀48小时，然后在减 压下浓缩提取物。

根据其另一个方面，本发明提供用于预防和治疗糖尿病周围神经病变的组 合物，其包含作为活性成分的来自3.5:1(w/w)山药：穿龙薯蓣的混合物的草药 提取物，与药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。

根据本发明的组合物含有基于组合物的总重量，以重量计从0.01重量%到 80重量%的量，优选从1重量%到50重量%的量的，来自3.5:1山药：穿龙薯 蓣(w/w)的混合物的草药提取物。

对于本领域技术人员应该明显的是，糖尿病神经病变的症状包括丧失感 觉，例如触觉、振动感觉、温度感觉等，以及疼痛，例如灼烧不适、刺痛、酸 痛、拉紧的感觉等。

根据本发明的基于来自3.5:1(w/w)山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物 的组合物可进一步包含合适的载体、赋形剂或稀释剂。

可用于本发明组合物的载体、赋形剂或稀释剂的实例包括乳糖、右旋葡萄 糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树 胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚 乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

本发明组合物可配制成口服剂型例如散剂、丸剂、片剂、胶囊、悬浮液、 乳液、糖浆、气雾剂等，局部剂、栓剂或无菌注射溶液。本发明药物组合物可 与稀释剂或赋形剂例如填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性 剂等联合配制。预期用于口服的固体制品可采取片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、 胶囊等形式。关于这些固体剂，本发明的组合草药提取物与至少一种赋形剂联 合配制，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶。除了所述简单的赋形剂，可 使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石。预期用于口服的液体制品包括悬浮液、内 服溶液、乳液、糖浆等。除了简单的稀释剂例如水或液体石蜡之外，各种赋形 剂，例如润湿剂、增甜剂、芳香剂、防腐剂等可包含在液体制品中。此外，本 发明药物组合物可通过非口途径服用。为此，可使用无菌水性溶液、非水性溶 剂、悬浮液、乳液、冻干产物、栓剂等。可注射丙二醇、聚乙二醇、植物油例 如橄榄油、和酯例如油酸乙酯可适用于非水性溶剂和悬浮液。栓剂的基本材料 包括硬脂酸甘油三酯(Witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、甘油 三月桂酸酯(laurin butter)和甘油明胶。

根据其另一方面，本发明提供来自3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物 的草药提取物在制备用于糖尿病周围神经病变的治疗剂中的用途。

根据其另一方面，本发明提供用于治疗糖尿病神经病变的方法，包括以治 疗有效量向需要其的哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含来自3.5:1 (w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物。

包含3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物的药物组合物的 剂量可依赖于多种因素变化，所述多种因素包括患者的年龄、性别、体重和健 康状况、饮食、服用时间、服用途径、排泄率等。典型地，本发明药物组合物 可以每天单剂量或多剂量施用，以0.01到10g/kg，优选1到5g/kg的日剂量。 然而，本领域技术人员应该明白剂量决不限制本发明。

根据本发明的包含来自3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取 物的药物组合物可通过多种途径施用至哺乳动物，例如大鼠、小鼠、牲畜、人 等。可预期所有的施用途径，例如，药物组合物可口服、直肠内、静脉内、肌 内、皮下、子宫内、硬膜内或脑血管内(intracerebrovascularly)施用。

由于几乎无毒性和副作用，来自3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物的 草药提取物可在长时期内安全摄入，用于预防糖尿病神经病变的目的。

在本发明中，进行体内测试以检测来自3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混 合物的草药提取物提高体内神经生长因子水平和减轻糖尿病周围神经病变症 状的能力。来自分别为健康和患有糖尿病神经病变的动物模型的数据显示，与 来自单独草药或来自其他重量比的草药混合物的提取物相比，根据本发明的来 自特定比例草药混合物的提取物具有治疗协同效果。

根据其另一方面预期，本发明是用于预防和改善糖尿病神经病变的健康功 能食品，其包含来自3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物和营 养学(sitologically)可接受的食品添加剂。

如本文所使用，术语“健康功能食品”是指包括在“针对健康功能食品的 2002法律(2002Law for health functional foods)”中定义的那些，例如根据韩国 食品和药品管理局的KFDA通知号2004-12，见于规定了针对人类功能性和安 全性核实的健康功能食品材料或成分的列表中的健康食品。

更特别地，本发明提供用于预防或改善糖尿病神经病变的健康功能食品， 其包含来自3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物和营养学可接受的 食品添加剂。

