用于单子叶植物中的病原体控制的包衣组合物

摘要

本发明涉及用于施用至能够生长出根和芽的单子叶植物的植物结构的包衣组合物，其中所述包衣组合物包含有机载体物质，以及具有对抗所述单子叶植物的至少一种或多种病原体的活性的一种或多种生物试剂。

说明书

本发明涉及包衣组合物，其包括有机组分和生物试剂，用于施用至能够生长出根和芽的单子叶植物的植物结构，例如种子；包衣组合物在单子叶植物结构(例如种子)上的应用；制备这样的包衣组合物的方法；和用这样的包衣组合物包衣的单子叶植物结构，例如种子。具体而言，本发明涉及单子叶植物结构包衣组合物，其包含有机载体物质和生物试剂，所述生物试剂选自对侵扰单子叶植物的植物结构(例如种子和鳞茎)的一种或多种植物病原体的具有活性的化学和生物试剂，所述植物病原体选自细菌性、真菌性和节肢动物病原体。

每年都记录到单子叶作物的重大损失，且该重大损失为由于病原体的植物侵扰的结果，所述病原体，例如细菌、真菌和节肢动物，能够侵扰不同发育阶段例如种子阶段的植物。尽管人们已经设计出多种防御性措施来对抗这样的侵扰，但由病原体侵扰导致的农业损失仍然很高。这样的防御性措施包括使用合成化学品；使用在植物中基因工程；和使用以包衣、喷雾剂、和洗涤剂的形式施用至单子叶种子的活生物试剂。

化学试剂形式的农药例如杀真菌剂、杀菌剂和杀节肢动物剂，通常为杀昆虫剂和/或杀螨剂的形式，可以以土壤浸液、液体种子处理等的形式施用至单子叶作物。这样的类型的化学处理倾向于不加选择的，并且可不利地影响有益的细菌、真菌和节肢动物以及这样的处理所靶向的植物病原体。

例如，在将常规的农药用作为种子处理时，直接用农药将种子包衣或在存在无机载体的情况下将农药施用至种子。这样的种子处理通常以液体的形式施用或作为湿的浆料施用并随后将种子干燥。这样的处理的主要目标是提供针对攻击种子的病原体，例如节肢动物和/或种传微生物和/或土传微生物的保护。通常使用的高水平的化学品向环境引入化学负担，其可能会导致生态学问题。

在常规的种子包衣步骤中施用为化学试剂的生物试剂的一个问题是化学试剂通常作为浆料施用，并且，这可能产生包衣的不均匀施用，由此，种子没有被完全包衣或一定百分比的种子(高至20%，取决于种子的类型和包衣步骤)没有得到实质性地包衣。此外，种子包衣可能不均匀，并且，这导致种子包衣的物理学弱点，且包衣可能剥落。

当使用选自可以常规地施用至植物结构的有益的活细菌和真菌物种的生物试剂(例如作为孢子连同颗粒组合物的形式或随后可以被干燥的液体组合物的形式的无机载体)时，产生的另一个问题是施用的生物试剂迅速地丧失生存力。无意于受理论的限制，认为当种子或储藏器官被干燥时，微生物环境改变且可观察到施用的活生物试剂的生存力急剧下降，且几乎与施用的组合物干燥同时发生。生物试剂的生存力的丧失通常与真菌或细菌孢子的分裂有关，这使得它们不能生存。

现已发现，通过使用有机载体物质连同生物试剂，相对于常规地施用至单子叶种子的生物试剂的生存力，所述生物试剂在单子叶种子上的生存力得到改善。此外，植物结构的包衣较不易于剥落。

本发明的目的是提供改善的包衣，其包含用于单子叶植物结构(例如种子)的生物试剂。此外，本发明的目的是提供与常规的种子包衣相比较，使用较少的化学添加剂和/或较少量的化学添加剂的用于保护种子和/或幼小的植株免受病原体侵害的种子包衣。

本发明的这些目的和其他目的将通过以下说明和实施例变得明显。

根据本发明，提供了单子叶植物结构包衣组合物，其中所述包衣组合物包含至少一种颗粒形式的有机载体物质和具有对抗单子叶植物的一种或多种病原体的活性的一种或多种生物试剂，其中所述载体物质选自具有≥50°摄氏度的熔点的蜡。

农民的农作物通常被发往很多不同的市场，例如源自谷物的食物，例如面包、早餐谷物、淀粉制备、酿造，和用于驯养牲畜(例如鸡和牛)的饲料的生产中。对于本发明的目的，根据上下文，多粒或一粒“种子”或一粒“种子”被解释为复数或单数。对于单数和复数的“种子”的引用可以互换使用，并且指可以向其施用本发明的组合物的种子，通常为有生存力的种子。本文中提供的单子叶种子指能够萌发为至少对于单子叶植物种子而言典型的常规萌发水平的种子。单子叶种子包括可以用于种植单子叶植物的那些，所述单子叶植物例如稻属种(Oryza spp.)的品种例如Oryza sativa (稻)、小麦属种(Triticum spp.)的品种例如T. aestivum (小麦：春小麦和冬小麦品种)、黑麦属种(Secale spp.)的品种例如Secale cereale (黑麦)、燕麦属种(Avena spp.)的品种例如Avena sativa (燕麦)、玉米属种(Zea spp.)的品种例如Zea mays (玉米[玉蜀黍])、高粱属种(Sorghum spp.)的品种例如Sorghum bicolour (高粱)、大麦属种(Hordeum spp.)的品种例如Hordeum vulgare (大麦)，和单子叶植物的杂交种，例如x Triticosecale (黑小麦：小麦和黑麦之间的杂交种)。

有机载体物质选自可以被施用至单子叶种子的有机物质，优选地作为干粉末施用，其中所述粉末颗粒具有预先确定的体积平均直径，或所述粉末颗粒以液体的形式存在，例如作为油质的配制物或作为含水配制物。

通常，在本发明中有用的有机载体物质以颗粒形式存在于本发明的组合物中，且所述组合物具有如本文所定义的一定大小的体积平均直径。为了获得适用于本发明的体积平均直径的有机物质的颗粒，可以在粗磨机中将例如1-5公斤的块或板的形式的有机物质打碎或粗磨成小的毫米大小的片(例如近似直径为2mm-8mm的大小，例如4mm-6mm)。随后可以使毫米大小的片通过粉碎工具例如标准磨例如Apex粉碎磨，并研磨或粉碎成具有在100μm - 500μm范围内的近似直径，例如在250μm - 300μm范围内的近似直径的颗粒。随后可以将微米大小的经粉碎的颗粒经过微粉化装置，例如AFG微粉化空气磨，以获得在本发明中有用的期望的VMD范围例如15μm - 20μm的颗粒。本领域技术人员了解，用于获得小颗粒的此类步骤是本领域中公知的。优选地，本发明的干粉末组合物包含具有≥5μm的体积平均直径，例如8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm，高至40μm，或其中的任何数值的体积平均直径的复合颗粒。如本文所述，所述复合颗粒的体积平均直径通常为≥10μm或≥12μm，并且可以处于10μm-200μm的范围内，并且可以具有处于其间任何位置的数值，例如≥10μm-100μm；或≥10μm-40μm；或≥10μm-30μm，或其间的任何期望的体积平均直径数值。优选地，本发明的干粉末组合物包含具有≥8μm的体积平均直径的颗粒，例如8μm、9μm、9.7μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm等，高至所选的任何体积平均直径例如高至200μm，或其间的任何体积平均直径例如40μm或30μm的体积平均直径的颗粒。具有≥10μm的体积平均直径的本发明的颗粒被认为对人类的胸部的危害较少，并且不被认为是变应原的。

