柠檬酸杆菌多克隆抗血清、制备方法及其在检测沙门氏菌中的应用

摘要

本发明公开了一种柠檬酸杆菌多克隆抗血清及其制备方法以及在检测沙门氏菌中的应用，包括下列步骤：（1）柠檬酸杆菌免疫抗原的制备；（2）抗原接种；（3）多克隆抗血清的采集；柠檬酸杆菌多克隆抗血清在检测沙门氏菌中的应用包括含有柠檬酸杆菌多克隆抗血清的沙门氏菌选择性增菌培养基及其沙门氏菌方法。本发明的多克隆抗血清可降低甚至完全抑制增菌液中柠檬酸杆菌的数量，从而消除因柠檬酸杆菌的存在而给沙门氏菌的检测带来的干扰，最终提高沙门氏菌分离鉴定的准确性，适用于现行的包括前增菌和选择性增菌步骤的沙门氏菌检测标准。该方法具有操作简单、结果准确可靠等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种柠檬酸杆菌多克隆抗血清、制备方法及其在检测沙门氏菌中的应用，属 于沙门氏菌检测技术领域。

背景技术

沙门氏菌是当前公共卫生上重要的肠道致病菌之一，同时也是引起动物肠道传染病的致 病菌之一。目前对于沙门氏菌的检测方法多使用常规的细菌分离鉴定，即先采用非选择性增 菌、选择性增菌、分离和鉴定等步骤。通常在分离过程中会出现干扰菌，柠檬酸杆菌即是其 中之一，而且出现的几率较大。柠檬酸杆菌的出现会降低沙门氏菌分离鉴定的准确性，因此， 如果能够抑制增菌过程中柠檬酸杆菌的生长，则能够明细提高沙门氏菌分离鉴定的准确性。

发明内容

为了抑制柠檬酸杆菌的存在而给沙门氏菌的检测带来的干扰，最终提高沙门氏菌分离鉴 定的准确性；本发明所要解决的技术问题提供一种改进的沙门氏菌的检测方法，同时提供柠 檬酸杆菌的多克隆抗血清及其制备方法，并提供一种含有柠檬酸杆菌多克隆抗血清的沙门氏 菌选择性增菌培养基。

特异性抗血清可在体外特异性地对相应的目标微生物进行抑制并杀灭，该发明即利用该 原理展开的沙门氏菌检测技术的改进。

通过对临床3种样本共526份样品的应用结果显示，该方法可提高沙门氏菌分离鉴定的 准确性从59.5%-100%，明显降低了沙门氏菌的假阳性率。因此，该方法可应用于沙门氏菌的 分离鉴定。具体结果见下表：

一种柠檬酸杆菌多克隆抗血清的制备方法，包括下列步骤：

（1）柠檬酸杆菌免疫抗原的制备

将柠檬酸杆菌接种于营养琼脂，37℃，12h，刮取菌苔于0.85%的生理盐水中，加入终浓 度为2%（v/v）的甲醛，感作37℃，24h，接甲醛感作的培养物接种营养琼脂进行无菌检测， 确定甲醛感作的培养物无活菌的情况后，测定培养物蛋白浓度，应确保培养物的蛋白浓度大 于2mg/mL，符合上述条件的情况下，以其为抗原；

（2）抗原接种

免疫接种新西兰大白兔，首免的接种剂量为2mg/只，第二次免疫于首免后7天进行，剂 量同首免；第三次免疫于第二次免疫后14天进行，剂量为首免的一半；第三次免疫后，采血 测定柠檬酸杆菌抗血清的效价，抗血清效价不低于1：1280时，采血；

（3）多克隆抗血清的采集

采集的血液先在室温放置30min，血液自然凝固后，放于37℃，12h，使血清析出，然后 将其放于4℃，1h，使血凝块收缩，以易于分离血清，随后将血清无菌分离到灭菌的离心管 中，所制备的血清可直接应用于沙门氏菌检测。

利用上述的方法制备的柠檬酸杆菌多克隆抗血清。

本发明还提供一种含有柠檬酸杆菌多克隆抗血清的沙门氏菌选择性增菌培养基，特征在 于，向制备好的沙门氏菌选择性增菌培养基中加入柠檬酸杆菌多克隆抗血清，混匀，即得到 含有柠檬酸杆菌多克隆抗血清的沙门氏菌选择性增菌培养基，该种培养基现用现配。

本发明还提供了一种利用上述的含有柠檬酸杆菌多克隆抗血清的沙门氏菌选择性增菌培 养基来检测沙门氏菌的方法，包括下列步骤：

（1）待检样品的前增菌

取25g待检样品无菌加入到225mL的灭菌缓冲蛋白胨水，37℃，12h；

（2）选择性增菌

向灭菌的沙门氏菌选择性增菌培养基（亚硒酸盐胱氨酸肉汤或TTB肉汤）中加入10mL 样品的增菌液，37℃，培养12h；

向灭菌的沙门氏菌选择性增菌培养基（氯化镁孔雀绿肉汤或TTB肉汤）中加入1mL样 品的增菌液，42℃，培养12h。

（3）取100uLSC（或TTB肉汤）的选择性增菌液加入到灭菌的EPENDOFF管中，加入40uL 柠檬酸多克隆血清、40uL乳兔补体和20uLHanks液，37℃，60min；取100uLMM的选择性 增菌液加入到灭菌的EPENDOFF管中，加入40uL柠檬酸多克隆血清、40uL乳兔补体和 20uLHanks液，37℃，60min；