根据本发明的包含来自3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物的 组合物可应用至用于减轻糖尿病神经病变症状的药品、食品和饮品。例如，可 加入本发明草药提取物的食品包括饮料、口香糖、茶、复合维生素和食品辅料 (food aid)。对于在药品中的应用，草药提取物可以是丸剂、散剂、颗粒剂、片 剂、胶囊或液体的形式。

当应用至固体食品时，本发明草药提取物可基于食品的总重量，以重量计 0.1到15%的量、优选以重量计0.2到10%的量使用。在液体形式的健康品中， 本发明草药提取物可以在每100mL液体0.1到30g的量的范围，优选0.2到 5g。

除了对于不可缺少的草药成分的特定比率，对于液体健康组合物没有给予 任何特定的限制。如一般饮料，液体健康组合物可进一步包含各种调味剂、天 然碳水化合物和其他添加剂。

天然碳水化合物的优选实例包括单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如 麦芽糖、蔗糖等；多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，例如木糖醇、山梨 醇、赤藓糖醇等。可用于本发明的调味剂可以是天然的(索马甜、甜叶菊提取 物(例如莱苞迪苷A、甘草甜索))或合成的(糖精、阿巴斯甜)。天然碳水化合物 可以每100mL液体健康组合物约1到20g的量、优选约5到12g的量使用。

此外，本发明组合物可含有各种营养物、维生素、矿物质(电解质)、合成 调味剂和/或天然调味剂、着色剂、填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、 海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、 甘油、醇和用于碳酸饮料的碳酸化剂。对于在天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料 中的使用，本发明组合物可进一步含有果肉。这些添加剂可单独或组合使用。 一般地，但不重要地，添加剂的量为每100重量份组合物，从约0到20重量 份的级别。

有益效果

如迄今所描述，根据本发明来自3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物的 草药提取物，在提高神经生长因子(NGF)体内水平、轴突的生长和认知能力方 面，显示出比来自单独山药或穿龙薯蓣、或其他重量比的山药和穿龙薯蓣混合 物的提取物显著更高的协同效果，因此能用在用于预防和治疗糖尿病周围神经 病变的药物组合物和健康功能食品中。

附图说明

图1是显示实施例1的提取物对1型糖尿病小鼠坐骨神经作用的电子照片。

图2是显示实施例1的提取物对1型糖尿病大鼠坐骨神经作用的电子照片。

具体实施方式

通过以下实施例，可获得对于本发明更好的理解，所述实施例用于解释说 明，不诠释为限制本发明。

实施例1：从山药和穿龙薯蓣的混合物制备提取物

从韩国Kyoungdong市场的中药店购买都处于干燥条件下的山药和穿龙薯 蓣。从中移除杂质后，用切刀将草药剁碎，以山药：穿龙薯蓣为3.5：1的重量 比混合。在2kg的混合物中加入10L的50%乙醇溶液，之后在室温搅拌孵育 48小时。通过过滤移除草药混合物，在真空下浓缩滤液，并冷冻干燥以提供混 合的草药提取物(粗提物)(见表1)。

表1：创造性的组合草药提取物产率

比较实施例1：制备山药提取物

除了使用2kg山药，而非2kg混合物(见表2)，以如实施例1中相同的方 式制备山药提取物(粗提物)。

比较实施例2：制备穿龙薯蓣提取物

除了使用2kg穿龙薯蓣，而非2kg混合物(见表2)，以如实施例1中相同 的方式制备穿龙薯蓣提取物(粗提物)。

表2：来自山药和穿龙薯蓣的各自提取物的产率

比较实施例3至10：从山药和穿龙薯蓣的混合物制备提取物

使用如在实施例1中使用的相同草药：山药和穿龙薯蓣。用切刀剁碎山药 和穿龙薯蓣，并以表3中列举的重量比混合。向2kg的每种混合物加入10L 的50%乙醇溶液，之后在室温下搅拌孵育48小时。通过过滤移除草药混合物， 在真空浓缩滤液，并冷冻干燥以提供混合的草药提取物(粗提物)。

表3：山药和穿龙薯蓣的混合物的组合提取物的产率

测试实施例1：测试正常小鼠模型中神经生长因子的体内水平

评估了实施例1中使用50%乙醇的粗提物体内诱导神经生长因子分泌的能 力(O.Arrieta and J.Sotelo et al.,Retinoic acid increases tissue and plasma contents  of nerve growth factor and prevents neuropathy in diabetic mice.European Journal  of Clinical Investigation(2005)35)。