在液体配制物中，预先确定的体积平均直径的颗粒悬浮于其中的悬浮剂配制物中并且被施用至种子，随后使用常规的干燥步骤将其干燥。当以干燥粉末的形式将有机载体物质施用至单子叶植物种子时，有机粉末物质的颗粒可以具有本文所述的体积平均直径。所述可以加入到本发明的干燥粉末的“一种或多种生物试剂”包括用于对抗病原体例如节肢动物例如昆虫、蜘蛛，或在适当的情况下，它们的幼虫、卵、或蛹的化学品；用于对抗细菌性病原体的化学品；和用于对抗真菌性病原体的化学品。此外，可以将有益的活生物试剂添加至在本发明中有用的这样的干燥粉末，所述活生物试剂能够靶向单子叶植物的细菌性病原体和/或靶向单子叶植物的真菌性病原体。所选的有益的活生物试剂的孢子，例如真菌分生孢子，或不形成孢子的真菌的菌丝或菌丝体或与分生孢子相似的结构可以被添加至在本发明中有用的干燥粉末中。在本发明中有用的适合的有机载体物质通常由具有≥50℃的熔点的蜡构成，更优选≥60℃，且最优选地由具有≥70℃的熔点的硬蜡构成。

在本发明中有用的天然蜡包括巴西棕榈蜡、蜂蜡、白蜡、紫胶蜡、鲸蜡、十六酸蜂花酯、鲸蜡醇十六酸酯、小烛树蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡、羊毛蜡、甘蔗蜡、retamo蜡、米糠蜡等。

在本发明中有用的合成蜡包括选自石蜡、微晶蜡、聚乙烯蜡、Fischer-Tropsch蜡、取代的酰胺蜡、聚合的α-烯烃等的适合的蜡。

在本发明中有用的无机蜡包括褐煤蜡(例如Lumax? Bayer)、地蜡(ceresin wax)、地蜡(ozocerite)、泥煤蜡等。

适合的有机载体颗粒可以选自蜡，例如巴西棕榈蜡、蜂蜡、褐煤蜡、白蜡、紫胶蜡、鲸蜡、十六酸蜂花酯、鲸蜡醇十六酸酯、小烛树蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡、羊毛蜡、甘蔗蜡、retamo蜡和米糠蜡，或其两种或多种的混合物。这样的蜡通常在熔化期间显示出高的晶格能的焓。优选地，所述有机载体物质为巴西棕榈蜡，其可以以液体的形式施用，通常以悬浮剂的形式施用，或更优选地以作为分离颗粒的粉末形式施用。通常，在本发明中有用的颗粒具有如本文所述的体积平均直径。

此外，在本发明的组合物中有用的有机载体颗粒可以包含其他的组分，例如选自以下的添加剂：UV阻断剂例如β-胡萝卜素或对氨基苯甲酸，着色剂例如荧光增白剂和可商购的着色剂例如食品着色剂，增塑剂例如甘油或豆油，抗微生物剂例如山梨酸钾、硝酸盐、亚硝酸盐、环氧丙烷等，抗氧化剂例如维生素E、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)和可存在的其他抗氧化剂，或其混合物。本领域技术人员了解，对这些通常包括的添加剂的选择将根据最终的目的和注意到的需要而进行。

取决于设计，本发明的液体配制物可以配制为含水配制物或油质配制物。含水配制物可以包括表面活性剂，其选自可商购的表面活性剂，例如                                                等。

油质的配制物，即基于油的配制物，可以包含适用于本发明的任何油，其可以选自石油油料例如石蜡油，和植物油例如菜籽油、大豆油、葵花油、棕榈油等。在本发明中有用的油配制物包含如本文所述的有机载体颗粒，且它们又可以与流平剂，例如亲水性的沉淀的二氧化硅，例如Sipernat 383 DS、Sipernat 320、EXP 4350和Sipernat D-17等混合。这样的自由流动的试剂可以被分散于油中，例如用于消泡的目的。

本领域技术人员了解，当含水配制物或油配制物可以用于施用在本发明中有用的生物试剂的情况下，在完成包衣后，液体成分应从经包衣的植物结构去除，例如通过使用常规的干燥方法而干燥去除，留下干燥颗粒形式的种子包衣组合物，其中所述种子包衣组合物由如本文所述的有机载体和至少一种同样如本文所述的生物试剂构成。

用于本发明的目的的生物试剂为可用于控制单子叶植物的植物病原体的种群的生物试剂，并且可以选自化学杀真菌剂、杀节肢动物剂例如杀昆虫剂和杀螨剂、杀菌剂，还可以选自能够控制单子叶种子的一种或多种种传病原体或土传病原体的种群的活生物试剂。优选地，通过使其不能繁殖的生物试剂或通过将其杀死而减少在单子叶种子上或紧邻单子叶种子的土传病原体的种群。为在单子叶种子上有用的化学品的在本发明中有用的生物试剂的实例包括最常用于储藏的谷物种子的有效地对抗节肢动物的那些化学试剂，所述节肢动物例如米象(Sitophilus oryza)；谷象(Sitophilus granaries)；谷蠹(Rhyzopertha dominica)；麦蛾(Sitotroga cerealella)；大谷盗(Tenebroides mauritanicus)；锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)；扁谷盗(Cryptolestes pusillus)；面象虫(Tribolium species)；皮蠹(Trogoderma species)；绿豆象，多种豆和豇豆象鼻虫；印度谷螟虫(Plodia interpunctella)；和粉斑螟蛾(Ephestia cautella)。在本发明中有用的适合的化学品的实例可以选自拟除虫菊酯，例如α-氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、[氰基-(3-苯氧基苯基)-甲基]-3-(2,2-二溴乙烯基)-2,2-二甲基-环丙烷-1-甲酸酯(溴氰菊酯)、和τ-氟胺氰菊酯；有机磷酸酯例如毒死蜱(二乙氧基-亚硫烷基-(3,5,6-三氯吡啶-2-基)氧基-l^{5}-膦)、马拉硫磷(二乙基-2-二甲氧基膦基-硫代基-硫烷基丁二酸酯)、蝇毒磷(3-氯-7-二乙氧基膦基硫代基氧基-4-甲基香豆素)、和司替罗磷([(E)-2-氯-1-(2,4,5-三氯苯基)乙烯基]二甲基磷酸酯)；氨基甲酸酯例如阿米曲拉(N-(2,4-二甲基苯基)-N-[(2,4-二甲基苯基)亚氨基甲基]-N-甲基甲脒)；spinosans例如多杀菌素(Dow Agrichemical，France)；γ-氨基丁酸(GABA)抑制剂例如氟虫腈(5-氨基-1-[2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基]-4-(三氟甲基亚硫酰基)吡唑-3-腈)；新烟碱类例如吡虫啉(N-[1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-4,5-二氢咪唑-2-基]硝酰胺)；邻氨基苯甲酰胺类，7-羟基-4'-甲氧异黄酮类例如7-羟基-3-(4-甲氧基苯基)色酮；精油例如茶树油，百里香油(也被称为百里香酚)、香茅油、和薄荷醇，以及昆虫生长调节剂例如甲氧虫酰肼(N-叔丁基-N'-(3-甲氧基-邻-甲苯酰基)-3,5-二甲基苯甲酰肼)等。