（4）选择性分离

将培养后的选择性液接种于胆硫乳琼脂（DHL）、酚红黄绿琼脂、BS琼脂和XLD琼脂， 37℃，12h；

（5）可疑菌的纯培养

从选择性培养基上挑选可疑的沙门氏菌菌落，接种于营养琼脂，37℃，12h；

（6）可疑菌的鉴定

对于纯培养的培养物，进行生化鉴定或血清学鉴定；

（7）结果判定。

本发明属于沙门氏菌检测技术的改良，具体的是将制备的针对柠檬酸杆菌的多克隆抗血 清引入到沙门氏菌检测过程中，也就是在沙门氏菌的检测步骤的第2步和第3步之间，加入 一个步骤，取100uL的增菌液与40uL制备的柠檬酸杆菌多克隆血清、40uL乳兔补体和20uL 的Hanks液混合，37℃，60min后，再进行沙门氏菌的随后的步骤。该步骤的增加通过大量 的临床试验验证，能够明细提高沙门氏菌分离鉴定的准确性（59.5%～100%）。该多克隆抗血 清可降低甚至完全抑制增菌液中柠檬酸杆菌的数量，从而消除因柠檬酸杆菌的存在而给沙门 氏菌的检测带来的干扰，最终提高沙门氏菌分离鉴定的准确性。该方法为改良的沙门氏菌检 测技术，适用于现行的包括前增菌和选择性增菌步骤的沙门氏菌检测标准。该方法具有操作 简单、结果准确可靠等优点。

具体实施方式

具体实施方式一

按照GB/T13091-2002标准进行沙门氏菌的检测，步骤如下：

（1）待检样品的前增菌

取25g样品无菌加入到225mL的灭菌缓冲蛋白胨水，37℃，12h；同时各接种1mL的鼠 伤寒沙门氏菌（1×10⁵CFU/mL）和柠檬酸杆菌（1×10⁵CFU/mL）于2瓶225mL缓冲蛋白胨 水中，分别标记为A和B，A作为阳性对照；B作为阴性对照。

（2）选择性增菌及柠檬酸杆菌多克隆抗血清的添加

向灭菌的亚硒酸盐胱氨酸肉汤（SC）中加入10mL样品的增菌液；向氯化镁孔雀绿肉汤 （MM）中加入1mL的样品增菌液，42℃，培养12h。

（3）取100uLSC的选择性增菌液加入到灭菌的EPENDOFF管中，加入40uL柠檬酸多 克隆血清、40uL乳兔补体和20uLHanks液，37℃，60min；取100uLMM的选择性增菌液加 入到灭菌的EPENDOFF管中，加入40uL柠檬酸多克隆血清、40uL乳兔补体和20uLHanks 液，37℃，60min；

（4）选择性分离

将培养后的选择性液接种于胆硫乳琼脂（DHL）和酚红黄绿琼脂，37℃，12h。

（5）可疑菌的纯培养

从选择性培养基上挑选可疑的沙门氏菌菌落，接种于营养琼脂，37℃，12h。

（6）可疑菌的鉴定

对于纯培养的培养物，进行生化鉴定或血清学鉴定。

（7）结果判定

判定条件：A瓶（阳性对照）的结果是检出了鼠伤寒沙门氏菌，没有检出柠檬酸杆菌；B 瓶（阴性对照）同时检出了沙门氏菌和柠檬酸杆菌，当A、B两瓶对照符合上述结果时，实 验成立。实验组的鉴定结果以生化鉴定和/或血清学鉴定结果为准。

具体实施方式二

按照GB/T4789.4-2010标准进行沙门氏菌的检测，步骤如下：

（1）待检样品的前增菌

取25g样品无菌加入到225mL的灭菌缓冲蛋白胨水，37℃，12h；同时各接种1mL的鼠 伤寒沙门氏菌（1×10⁴CFU/mL）和柠檬酸杆菌（1×10⁴CFU/mL）于2瓶225mL缓冲蛋白胨 水中，分别标记为A和B，A作为阳性对照；B作为阴性对照。

（2）选择性增菌及柠檬酸杆菌多克隆抗血清的添加

向灭菌的10mL亚硒酸盐胱氨酸肉汤（SC）中加入1mL样品的增菌液，37℃，培养12h； 向10mL TTB肉汤中加入100uL的样品增菌液，42℃，培养12h；

（3）取100uLSC的选择性增菌液加入到灭菌的EPENDOFF管中，加入40uL柠檬酸多 克隆血清、40uL乳兔补体和20uLHanks液，37℃，60min；取100uLTTB的选择性增菌液加 入到灭菌的EPENDOFF管中，加入40uL柠檬酸多克隆血清、40uL乳兔补体和20uLHanks 液，37℃，60min；

（3）选择性分离

将培养后的选择性液接种于BS琼脂（DHL）和XLD琼脂，37℃，12h。

（4）可疑菌的纯培养

从选择性培养基上挑选可疑的沙门氏菌菌落，接种于营养琼脂，37℃，12h。

（5）可疑菌的鉴定

对于纯培养的培养物，进行生化鉴定或血清学鉴定。

（6）结果判定

判定条件：A瓶（阳性对照）的结果是检出了鼠伤寒沙门氏菌，没有检出柠檬酸杆菌；B瓶 （阴性对照）同时检出了沙门氏菌和柠檬酸杆菌，当A、B两瓶对照符合上述结果时，实验 成立。实验组的鉴定结果以生化鉴定和/或血清学鉴定结果为准。