每只重量为25-30g的雄性ICR小鼠在22-24℃、60-80%相对湿度下适应 环境一周，并以水和标准饮食饲养。将它们依据重量分组。以预先确定的量将 以上述实施例中制备的提取物口服施用给小鼠，以100mg/kg剂量的加巴喷丁 用作阳性对照，16小时后从小鼠采集血液。之后将它们处死，以获得坐骨神经 和唾液腺。

在10,000rpm下离心血样10min后，并通过ELISA(ABS450nm)测定如 此分离的血浆中的生长因子的水平。称重坐骨神经和唾液腺，以与重量成比例 的量加入含有100mM Tris-HCl、1M NaCl、2%BSA、4mM EDTA、2.0% TrtionX-100、0.02%叠氮化钠、0.1mg/ml抑肽素A、5mg/ml抑肽酶(aprotonin)、 0.5mg/ml抗蛋白酶、167mg/ml苯甲脒和5.2mg/ml PMSF的溶液，之后匀浆。 使用1N HCl以1μl/50μl的量将匀浆孵育15min用于氧化，并使用1N NaOH 以1μl/50μl的量中和。在10,000rpm下离心10min以获得上清液。类似血浆， 定量分析坐骨神经和唾液腺的神经生长因子水平。

在表4中总结血浆NGF水平，表5中总结坐骨神经NGF水平，在表6中 总结唾液腺NGF水平。

表4：血浆中的NGF水平

如从表4中可见，当以相同的剂量施用时，观察到比较实施例1的山药提 取物、比较实施例2的穿龙薯蓣提取物、以及比较实施例3至10的来自山药 和穿龙薯蓣的混合物的提取物诱导血浆中神经生长因子分泌至类似于对照的 程度。相比而言，实施例1的提取物提高了血浆NGF水平，超过了由山药提 取物、穿龙薯蓣提取物或来自其他重量比的山药和穿龙薯蓣的混合物的提取物 获得的水平。

提高血浆中的神经生长因子的水平，而血浆是神经生长因子朝向目标移动 借由的途径，这表明促进了神经生长因子的分泌。因此，相比于来自单独山药 的提取物、来自单独穿龙薯蓣的提取物、或来自其他重量比山药和穿龙薯蓣混 合物的提取物，根据本发明的来自3.5:1(w/w)山药：穿龙薯蓣混合物的提取物 进一步促进了神经生长因子的分泌，以显著提高体内NGF的水平。

表5：坐骨神经中的NGF水平

观察显示，如在表5中可看到，当以相同剂量施用时，比较实施例1的山 药提取物、比较实施例2的穿龙薯蓣提取物、以及比较实施例3至10的来自 山药和穿龙薯蓣的混合物的提取物在唾液腺中分泌神经生长因子至类似于对 照的程度。相比而言，实施例1的提取物提高了坐骨神经NGF水平，超过了 由山药提取物、穿龙薯蓣提取物或来自其他重量比的山药和穿龙薯蓣的混合物 的提取物获得的水平。

因此，根据本发明的来自3.5:1(w/w)山药：穿龙薯蓣混合物的提取物可诱 导NGF分泌至血液中，这引起坐骨神经(目标组织)中NGF水平的显著提高。

表6：唾液腺中的NGF水平

如根据表6中的数据明显可见，当以相同剂量施用时，与对照相比，比较 实施例1的山药提取物和比较实施例2的穿龙薯蓣提取物仅以2-3%提高了唾 液腺中NGF的水平，然而，来自比较实施例3至10的山药和穿龙薯蓣的混合 物的提取物诱导唾液腺中NGF分泌至类似或低于由阳性对照加巴喷丁获得的 程度。相比而言，实施例1提取物使唾液腺中NGF的水平提高了33.5%。即， 相比于来自单独山药的提取物、来自单独穿龙薯蓣的提取物或来自其他重量比 的山药和穿龙薯蓣的混合物的提取物，本发明提取物允许唾液腺中NGF水平 的显著提高。发挥NGF来源功能的唾液腺中的NGF水平的提高，意味着促进 NGF的合成。

因此，3.5:1(w/w)的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物能显著提高体 内NGF的水平。