可以用于本发明的包衣组合物的在本领域中通常被称为“生物拮抗剂”的活生物试剂(也被称为生物防治生物或生物防治剂)的实例包括假单胞菌属种(Pseudomonas spp.)例如用于大麦和燕麦和其他单子叶植物的绿针假单胞菌(P. Chlororaphis)(可获自BioAgri AB，Uppsala，Sweden)、伯克氏菌属种(Burkholderia spp.)例如用于大麦、高粱和小麦的Wisconsin型洋葱伯克氏菌(B. cepaciatype Wisconsin) (作为“Deny”而获自Stine Microbial Products, Memphis, USA；和用于玉米的作为“Intercept”而获自Soil Technologies Corp., Fairfield, USA)的洋葱伯克氏菌)。

本领域技术人员了解，本发明的组合物还可以直接添加至其中将种植本文所定义的植物结构的土壤或生长介质。这样的组合物可以作为粉末添加并与土壤混合或使用常规的步骤作为液体悬浮剂施用。

对于本发明的目的，土传病原体是能够定殖于种子外皮的病原体和/或存活于土壤中并且能够对单子叶种子起作用的病原体。这样的土传病原体通常为细菌和/或真菌。攻击单子叶植物的土传细菌和真菌病原体的实例包括丝核菌属种(Rhizoctonia spp.，例如对玉米；和稻；高粱；小麦；大麦；燕麦；和黑麦具有活性的立枯丝核菌(R. microsclerotia))，曲霉属种(Aspergillus spp.)例如黄曲霉(A. flavus)和黑曲霉(A. niger) (例如对玉米具有活性)，腥黑粉菌属种(Tilletia spp.)例如小麦腥黑粉菌(T. tritici)和光腥黑粉菌(T. laevis)(例如对小麦具有活性)，指疫霉属种(Sclerophthora spp.)例如玉米褐条霜霉病菌(S. rayssiae)和禾生指梗霉(S. graminicola) (例如对玉米具有活性)，霜指霉属种(Peronosclerospora spp.)例如玉米霜霉病菌(P. sorghi)和自发指霜霉(P. spontanea) (例如对玉米具有活性)，腐霉属种(Pythium spp.)(例如对玉米；稻；高粱；小麦；大麦；燕麦；黑麦具有活性)，镰刀菌属种(Fusarium spp.)(例如对玉米；稻；高粱；小麦；大麦；燕麦；黑麦具有活性)，麦角菌属种(Claviceps spp.)例如黑麦麦角菌(C. purpurea)(例如对黑麦；黑小麦；小麦；和大麦具有活性)、C. africana (例如对高粱具有活性)、C. gigantean (例如对于米具有活性)，赤霉菌属种(Gibberella spp.)例如燕麦赤霉(G. avenacea) (例如对玉米具有活性)，荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glumae)(例如对稻具有活性)，褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae) (例如对稻具有活性)，指疫霉属种(Sclerophthora spp.)例如大孢指疫霉(S. macrospora) (例如对稻具有活性)，旋孢腔菌属种(Cochliobolus spp.)例如宫部旋孢腔菌(C. miyabeanus) (例如对稻具有活性)，镰刀菌属种(Fusarium spp.)(针对稻、燕麦、小麦；玉米具有活性)等。

根据本发明的另一个方面，提供了蜡的有机载体颗粒在制备如本文所定义的包含如本文前述所定义的生物试剂的包衣组合物中的应用。在本发明此方面的优选方案中，所述包衣组合物为种子包衣组合物。在本发明的此方面的另一个优选的方案中，所述包衣组合物为储藏器官包衣组合物，其中所述储藏器官选自块茎、块状根、球茎、鳞茎、和根茎。所述有机载体颗粒选自天然蜡、合成蜡和无机蜡，其具有≥50℃的熔点，更优选≥60℃，且最优选地由具有≥70℃的熔点的硬蜡构成。在本发明此方面中有用的适合的蜡可以选自蜡，例如巴西棕榈蜡、蜂蜡、褐煤蜡、白蜡、紫胶蜡、鲸蜡、十六酸蜂花酯、鲸蜡醇十六酸酯、小烛树蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡、羊毛蜡、甘蔗蜡、retamo蜡和米糠蜡，或其两种或多种的混合物。优选地，在本发明此方面中使用的种子包衣包括巴西棕榈蜡作为有机载体。优选地，在本发明的此方面中，所述有机载体颗粒具有≥5μm的平均体积直径，例如在≥8μm-200μm的范围内，如本文所述。

在本发明的第三个方面，提供了蜡作为颗粒形式的有机载体在本发明所述的单子叶种子包衣组合物中的应用。在本发明的此方面中，所述有机载体颗粒选自天然蜡、合成蜡和无机蜡，其具有≥50℃的熔点，更优选≥60℃，且最优选地由具有≥70℃的熔点的硬蜡构成。在本发明此方面中有用的适合的有机载体颗粒可以选自巴西棕榈蜡、蜂蜡、褐煤蜡、白蜡、紫胶蜡、鲸蜡、十六酸蜂花酯、鲸蜡醇十六酸酯、小烛树蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡、羊毛蜡、甘蔗蜡、retamo蜡和米糠蜡，或其两种或多种的混合物。优选地，在本发明此方面中有用的蜡载体颗粒包含巴西棕榈蜡的有机载体颗粒。仍优选地，在本发明此方面中有用的有机载体颗粒具有≥8μm的平均体积直径，例如在≥10μm-200μm的范围内。

在本发明的第四个方面，提供了制备如本文所述的种子包衣组合物的方法，其包括：

(1) 选择有机载体物质，其中所述载体物质选自具有≥50°摄氏度的熔点的蜡；

(2) 将所述有机载体物质粉碎为期望的平均体积直径≥5μm的颗粒，例如平均体积直径在≥8μm-200μm的范围内的颗粒；和

(3) 将生物试剂添加至步骤2)的产品颗粒。

在本发明此方面中有用的生物试剂选自化学试剂，其为杀节肢动物剂例如杀昆虫剂或杀螨剂或其混合物，或化学杀真菌剂，或真菌物种和/或细菌物种或其一种或多种的混合物。适合的真菌物种和细菌物种是已知的，且可以选自用于小麦的木霉属种(Trichoderma spp.)例如哈茨木霉(Trichoderma harzanium)，和用于小麦的杆菌属种(Bacillus spp.)例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)，和假单胞菌属(Pseudomonas)物种，例如用于小麦的荧光假单胞菌(P. fluorescens)和用于大麦和燕麦和其他单子叶植物的绿针假单胞菌(P. Chlororaphis)(可获自BioAgri AB, Uppsala, Sweden)，伯克氏菌属种(Burkholderia spp.)例如用于大麦、高粱和小麦的Wisconsin型洋葱伯克氏菌(作为“Deny”可获自Stine Microbial Products, Memphis, USA；和用于玉米的作为“Intercept”而获自Soil Technologies Corp., Fairfield, USA的洋葱伯克氏菌)等。

适合的杀真菌剂为已知用于单子叶种子处理，用于玉米的包括咯菌腈[4-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧代-4-基)-1H-吡咯-3-腈]、精甲霜灵[N-(甲氧基乙酰基)-N-(2,6-二甲苯基)-D-丙氨酸甲酯]、嘧菌酯[(2E)-2-{2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧基]苯基}-3-甲氧基丙烯酸甲酯]、克菌丹[(3aR,7aS)-2-[(三氯甲基)硫烷基]-3a,4,7,7a-四氢-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮]、萎锈灵[5,6-二氢-2-甲基-1,4-氧硫杂环己二烯-3-甲酰苯胺]、代森锰[亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锰(聚合的)]、甲霜灵[N-(甲氧基乙酰基)-N-(2,6-二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、恶霜灵[2-甲氧基-N-(2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基)乙酰-2',6'-二甲苯胺]、PCNB [五氯硝基苯]和福美双[二硫化四甲基秋兰姆或二硫化双(二甲基硫代氨基甲酰)]；用于稻的包括萎锈灵[5,6-二氢-2-甲基-1,4-氧硫杂环己二烯-3-甲酰苯胺]、代森锰锌[亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锰(聚合的)与锌盐的复合物]、甲霜灵[N-(甲氧基乙酰基)-N-(2,6-二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、和PCNB [五氯硝基苯]和福美双[二硫化四甲基秋兰姆或二硫化双(二甲基硫代氨基甲酰)]；用于高粱的包括克菌丹[(3aR,7aS)-2-[(三氯甲基)硫烷基]-3a,4,7,7a-四氢-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮]、代森锰锌[亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锰(聚合的)与锌盐的复合物]、甲霜灵[N-(甲氧基乙酰基)-N-(2,6-二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、恶霜灵[2-甲氧基-N-(2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基)乙酰-2',6'-二甲苯胺]、和PCNB [五氯硝基苯]；用于小麦的包括克菌丹[(3aR,7aS)-2-[(三氯甲基)硫烷基]-3a,4,7,7a-四氢-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮]、噻苯达唑(也被称为TBZ)[2-(噻唑-4-基)苯并咪唑或2-(1,3-噻唑-4-基)苯并咪唑、甲霜灵[N-(甲氧基乙酰基)-N-(2,6-二甲苯基)-DL-丙氨酸甲酯]、恶霜灵[2-甲氧基-N-(2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基)乙酰-2',6'-二甲苯胺]和三唑醇[(1RS,2RS;1RS,2SR)-1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丁-2-醇]；和用于大麦、燕麦和黑麦的包括抑霉唑(RS)-1-(β-烯丙氧基-2,4-二氯苯乙基)咪唑或(RS)-1-(2,4-二氯苯基)-2-咪唑-1-基乙基烯丙基醚、代森锰锌[亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锰(聚合的)与锌盐的复合物]、代森锰[亚乙基双(二硫代氨基甲酸)锰(聚合的)]、PCNB [五氯硝基苯]、福美双[二硫化四甲基秋兰姆或二硫化双(二甲基硫代氨基甲酰)]、三唑醇 (1RS,2RS;1RS,2SR)-1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丁-2-醇、和苯醚甲环唑 3-氯-4-[(2RS,4RS;2RS,4SR)-4-甲基-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)-1,3-二氧戊环-2-基]苯基-4-氯苯基醚。

适合的杀昆虫剂也为已知用于单子叶作物作为种子处理，例如用于稻和玉米的噻虫嗪[(EZ)-3-(2-氯-1,3-噻唑-5-基甲基)-5-甲基-1,3,5-噁二嗪-4-亚基(硝基)胺]；用于玉米和谷类作物(黑麦、小麦、燕麦和黑小麦)的吡虫啉[(E)-1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基咪唑烷-2-亚基胺]、灭虫威[4-甲基硫代-3,5-二甲苯基甲基氨基甲酸酯]、和硫双威[(3EZ,12EZ)-3,7,9,13-四甲基-5,11-二氧杂-2,8,14-三硫杂-4,7,9,12-四氮杂十五烷-3,12-二烯-6,10-二酮]，和用于玉米和谷类(黑麦、燕麦、小麦和黑小麦)的噻虫胺[(E)-1-(2-氯-1,3-噻唑-5-基甲基)-3-甲基-2-硝基胍]，用于小麦的氯氰菊酯[(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1RS,3RS;1RS,3SR)-3-(2,2-二氯乙烯基)-2,2-二甲基环-丙烷甲酸酯或(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1RS)-顺式-反式-3-(2,2-二氯乙烯基)-2,2-二甲基环丙烷甲酸酯]。

在本发明此方面中，所述有机载体物质可以选自蜡，例如选自本文前述的那些蜡。适合的蜡可以选自蜡，例如巴西棕榈蜡、蜂蜡、褐煤蜡、白蜡、紫胶蜡、鲸蜡、十六酸蜂花酯、鲸蜡醇十六酸酯、小烛树蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡、羊毛蜡、甘蔗蜡、retamo蜡和米糠蜡或其两种或多种的混合物。优选地，在本发明此方面中有用的蜡载体颗粒包含巴西棕榈蜡、小冠巴西棕蜡、和米糠蜡或其两种或多种的混合物的干燥颗粒。优选地，所选择的载体物质为巴西棕榈蜡。

在本发明的另一个方面，提供了通过如本文所述的方法制备的种子包衣组合物。

在本发明的另一个方面，提供了如本文所述的包衣组合物，其用于单子叶种子。

在本发明的另一个方面，提供了使用包衣组合物包衣单子叶种子的方法，所述包衣组合物包含有机载体物质和对一种或多种真菌性病原体、细菌性病原体和节肢动物病原体的生物拮抗剂，以限制由所述病原体对所述单子叶种子造成的伤害，所述方法包括将生物拮抗剂添加至有机载体物质，其中所述有机载体物质为干燥颗粒的形式，将所述两种组分混合在一起，并以干燥颗粒的形式将所得组合物施用至单子叶种子。因此，在本发明中有用的种子包衣组合物以干燥颗粒的形式施用。自然地，本领域技术人员了解，所述有机载体物质还可以包含添加的色素、增塑剂，和如本文所述的其他次要组分。在可选方案中，可以如本文所述以液体形式施用种子包衣，并且随后将种子干燥，在种子上时留下干燥颗粒形式的包衣组合物。然而，为了易于施用和保持低的生产成本，优选以干燥的颗粒形式施用包衣组合物。在本发明此方面中的有机载体物质可以选自巴西棕榈蜡、蜂蜡、褐煤蜡、白蜡、紫胶蜡、鲸蜡、十六酸蜂花酯、鲸蜡醇十六酸酯、小烛树蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡、羊毛蜡、甘蔗蜡、retamo蜡和米糠蜡或其两种或多种的混合物。优选地，所述有机载体物质为干燥颗粒形式的巴西棕榈蜡。

本发明此方面中的处理组合物包括一种或多种生物试剂，其选自如本文前述的化学杀节肢动物剂例如杀昆虫剂和杀螨剂、杀真菌剂、杀细菌剂和活生物试剂。

以下为说明本发明的实施例。应理解所述实施例不以任何方式解释为限制本发明。

图1：小麦上的木霉属孢子负荷。

实施例部分

通过使用拮抗剂的实例，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、荧光假单胞菌和枯草杆菌[可得自英国国家菌种保藏中心(UKNCC)]，控制小麦(Triticum aestivum)的链格孢属种(Alternaria sp.)[可得自英国国家菌种保藏中心(UKNCC)]。

链格孢叶枯病

症状

最低的叶总是最先显示出感染的迹象，其逐渐地传播至较高的叶。所述疾病首先使其外观呈现不规则地分散于叶上的小的、椭圆形的、变色的损伤。随着它们扩大并变为深褐色至灰色的颜色，斑点变得不规则。随着疾病的发展，若干斑点变得愈加靠近并且覆盖大片的叶面积，最终导致整片叶的死亡。有时在斑点周围看到浅黄色边缘区域。在严重侵袭的情况下，叶鞘、芒、和颖片也被感染。

在此阶段，在潮湿的条件下，所述真菌的黑色粉末状孢子覆盖所述损伤。这些孢子通过风传播，并且导致健康的叶和植物上的疾病。所述疾病在温暖和湿润的条件下传播极为迅速。被严重感染的田地显示出烧焦的外观。