因此，由于显著提高体内NGF水平的能力，根据本发明的3.5:1(w/w)的 山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物可用于药物组合物或健康功能食品，用 于预防和治疗糖尿病周围神经病变。

测试实施例2：测试对于患链脲霉素诱导的1型糖尿病的SD雄性大鼠中 疼痛、NGF分泌和神经退行性变的作用

评估了实施例1中制备的3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物 和比较实施例1至10的提取物对于患1型糖尿病的SD雄性大鼠中疼痛、体 内NGF水平和神经退行性变的作用。

每只重量为220-250g的雄性SD大鼠在22-24℃、60-80%相对湿度下适应 环境一周，并以水和标准饮食饲养。之后，向大鼠以剂量50mg/kg一次静脉 施用链脲霉素生理盐水溶液，以诱导1型糖尿病。诱导糖尿病四周后，根据血 糖水平将大鼠分组。将在以上实施例中制备的提取物以预先确定的剂量每天一 次口服施用给大鼠8周，同时使用分别50mg/kg和100mg/kg的α-类脂酸和加 巴喷丁作为阳性对照。之后，将它们处死以获得坐骨神经和唾液腺。以如测试 实施例1中相同的方式处理坐骨神经和唾液腺，并且通过ELISA测定NGF水 平。在以下表7中总结结果。

检测了提取物缓解由糖尿病神经病变引起的疼痛的能力。在这方面，分离 患有链脲霉素诱导的糖尿病的大鼠，并以预先确定的剂量每天一次口服提取物 14周，以α-类脂酸50mg/kg和加巴喷丁100mg/kg作为阳性对照。实施 Randall-Sellito测试以测定对于爪上压力的阈值反应。使用甩尾测试测定针对 热疼痛反应所需的潜伏时间。在表8中总结结果。为了评估随糖尿病神经病变 的发作而发展的神经退行性变，用福尔马林固定从每组大鼠获取的坐骨神经， 并在电子显微镜下观察，以测定髓鞘的大小和厚度，并在表9中总结结果。

表7：2型糖尿病大鼠模型(SD雄性大鼠)坐骨神经中的NGF水平

如从表7中可见，当以相同的剂量施用时，相比于比较实施例1的山药提 取物、比较实施例2的穿龙薯蓣提取物、或比较实施例3至10的来自山药和 穿龙薯蓣的混合物的提取物，实施例1的提取物显著提高了坐骨神经和唾液腺 两者中NGF的水平。

因此，证实了3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物甚至在患1 型糖尿病的动物中诱导目标组织(坐骨神经、唾液腺)中NGF的显著提高。

表8：分析1型糖尿病大鼠模型(SD雄性大鼠)中的疼痛反应

如从表8中可见，当以相同的剂量施用时，相比于比较实施例1的山药提 取物、比较实施例2的穿龙薯蓣提取物、或比较实施例3至10的来自山药和 穿龙薯蓣的混合物的提取物，实施例1的提取物显著提高了压力疼痛阈值和针 对压力反应的潜伏时间两者。

针对机械刺激的阈值的提高描绘了针对疼痛的阈值的提高。在甩尾测试 中，针对疼痛反应的潜伏时间的增加对应于针对热刺激的阈值的提高，表明疼 痛的减轻。

因此，根据本发明的3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物显示 对疼痛——糖尿病周围神经病变的症状——的显著减轻作用。

表9：分析1型糖尿病大鼠模型(SD雄性大鼠)中的神经退行性变

如根据表9数据明显可见，对照髓鞘的大小和厚度都变得较小，表明坐骨 神经由于糖尿病神经病变的损坏或退化。当施用实施例1的提取物时，观察到 大鼠的髓鞘大小和厚度都变得更大。

因此，本发明提取物可改善神经退行性变，引起甚至在组织学方面的目标 器官中的神经再生。

因此，根据本发明的草药提取物可应用至药物组合物，其可对患1型糖尿 病对象中的糖尿病周围神经病变的预防和治疗带来显著的协同作用。

测试实施例3：测试对于患链脲霉素诱导的1型糖尿病的ICR雄性小鼠中 疼痛、NGF分泌和神经退行性变的作用

评估了实施例1中制备的3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物 对于患1型糖尿病的ICR雄性小鼠中的疼痛、体内NGF水平和神经退行性变 的作用。