常规的种子处理的缺陷

i) 有限的给药能力–可以施用的农药的量受到实际将有多少粘在种子上的限制。

ii) 有限的保护持续时间–由于施用至种子的生物试剂(例如化学试剂)的量相对较少，随着植物生长的生物试剂的稀释，以及生物试剂的破坏，所述持续时间通常较短。

iii) 经处理的种子的保存期限有限–由于经处理的种子的保存期限可能是有限的，因此生产过量的经处理的种子是不期望的。对于谷物，多余的经处理的种子无法出售。

在施用至种子的是休眠的微生物的这种情况下，通过包含作为用于生物试剂的载体的巴西棕榈蜡颗粒，所有的这三种限制都可以被克服或显著降低。在有利的条件下，所述微生物在发育的种子或幼苗的外部生长和定殖。生物试剂可有助于减少种子腐烂、幼苗疾病或根腐病。

进行以下测试以检验包含巴西棕榈蜡颗粒的潜在作用。

阶段1 –分离培养物

1. 培养物保持

使用指定有登记号的各分离物的继代培养物保持纪录。与所述继代培养物有关的所有的平板和载玻片都用登记号标记。

此外，由各原始培养物制备永久性的乳酚(LP)装片，并归档以用于参照目的。

在经过活的宿主继代之前，发生不多于三代的继代培养，并重新分离以保持所述生物的适合度。

在4℃下，将继代培养物在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上储藏以备将来使用。

对各分离物指定登记号，并用此号码标记继代培养物。

提取DNA用于同一性验证，并在-20℃下储藏。在-20℃下将纯培养物的参照样品储藏于甘油上。一旦完成实验，重复培养物的DNA鉴定以确认所述生物在工作期间未发生突变。

2. 致病剂的培养物

病原真菌从患病的组织至纯培养物的分离是鉴定和描述疾病的标准技术。它是证实先前未遇到的生物的病原性的必需步骤。

技术通常涉及：

a. 表面灭菌处理；

b. 使用适当的预防措施，涂布(可在选择性培养基上涂布)患病组织的样品；

c. 继代培养以得到纯培养物。

3. 培养物的纯化

将人工接种植物的小的消毒的根片在水琼脂上培养。最常出现的真菌菌落很可能是目标病原体。在被感染的植物组织中还可能存在多种腐生生物，并且它们可能与主要病原体一起生长入培养基中。常规的表面灭菌由以下组成：使用0.1%的次氯酸钠(NaOCl或有时被称为“NaClO”)溶液擦拭组织(或将组织浸入)，随后用无菌的蒸馏水漂洗。为了获得病原体的纯培养物，使用火焰烤过的环或手术刀从菌落的生长边缘获取小样品，并且划线在预倾倒的PDA平板的表面上。包含的30mg/l的氯霉素(抑制细菌的抗微生物剂)降低了细菌污染的风险。随着划线条斑在琼脂上发展，分离真菌孢子，直到获得单独的孢子，将由所述孢子生长出单独的菌落。

重复此步骤直至获得纯培养物。

4. 单独孢子的分离

单独孢子的分离对于研究病原变异性是重要的。将孢子的接种物置于包含10 ml无菌水的管中。将此孢子悬浮液延着薄的自来水琼脂培养基的表面上的标记线进行划线，并在22℃下温育。在24小时温育后，使用立体显微镜选择萌发的孢子，并每次将一个孢子转移至另一个琼脂平板。

5. 用于微观检验和参照的载玻片制备

病原体的鉴定：可以将组织切片或表面刮擦并随后在水/乳酚中装片。将宏观见到的真菌结构可以与待检验和鉴定的宿主组织分离。鉴定取决于孢子形成，并因此被感染的物质将在检验之前在潮湿的环境中温育过夜，以促进孢子形成。将棉染蓝染色添加至乳酚，以突出真菌结构。将样品置于载玻片上的一滴satin中，并且通过经过小火几秒而温和加热，之后在乳酚中装片。

为了容易鉴定，可以使用以下方法将整个封装切片清透和染色。

通过在管中的乳酚中将其加热直至清透(多至20分钟)而不沸腾，使得叶盘清透。通过在载玻片上在乳酚中的0.5%棉染蓝中加热5-10分钟而染色。在乳酚中彻底漂洗，并在乳酚中装片。

6. 生长和培养基

在一系列温度：13.5℃、18℃和22.5℃下评价继代培养物的生长和萌发。检验一系列的培养基的适合性。尽管PDA通常适于大多数的真菌物种，但已发现使用低营养琼脂例如自来水琼脂降低增殖性生长(prolific growth)，并且可以促进孢子形成。因此，在评价实验中包括PDA、自来水琼脂、和来自文献的选择性培养基Czapek's Dox琼脂(Dawson (1962) Saboutaudia 1. 214-219)。

使用经火焰烤的木塞穿孔器从活跃生长的培养物的边缘切下5mm直径的盘。将其颠倒置于预先倾倒的培养基平板的中心。对于每个培养基类型和温度制备5个重复(总计45个平板)。对各温育器中的平板施以完全的随机化。对平板进行观察，直至一个培养物成功地完全覆盖任一种培养基中的平板。此时进行以下测量：真菌菌落直径、颜色和边缘。此外，记录孢子形成的水平。

使用经火焰烤的木塞穿孔器从各平板切下五个5mm的盘，并悬浮于20ml的蒸馏水(+0.05% Tween 20?)中。随后将样品超声2分钟，以释放孢子，并随后漩涡以有助于均一的孢子悬浮液的形成。使用标准的计数方法，使用改善的Neubauer血球计评价样品的孢子浓度。

计算各培养基类型的平均值，并且应用ANOVA以检验结果的显著差异。

阶段2–体外研究：

1. 筛选微生物和巴西棕榈蜡以测定相互作用

为了解释观察到的作用，对比巴西棕榈蜡，筛选微生物、病原体和拮抗剂，以鉴定任何仅载体的作用。这将使得能够测定处理效果以及由于使用拮抗剂以及巴西棕榈蜡颗粒的应用而导致发生的任何协同作用。

a. 基于上述实验的发现，使用合适的培养基的平板。使用高压灭菌器将经空气研磨的巴西棕榈蜡灭菌，并随后使用双刀片磨研磨，产生具有近似VMD的颗粒。随后将经灭菌的培养基冷却至50℃(熔融阶段)。随后将巴西棕榈蜡引入培养基。测试两种浓度的巴西棕榈蜡：1g/l和10g/l。使用经火焰烤的木塞穿孔器从活跃生长的培养物的边缘切下5mm直径的盘。将其颠倒置于预先倾倒的培养基/巴西棕榈蜡平板的中心。对于每个浓度制备5个重复，并在生长/孢子形成的最优温度(如先前的实验中所测定)温育。使用获自上述生长和培养基实验的数据，将生长速率和特性与对照相比较。

使用ANOVA分析差异。

b. 将病原体的盘和拮抗剂与不同的巴西棕榈蜡处理剂一起粉化，并且置于适合的培养基上。为能够进行此实验，要求巴西棕榈蜡颗粒不含微生物。对经处理的生物和未经处理的生物的生长进行比较。

2. 研究针对病原体的拮抗作用

i. 拮抗剂对于链格孢属种菌丝体的生存力的作用(体外测试I)

在PDA或预先确定的培养基上，在双培养物测试中测试对抗病原真菌的所有拮抗性分离物。将链格孢属种和待测试的拮抗剂分离物的琼脂栓在9cm琼脂平板上以7cm间隔排列。在13.5℃、18℃和22.58℃下温育7天之后，评价抑制区域和重叠区域。当拮抗剂在链格孢属种的菌丝体上生长的情况下，通过显微镜(100x)研究两者之间的菌丝相互作用区域。将对于链格孢属种的菌丝体没有通过显微镜可见的作用的真菌菌株排除出进一步的实验。此外，在第一次接触后5天，通过将菌丝体盘转移至水琼脂平板上测试相互作用区域中链格孢属种的生存力。当通过显微镜(100x)观察到典型的菌丝生长时，将链格孢属种的菌丝体评价为有生存力。将各实验重复3次，每个重复使用3个样品。

ii. 拮抗剂对于体外产生的链格孢属种的菌核的萌发的作用(体外测试II)

将均一大小的链格孢属种的菌核置于真菌拮抗剂的6天龄的培养物上(PDA, 20℃)。在20℃下温育14、28和35天之后，将每个重复(每个拮抗剂三个重复)的8个菌核自琼脂平板转移至水琼脂。在光学显微镜下(100x)对由这些菌核的菌丝体生长进行评价。

3. 病原性的确认

实施Koch法则的步骤(Koch 1890，设计用于建立致病微生物和疾病之间的致病关系的标准)。

a) 描述由患病的作物植物表现的症状。

b) 分离可疑的病原体—相同的培养物应由具有相似症状的植物分离。

c) 获得纯培养物并使用其接种健康的植物物质。

d) 观察由接种的植物表现的症状—症状应与初始地在作物植物中观察到的那些症状相同。

e) 自新患病的物质再次分离病原体。培养物应与初始的纯化的培养物相同。

i. 间接施用–植物

使用健康的植物–可以使用由纯琼脂培养物或由烧瓶中生长的培养物制备的孢子悬浮液直接地对土壤进行接种。可以在萌芽后添加真菌孢子或细菌悬浮液，使得根系统被悬浮液浸透。随后观察植物7天并记录症状。实施Koch法则以确认症状与接种的病原体有关。

ii. 直接施用–种子

用于制备孢子悬浮液的接种物在包含无菌种子的水琼脂上生长。从菌落刮出真菌孢子和菌丝或细菌孢子和营养生长物并转移至无菌水。随后将此孢子悬浮液施用至种子并混合以确保均一的分布。随后将种子：

● 置于潮湿的滤纸上并在最优生长温度下温育5天。

● 播种在热灭菌的盆栽堆肥中，并在最优生长温度下在种子箱中温育7天。

记录两组实验的症状表现和萌发，并实施Koch法则。

4. 巴西棕榈蜡/拮抗剂协同定位分析

使用孢子分离器制备孢子的干燥粉末配制物。使用除湿器和二氧化硅小球将配制物的含水量降低至低于5%。使用Neubauer血球计和标准化的计数方法测定孢子浓度。

在Boyes微粉化方法中的空气研磨中的步骤(用于具有约25μm和75μm的VMD的巴西棕榈蜡颗粒)

1. 首先，根据制造商的说明，在KT Handling Ltd 04型粗磨机(序列号729/C)中将2kg巴西棕榈蜡块粗磨成约4-6mm的片。

2. 随后，使粗磨的片经过Apex Construction Ltd 314.2型号粉碎磨(序列号A21306)并且将大小进一步减小至250-300um的范围。

3. 随后，根据制造商的说明，使粉碎的颗粒经过Hosokawa Micron Ltd Alpine 100AFG喷射磨(序列号168092)，将磨设定在适合的速度(对于具有15μm的VMD的颗粒，速度为8000rpm或对于具有75μm的VMD的颗粒，速度为2500rpm)，以及0.03巴的正系统压力。

4. 将研磨空气保持在6巴，将系统冲洗空气流和分级轮间隙冲洗空气均设定为最小0.5巴且不高于0.75巴，清洁空气过滤器将记录不多于5巴的δ，以获得所需的具有15um或75μm的VMD的最终粒度。

在三个负荷(见下文)下将Entostat与小麦种子组合。

对分别具有15μm和75μm的VMD的两种大小的巴西棕榈蜡颗粒，以两种不同比例(1:3、2:2)与孢子配制物组合进行检验。使用电子显微照相术分析巴西棕榈蜡/孢子混合物的样品，以确定协同定位作用。记录观察到的任何变化。

此外，将提及的两种大小的巴西棕榈蜡均与菌丝体的均质化样品混合，并如上所述进行检验。

5. 巴西棕榈蜡颗粒负荷

通过使用显微照相术(定性)和荧光分析(定量)估算粘附到种子的巴西棕榈蜡颗粒。使用分别具有15μm和75μm的VMD的两种大小的巴西棕榈蜡颗粒(含1% glo-brite)。四种组合：两种比例的巴西棕榈蜡/孢子配制物，以及一种菌丝体和赋形剂对照(仅巴西棕榈蜡)，产生总计八种处理。将处理施用至10g种子并重复三次。由各次重复获取三个子样品，并将平均值用于分析。

对于荧光分析，将三个1g样品各自添加至5ml乙醇，并超声处理以有助于巴西棕榈蜡颗粒自种子的释放。使用Perkin Elmer L55荧光计(Perkin Elmer, Ma, USA)分析样品。使用ANOVA进行处理之间的差异的统计学分析。

作物物种之间的种子大小和结构显著地不同，且这影响施用比率和方法。通过将种子和巴西棕榈蜡配制物在置于Wheaton辊上的圆筒中翻转5分钟而获得均质的混合物，所述圆筒通过包含具有角度的内部轮叶而适于产生侧向混合/翻转。

阶段3–体内：

将链格孢属种以及最成功的拮抗剂模型用于一系列的体内试验。基本设计是温度为主区因素(13.5℃、18℃和22.5℃)且巴西棕榈蜡/拮抗剂比例(3种处理：2x孢子，1x菌丝体)为子区因素的裂区试验。使用上述方法制备各处理的4个均质混合物，并且这些表示重复次数。

处理：

1) 施用比率1–7.5 x 10⁶分生孢子kg^-1

2) 施用比率2–7.5 x 10⁸分生孢子kg^-1

3) 施用3–菌丝体

4) 对照1–赋形剂对照(仅巴西棕榈蜡)

5) 对照2–无处理

混合物(真正的重复)：A、B、C、D

各混合物的子样品：α、β、γ

根据随机的区组设计安排混合物和处理。

盆栽研究

各温度(生长室)包含60个植物盆栽。

根据供应商的建议播种经处理的种子。在用10ml链格孢属种孢子悬浮液接种之前，将土壤/堆肥(1:1 John Innes 2号和泥炭堆肥)热灭菌，并在播种前充分混合。

将植物置于生长室中21天的时间，并在萌芽后每48小时观察症状表现。通过毛细作用垫施水，每天两次。

在21天后，将植物自其盆中移出，并进行以下评价测量：

● %萌发

● %萌芽前立枯病

● %萌芽后立枯病

● 根重

● 芽重。

此外，基于损伤等级评价症状表现。

对每种处理，使用ANOVA，比较由子样品α、β、γ获得的测量的平均值。

自显示症状的5个植物获得样品并实施Koch法则以确认致病生物(通过与主培养物的参考载玻片进行比较)。

重复进行实验。

第二实施例

使用咯菌腈，通过种子处理的方式控制小麦上的禾生腐霉菌(Pythium graminicola) [英国国家菌种保藏中心(UKNCC)]。

实验设计–如上述实施例1中的盆栽研究

使用铜平底锅熔化巴西棕榈蜡。在冷却过程中，添加巴西棕榈蜡质量的1%的咯菌腈。在如上所述，允许此混合物固化，随后，通过空气磨刨削和加工，不同之处在于将速度设定在6000 rpm，以制备具有25μm的VMD的颗粒。

用于盆栽研究的处理-

对照1–赋形剂对照(仅巴西棕榈蜡)