每只重量为25-30g的ICR雄性小鼠在22-24℃、60-80%相对湿度下适应 环境一周，并以标准饮食和水饲养。之后，向小鼠以剂量200mg/kg一次静脉 施用链脲霉素生理盐水溶液，以诱导1型糖尿病。诱导糖尿病四周后，根据血 糖水平将鼠分组。将在以上实施例中制备的提取物以预先确定的剂量每天一次 口服施用给小鼠14周，同时使用分别50mg/kg和100mg/kg的α-类脂酸和加 巴喷丁作为阳性对照。将每组的小鼠放置在58℃热板上，并通过测定小鼠在脚 底感觉到热痛觉和跳起所需的潜伏时间来检测对热刺激的痛觉过敏。在表10 中总结结果。

之后，将小鼠处死，以从中获得坐骨神经和唾液腺。以如在测试实施例1 中相同的方式处理坐骨神经和唾液腺，并通过ELISA测定NGF水平。在以下 表11中总结结果。

为了评估与糖尿病神经病变的发作一起发展的神经退行性变，将从每组小 鼠中取出的坐骨神经用福尔马林固定，并在电子显微镜下观察以测定髓鞘的大 小和厚度，结果总结在表12中。

表10：分析1型糖尿病小鼠模型(ICR雄性小鼠)中的疼痛反应

组 剂量(mg/kg) 对58℃热板上疼痛反应的潜伏时间(秒) 正常   55.3 对照   25.2 实施例1 100 45.9 比较实施例1 100 26.6 比较实施例2 100 25.7 比较实施例3 100 35.6 比较实施例4 100 25.3 比较实施例5 100 26.0 比较实施例6 100 35.0 比较实施例7 100 32.2 比较实施例8 100 33.0 比较实施例9 100 26.8 比较实施例10 100 36.1 α-类脂酸 50 31.1 加巴喷丁 100 33.0

对热板上疼痛反应的潜伏时间的增加反映了对热刺激的疼痛阈值的提高， 表明疼痛降低。如从表10中可以看到，相比于比较实施例1的山药提取物、 比较实施例2的穿龙薯蓣提取物、或比较实施例3至10的来自山药和穿龙薯 蓣的混合物的提取物，实施例1的提取物显著增加了对热板上疼痛反应的潜伏 时间，表明本发明草药组合物对疼痛——糖尿病周围神经病变的症状——具有 显著的减轻作用。

表11：1型糖尿病小鼠模型(ICR雄性小鼠)中坐骨神经和唾液腺中的NGF水平

如从表11中可以看到，相比于比较实施例1的山药提取物、比较实施例2 的穿龙薯蓣提取物、或比较实施例3至10的来自山药和穿龙薯蓣的混合物的 提取物，实施例1的提取物显著提高了坐骨神经和唾液腺两者中的NGF水平。

因此，证明了3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物诱导了患1 型糖尿病的ICR雄性小鼠和患1型糖尿病的SD雄性大鼠中目标器官(坐骨神 经、唾液腺)中的NGF的显著提高。

表12：分析1型糖尿病小鼠模型(ICR雄性小鼠)中的神经退行性变

如根据表12的数据明显可见，对照髓鞘在大小和厚度上都降低了，表明 糖尿病神经病变引起的坐骨神经的损伤或退化。当施用实施例1的提取物时， 观察到小鼠具有大小和厚度上都增加的髓鞘。

因此，本发明提取物能够改善患1型糖尿病的ICR小鼠和患1型糖尿病的 SD大鼠中的神经退行性变，引起甚至在组织学方面的目标器官中的神经再生。

因此，根据本发明的草药提取物能用于药物组合物，所述药物组合物能对 患1型糖尿病对象中的糖尿病周围神经病变的预防和治疗带来显著的协同作 用。

测试实施例4：测试对于患基因诱导的2型糖尿病的雄性小鼠(db/db雄性 小鼠)中疼痛和NGF分泌的作用

评估了实施例1中制备的3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物 对于患2型糖尿病db/db雄性小鼠中疼痛和体内NGF水平的作用。

每只重量为40-45g的db/db雄性小鼠在22-24℃、60-80%相对湿度下适应 环境一周，并以标准饮食和水饲养。在出生后第9周，选择已诱导糖尿病的小 鼠。四周后，根据血糖水平分离患2型糖尿病的小鼠。将在以上实施例中制备 的提取物以预先确定的剂量每天一次口服施用给小鼠12周，同时使用分别50 mg/kg和100mg/kg的α-类脂酸和加巴喷丁作为阳性对照。将每组小鼠放置在 58℃热板上，并通过测定小鼠在脚底感觉到热痛觉和跳起所需的潜伏时间来检 测对热刺激的痛觉过敏。在表13中总结结果。

之后，将小鼠处死，以从中获得坐骨神经。以如在测试实施例1中相同的 方式处理坐骨神经，并通过ELISA测定它的NGF水平。在以下表14中总结 结果。

表13：分析2型糖尿病小鼠模型(db/db雄性小鼠)中的疼痛反应

组 剂量(mg/kg) 对58℃热板上疼痛反应的潜伏时间(秒) 对照   12.7 实施例1 100 28.0 比较实施例1 100 15.1 比较实施例2 100 14.9

比较实施例3 100 21.3 比较实施例4 100 21.0 比较实施例5 100 20.5 比较实施例6 100 19.3 比较实施例7 100 22.3 比较实施例8 100 17.6 比较实施例9 100 17.6 比较实施例10 100 16.8 α-类脂酸 50 15.4 加巴喷丁 100 16.1

如从表13中可以看到，相比于比较实施例1的山药提取物、比较实施例2 的穿龙薯蓣提取物、或比较实施例3至10的来自山药和穿龙薯蓣的混合物的 提取物，实施例1的提取物显著增加了对热板上疼痛反应的潜伏时间，表明本 发明草药组合物对疼痛——糖尿病周围神经病变的症状——具有显著的减轻 作用。

表14：2型糖尿病小鼠模型(db/db雄性小鼠)的坐骨神经中的NGF水平

组 剂量(mg/kg) 坐骨神经中的NGF水平(pg/mg) 对照   6.2 实施例1 100 11.6 比较实施例1 100 6.5 比较实施例2 100 6.3 比较实施例3 100 8.4 比较实施例4 100 8.3 比较实施例5 100 7.8 比较实施例6 100 6.9 比较实施例7 100 8.1 比较实施例8 100 7.0 比较实施例9 100 7.1 比较实施例10 100 7.3 α-类脂酸 50 7.6 加巴喷丁 100 7.2

如从表14中可以看到，相比于比较实施例1的山药提取物、比较实施例2 的穿龙薯蓣提取物、或比较实施例3至10的来自山药和穿龙薯蓣的混合物的 提取物，实施例1的提取物显著提高了坐骨神经中的NGF水平。

因此，证明了3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物诱导了甚至 在2型糖尿病情况下的目标器官中的NGF的显著提高。

由于具有显著提高体内NGF水平的能力，根据本发明的草药提取物能用 于药物组合物，所述药物组合物能对患1或2型糖尿病对象中的糖尿病周围神 经病变的预防和治疗带来显著的协同作用。

测试实施例5：使用C6大鼠胶质瘤细胞和PC12神经细胞测试诱导NGF 合成和神经细胞生长的活性

检测实施例1中制备的3.5:1的山药：穿龙薯蓣(w/w)的混合物的草药提取 物对于诱导C6大鼠胶质瘤细胞中NGF合成和PC12大鼠神经细胞生长的能力。

为了评估提取物诱导NGF合成的能力，将C6胶质瘤细胞以每孔相同的密 度接种到平板中，并孵育24小时。用PBS洗涤细胞，并在补充有50μg/ml或 250μg/ml实施例1或比较实施例1至10的草药提取物的新鲜培养基中培养细 胞48小时。之后，收集培养物，并使用ELISA定量分析它们的NGF水平。 在表15中总结结果。

为了使用对诱导神经细胞生长能力的测试，以每孔相同的密度将PC12神 经细胞接种在平板中，并孵育24小时。用PBS洗涤细胞，并在补充有实施例 1或比较实施例1至10的草药提取物或NGF的培养基中培养细胞48小时。用 MTS分析测定细胞的生长，并在表16中总结结果。

表15：对NGF合成的促进作用

如从表15中可以看到，相比于比较实施例1的提取物(仅来自山药)、比较 实施例2的提取物(仅来自穿龙薯蓣)、或比较实施例3至10的提取物(来自其 他重量比的山药和穿龙薯蓣的混合物)，实施例1的提取物显著提高了C6细胞 中的NGF水平。