对照2–无处理

处理1–每kg种子10g 1%咯菌腈巴西棕榈蜡

处理2–每kg种子3.2g 1%咯菌腈巴西棕榈蜡

评价和分析与先前的盆栽研究相同。

第三实施例

涉及：

使用噻虫嗪，通过种子处理的方式控制在小麦上掠食的小麦金针虫种(Agriotes mancus spp.，鞘翅目：叩甲科)，或小麦线虫(磕头虫的幼虫形式)。

早季线虫损害由被挖空的种子组成，其中，幼虫已在萌发期间进入。幼苗植物也可能受到钻入在土壤线下的植物的幼虫的损伤或被其杀死。偶尔地，线虫钻入较大的植物的茎，并掘入几英寸，但损害不显著。

实验设计–如上述盆栽研究

使用铜平底锅熔化巴西棕榈蜡。在冷却过程中，添加巴西棕榈蜡质量的1%的噻虫嗪。在如上所述，允许此混合物固化，随后，通过磨刨削和加工(速度设定在6000 rpm)，以制备具有25μm的VMD的颗粒。

用于盆栽研究的处理-

对照1–赋形剂对照(仅巴西棕榈蜡)

对照2–无处理

处理1–每kg种子4.2g 1%噻虫嗪巴西棕榈蜡

处理2–每kg种子1.3g 1%噻虫嗪巴西棕榈蜡

在使用盆栽土填充之前，将空盆用尼龙网筛物质内衬。建立线框，并且将尼龙网筛在框上打结，以提供笼形的实验场所，其设计使得昆虫不能逃离处理的区域。

使种子萌发三天，随后将5只第三龄的幼虫添加至各盆的土壤表面，随后将筛笼重新密封。

观察进行21天。

评价植物的：

● %萌发

● 损害

● 根重 

● 芽重。

按照实施例1中详述的步骤，以检验哈茨木霉[英国国家菌种保藏中心(UKNCC)]、荧光假单胞菌[UKNCC]和枯草杆菌[UKNCC]对稻的真菌性病原体镰刀菌属种的拮抗作用。

按照实施例1中详述的步骤，以检验哈茨木霉[英国国家菌种保藏中心(UKNCC)]、荧光假单胞菌[UKNCC]和枯草杆菌[UKNCC]对高粱的真菌性病原体禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)的拮抗作用。

按照实施例2中详述的步骤，以检验甲霜灵对稻的真菌性病原体腐霉属种的作用。

按照实施例2中详述的步骤，以检验咪鲜胺对高粱的真菌性病原体丝核菌属种的作用。

按照实施例3中详述的步骤，以检验噻虫嗪对高粱的害虫，蛴螬(长毛食叶然金龟，Phyllophaga crinite)的作用。

按照实施例3中详述的步骤，以检验吡虫啉/β-氟氯氰菊酯对稻的害虫，稻种摇蚊(林间环足摇蚊，Cricotopus sylvestris)的作用。

使用包含木霉属种和巴西棕榈蜡颗粒的种子包衣抑制小麦中真菌性疾病的致病剂

木霉属种(子囊菌门(Ascomycota))作为生物防治剂在抗植物病原体的防御中的潜能是已知的。

木霉菌丝能够穿透其他真菌的菌丝并且自其中抽取营养，导致对宿主的抑制并最终导致其死亡。木霉显示出快速的菌丝体生长并且能够与其他真菌竞逐养分。

有多种作为作物保护产品销售的可商购的木霉配制物。这些配制物通常作为可湿的粉末配制物供应并且作为浸液(drench)施用至种植区域。此施用形式的缺陷在于必须处理整个种植区域，而需要所述处理的是紧紧围绕种子或植物的区域。递送至此区域的分生孢子的数量越大，它们能够给予的控制水平越高。因此，在木霉的应用中，能够将足量的分生孢子递送至要求的区域的靶向施用系统提供优于常规施用的明显优势。

实验目标：为评价Entostat作为种子包衣技术用于递送有益的微生物的潜在应用

方法

在Boyes微粉化方法中的空气研磨中的步骤(用于具有约10μm的VMD的巴西棕榈蜡颗粒)。

1. 首先，根据制造商的说明，在KT Handling Ltd 04型粗磨机(序列号729/C)中将2kg巴西棕榈蜡块粗磨成约4-6mm的片。

2. 随后，使粗磨的片经过Apex Construction Ltd 314.2型号粉碎磨(序列号A21306)并且将大小进一步减小至250-300um的范围。

3. 随后，根据制造商的说明，使粉碎的颗粒经过Hosokawa Micron Ltd Alpine 100AFG喷射磨(序列号168092)，将磨设定在12500rpm的速度，和0.03巴的正系统压力。

4. 将研磨空气保持在6巴，将系统冲洗空气流和分级轮间隙冲洗空气均设定为最小0.5巴且不多于0.75巴，清洁空气过滤器将记录不多于5巴的δ，以获得具有9.7μm的VMD的最终粒度。

在三个负荷(见下文)下将Entostat与小麦种子组合。

1. 基线数据：种子包衣技术

1.1 种子包衣。使用具有9.7μm的VMD的巴西棕榈蜡颗粒，将具有95%的萌发百分比的哈茨木霉(包含7.75x10⁹菌落形成单位g^-1，Sylvan Bio, Loches, France)施用至小麦(品种：Hereward，Herbiseeds，Twyford，UK)。基于获自文献的信息，将目标负荷设定为每粒种子10⁵个分生孢子。

以不同的比例将巴西棕榈蜡颗粒与干燥的分生孢子粉混合，并将0.01g (0.2质量%)直接施用至干种子，每个浓度5g种子。对于每个浓度，将10粒种子的四个批次用于评价分生孢子负荷。

使用的分生孢子与巴西棕榈蜡的比例为：

100%分生孢子、50%分生孢子、25%分生孢子和9%分生孢子，在各情况下剩余部分由巴西棕榈蜡颗粒构成。

1.2 计数。通过使用血球计(Improved Neubauer, Hawksley, Lancing, UK)进行直接计数以测定种子的分生孢子负荷。

接种物：悬浮液的制备。

通常在水载体中配制繁殖体，但具有疏水细胞壁的那些(例如木霉)不易悬浮于水中。为了使疏水的繁殖体均一地悬浮于水中，需要超声处理和/或使用机械悬浮方法。使用微型杵进行繁殖体的机械悬浮提供了分生孢子在水中的良好悬浮液，而没有导致对细胞的损害。表面活性剂也可有助于繁殖体的悬浮(0.05%的Tween20)。为了使疏水的分生孢子悬浮，将收获的分生孢子置于1.5ml微量离心管中，将≈0.5ml无菌水添加至所述管，将微型杵插入管中，并将分生孢子物质轻轻地用微型杵手动搅拌(防止分生孢子逸入空气中)。微型杵与电动机(例如Kontes，Argos球团研磨棒电动机)连接并且将悬浮液剧烈搅拌，同时将所述研磨棒上下移动和左右移动约30秒。由于血球计方法不能分辨有生存力的和无生存力的繁殖体，因此需要确定孢子生存力，由此可以在有生存力的繁殖体的基础上准备剂量。

对每个处理，在4个批次的种子上进行种子洗涤和木霉负荷的计数。通过置入Eppendorf管中的1ml无菌0.05% Tween²⁰ (或替代物–相似的非离子表面活性剂/分散剂)中，并且漩涡30秒以自种子表面除去分生孢子，从而将接种物从种子洗去。随后将样品超声处理两分钟以破坏任何分生孢子簇。将获得的计数用于计算由各种处理包衣的种子的平均分生孢子负荷。将使用100%分生孢子粉获得的结果用作基准，且将与其作比较的分生孢子/巴西棕榈蜡组合粉末作为对负荷的效率的测定。

通过在木霉特异性培养基(TSM)上的稀释铺板实现对分生孢子生存力的确认(参见下文)。设定稀释系列，并自所述系列接种平板，一式两份。7天后进行菌落形成单位(CFU)计数，允许对种子上的接种物水平进行定量。此外，将新鲜的未使用的分生孢子铺板，以提供种子施用之前和之后的对照。

还测量萌发百分比。通过将100μl中的约10⁶个分生孢子铺展在9cm皮式培养皿中的培养基上而获得令人满意的分生孢子密度。在25℃下将分生孢子在黑暗中温育5天，并且，随后使用乳酚将待观察的区域固定。使用倒置的复式显微镜的相差显微术使得能够对分生孢子进行充分检验。

如果芽管的长度为所研究的繁殖体的直径的两倍，则认为分生孢子是有生存力的。在任意选择的视野中或在平行的横断面中，对使用目镜测微计限定的萌发的和未萌发的分生孢子的数目进行计数。最少计数300个分生孢子以提供准确的估计。期望测定在一式两份的培养物上和相同平板上不同的位置处的繁殖体的生存力。

这允许对种子包衣技术进行校准以对于每种包衣方法，在种子上获得相似水平的木霉负荷。

1.3 种子萌发。在9cm皮式培养皿中，将来自每种处理的一个批次的种子(5粒种子)置于种子测试纸(Whatman 181)上。将培养皿用Parafilm密封并在20℃下保持7-10天，并测定萌发率。使用未处理的种子重复此步骤。

制备木霉选择培养基(改良自Williams, Clarkson等，2003)，如下所述：

对于1000ml

基础培养基成分：

0.2g MgSO₄           3.0g葡萄糖

0.9g K₂HPO₄          0.15g玫瑰红

0.15g KCl            20g琼脂

1.0g NH₄NO₃         950ml蒸馏水

基础培养基加工

在1L Erlenmeyer烧瓶中将液体成分与除琼脂以外的全部固体成分混合。添加20g琼脂并搅拌或震荡。用棉絮塞住并用金属箔覆盖。高压蒸汽灭菌。

灭菌培养基(每升)

0.25g 结晶的氯霉素       1.2ml霜霉威(Previcur)

0.2g 五氯硝基苯          50ml无菌蒸馏水

0.2g 克菌丹

种子重量

用作种子批次的均匀性的测量。对8个重复的25粒种子进行称量，并且记录变异系数(Cv)。此系数应不超过5的值。如果其超过5，则重复所述步骤，且将所有16个样品的平均值用于计算每克的种子数。

结果

使用血球计的直接计数

使用血球计测定的哈茨木霉干燥孢子配制物的初始孢子密度(在5%水含量)为7.75 x 10⁹个孢子g^-1 (n=4,±2.6 x 10⁷ 95%CL)。

种子洗液的孢子计数

*每粒种子10⁵个目标孢子

在如通过单路ANOVA测定的由不同处理获得的每粒种子的平均孢子计数之间存在明显且统计学显著的差异(F(3,12)= 190.83，p= <0.001)。所有处理都超过每粒种子10⁵个孢子的目标。

*期望的孢子计数由通过100%处理实现的平均孢子计数计算，假定为完美的分布。因此，预期50%处理将导致100%处理的孢子数的一半，等等。

**本质上是孢子附着效率的改善的量度。

由于实际的平均计数显著地超过基于100%孢子处理的预期的结果(t-检验)，因此添加高于50%的Entostat看来改善孢子与种子附着的效率。

萌发测定

平均分生孢子萌发(获自300个样品)

新鲜的分生孢子            276.50 ±10.85, n=4

种子洗液的分生孢子        275.25 ±6.02, n=4。

如通过单路ANOVA测定的，在新鲜分生孢子和自种子洗出的那些分生孢子的生存力之间没有统计学上显著的差异(F(1,6) = 0.04, p = 0.847)。

获自CFU计数的计数估计

血球计和CFU(对稀释矫正)计数的比较

不共享字母的平均值为显著不同的。

如通过单路ANOVA测定的，各组之间存在统计学上显著的差异(F(7,24) = 205.95, p = <0.001)。Tukey事后检验揭示显著性为孢子%的差异的结果而不是应用的计数方法的结果。

总结

对于所有处理，可以用超过目标10⁵个孢子种子^-1的木霉孢子包衣小麦种子。

由于被浪费或损失的孢子减少，使用比例高于1:1的Entostat增加孢子递送的效率。

孢子的萌发生存力不受其作为种子包衣的用途的影响。

通过使用血球计对孢子直接计数，或用过使用CFU计数的计数得到统计学上相似的结果，因此一旦已证明萌发生存力不受处理的影响则可以使用任一方法。

如上文提供的用于小麦的所述方法用于评价通过Entostat递送至大麦、黑麦、燕麦、玉米和黑麦草的孢子递送效率。根据负荷和种子大小，获得了相似或更佳的结果。

种子包衣对疾病抑制的作用

使用水或Entostat，用木霉将种子包衣，以获得约10⁵和10⁶ CFU种子^-1的负荷。水处理为孢子在无菌水中的悬浮液，其中将种子样品浸泡1小时。随后将种子干燥(可能的商业方案)，或湿包衣播种。分别以3:1和9:1的Entostat与孢子的比例施用Entostat。随后，比较种子处理方法保护萌发小麦幼苗免受小麦中的全蚀病的致病剂，禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)的侵害的能力。

用木霉接种种子。如下接种Hereward品种的小麦种子(每粒种子的目标浓度)：

1) 10⁵木霉/种子，使用水悬浮液(湿包衣)

2) 10⁶木霉/种子，使用水悬浮液(湿包衣)

3) 10⁵木霉/种子，使用水悬浮液(干包衣)

4) 10⁶木霉/种子，使用水悬浮液(干包衣)

5) 10⁵木霉/种子，使用Entostat，3:1

6) 10⁶木霉/种子，使用Entostat，3:1

7) 10⁵木霉/种子，使用Entostat，9:1

8) 10⁶木霉/种子，使用Entostat，9:1

9) 无木霉，仅水

10) 无木霉，仅Entostat

11) 仅种子。

计数。使用标准的稀释平板方法，在木霉特异性培养基上将木霉定量。这确认了处理1-8的每粒种子的CFU负荷。稀释平板一式两份地进行。

顶囊壳属的生物测定

接种物制备–使已知对于小麦、大麦、黑麦、燕麦和草坪草是致病性的顶囊壳属种(Gaeumannomyces sp.)在来自储用培养物的PDA平板上生长，并且在20℃下温育以制备积极生长的菌落。从平板取出琼脂塞，并用于接种在500ml Erlenmeyer烧瓶中的与马铃薯块(2 mm²，25g)混合的灭菌(在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟)的John Innes 2号盆栽混合物(80%水含量；60g)。将烧瓶在20℃下温育14天。使用稀释平板方法定量培养基中的接种物水平。

种子处理对顶囊壳菌的有效性。将种子播种在包含接种顶囊壳菌的培养基的播种盘的单个室中(约15ml/室)。将每个处理的十粒种子的四个重复的批次种植于室中。一经播种，即将盘置于在20℃且光照约16h的植物生长室(Weiss Gallenkamp Fitotron SG120)中。室的底部浇水。每3天记录存活的幼苗的数目，持续21天。

记录萌芽时间、成功萌芽百分比、和显示出症状的植物的百分比，并对结果进行分析。观察Entostat处理的种子和未处理的种子之间的差异。