因此，证明了3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物最大地诱导 了NGF的合成。

表16：对神经细胞的增殖作用

如从表16中可以看到，相比于比较实施例1的提取物(仅来自山药)、比较 实施例2的提取物(仅来自穿龙薯蓣)、或比较实施例3至10的提取物(来自其 他重量比的山药和穿龙薯蓣的混合物)，实施例1的提取物显著促进了PC12神 经细胞的生长。

因此，证明了根据本发明的3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取 物对神经细胞具有显著的增殖作用。

测试实施例6：测试PC12神经细胞中NGF受体的磷酸化作用

评估了实施例1中制备的3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物 对于促进PC12大鼠神经细胞中NGF受体磷酸化作用的能力。

为了用于该测试，将PC12神经细胞以每孔相同的密度接种到平板中，并 孵育24小时。用PBS洗涤细胞，并在补充有实施例1或比较实施例1至10 的草药提取物或NGF的培养基中培养细胞48小时。之后，使用蛋白质印迹法 (Western blotting)检测磷酸化TrkA(NGF受体)，并基于所检测条带的厚度定量 分析。在表17中总结结果。

NGF信号转导起始于NGF与其受体(Trk-A)的结合，这引起所述受体的磷 酸化。因此，提高水平的磷酸化NGF受体意味着NGF信号转导途径的放大。

如从以下表17的数据可见，相比于比较实施例1的提取物(仅来自山药)、 比较实施例2的提取物(仅来自穿龙薯蓣)、或比较实施例3至10的提取物(来 自其他重量比的山药和穿龙薯蓣的混合物)，实施例1的提取物诱导NGF受体 磷酸化的显著增加。

表17：对NGF受体磷酸化作用的促进作用

测试实施例7：测试诱导大鼠来源的DRG神经细胞中轴突生长的活性

评估了实施例1中制备的3.5:1的山药：穿龙薯蓣的混合物的草药提取物 对于促进获自大鼠胚胎的DRG(背根神经节)神经细胞中轴突生长的活性。

为了用于该测试，将DRG神经细胞以相同的密度接种到平板中，并孵育 24小时。之后，用PBS洗涤细胞，并在培养基中在存在或不存在实施例1或 比较实施例1至10的提取物和NGF组合的情况下培养细胞48小时。在显微 镜下观察每组的神经细胞，以测定其中轴突生长的区域。在表18中给出测定 的平均值。

轴突区域的增加表明神经细胞被激活以生长轴突。如在以下表18中可看 到，相比于比较实施例1的提取物(仅来自山药)、比较实施例2的提取物(仅来 自穿龙薯蓣)、或比较实施例3至10的提取物(来自其他重量比的山药和穿龙薯 蓣的混合物)，实施例1的提取物显著增加了轴突区域。

表18：对来自DRG神经细胞的轴突形成的促进作用

总得看来，从测试实施例1至7获得的数据表明，相比于比较实施例1的 提取物(仅来自山药)、比较实施例2的提取物(仅来自穿龙薯蓣)、或比较实施 例3至10的提取物(来自其他重量比的山药和穿龙薯蓣的混合物)，实施例1 的提取物能显著诱导体内NGF水平的提高、神经细胞和轴突的生长、疼痛—— 糖尿病神经病变的症状——的减轻以及组织学神经退行性变的预防(神经再生 的促进)，因此能用于药物组合物和保健食品，用于预防和治疗糖尿病周围神 经病变。

以下给出了包含来自山药和穿龙薯蓣的混合物的草药提取物的制剂的解 释性而非限制性实例。

制剂实施例1：注射制品

在所述成分的混合物中加入无菌水形成2mL总体积，将溶液装载到2mL 安剖瓶中，并灭菌以获得注射剂。

制剂实施例2：片剂制品

实施例1的提取物     200mg

乳糖                100mg

淀粉                100mg

硬脂酸镁            补足量

将所述成分混合，并使用制片方法压缩成片剂。

制剂实施例3：胶囊制品

将所述成分混合，并根据常用方法装载到明胶胶囊中，以提供胶囊。

制剂实施例4：液体制品

实施例1的提取物     1000mg

糖                  20ｇ

异构酶(Isomeroase)  20ｇ

柠檬调味剂          补足量

加入纯化水以形成100mL的总体积。

将以上各成分混合，装载入100mL棕色小瓶中，并灭菌以提供液体制剂。

尽管已用于解释说明的目的公开了本发明的优选实施方式，但本领域技术 人员可理解，可做出各种改变、增添和替换，而不脱离如后附权利要求所公开 的本发明的范围和精神。