金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清制备及在内分泌扰乱化学物质检测中的应用

摘要

自1990年代以来，世界各国开始重视内分泌扰乱化学物质的研究，并建立了多种以鱼类(如Medaka、Fathead minnow和Zebrafish等)为模式生物的活体(invivo)筛选技术，而我国目前还没有建立以本土鱼类为模式生物的活体筛选系统。因而，本文选择以在我国广泛分布的观赏性鱼类——金鱼作为模式生物，在制备兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的基础上，开发了定性检测金鱼卵黄原蛋白的western-blot技术；并首次建立了以雄性金鱼卵黄原蛋白诱导产生为主要指标，以γ-谷胺酰转移酶和乳酸脱氢酶为辅助指标的环境雌激素筛选的指标体系，并成功地应用在多种农药的环境雌激素活性的检测中。 采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术，从E<,2>诱导的雄性金鱼血浆中分离、纯化了金鱼卵黄原蛋白，采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为卵黄原蛋白，该卵黄原蛋白在非变性条件下分子量约为440kDa，在SDS变性条件下分子量约为84和60 kDa。并利用分离、纯化的金鱼卵黄原蛋白，制备了兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清，开发了检测金鱼卵黄原蛋白的western-blot技术，1：2000倍稀释的多克隆抗血清对金鱼卵黄原蛋白的最低检出限为0.5 mgL<'-1>。 用0.05 mgL<'-1>Bw的17β-雌二醇腹膜注射雄性金鱼，诱导14 d后尾静脉取血，对血浆western-blot检测结果表明，17β-雌二醇能够诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的产生；且17β-雌二醇暴露造成了金鱼肝细胞核膨胀，脂滴大量积累，精巢内生精细胞团萎缩、纤维化，精子密度降低。 以雌性类固醇激素17β-雌二醇对雄性金鱼的雌激素作用为客观参照，用0.01，0.1和1.0 mg L<'-1>久效磷暴露雄性金鱼21 d，雄性金鱼血浆western-blot检测结果表明3个暴露浓度的久效磷均能诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的产生；3个暴露浓度的久效磷均造成了雄性金鱼生殖腺指数、单位精巢重γ-GTP酶活性、单位精巢重LDH酶活性有所降低，并随暴露浓度的增加活性下降明显；0.01 mg L<'-1>久效磷暴露组金鱼精巢支持细胞的细胞膜、核膜和线粒体嵴部分溶解，脂滴增加；0.1mg L<'-1>暴露组支持细胞超微结构的损伤加重,胞质内出现了髓磷脂象、脂滴更多。在0.01和0.1 mg L<'-1>暴露组,精子线粒体都出现溶解现象。首次以金鱼卵黄原蛋白为生物标志物与指示精巢及精子损伤相关的酶活性变化相结合,建立了环境雌激素活性筛选的综合指标体系,并确认久效磷具有环境雌激素活性。采用以上建立的环境雌激素活性筛选的综合指标体系,筛选四种拟除虫菊酯类农药(氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯和甲氰菊酯)和五种有机磷农药(氧乐果、甲基异柳磷、水胺硫磷、乙基对硫磷和辛硫磷)的环境雌激素活性。雄性金鱼血浆western.blot检测结果表明四种拟除虫菊酯类农药能够诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的产生,且抑制了γ-谷胺酰转移酶和乳酸脱氢酶活性,造成了生殖腺指数下降,因而具有潜在的环境雌激素活性。而五种有机磷农药不能诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的产生,且对精巢γ-谷胺酰转移酶、乳酸脱氢酶活性和生殖腺指数无明显影响,因而在0.1:mg L<'-1>浓度暴露下可能不具有环境雌激素的活性。 利用分离纯化的鲫鱼和鲤鱼卵黄原蛋白,采用western-blot技术证明这两种鱼类的卵黄原蛋白能够与兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清发生交叉反应,该结果表明本文制备的兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清具有较广泛的应用范围。

目录

文摘

英文文摘

0前言

1鱼类卵黄原蛋白分离纯化、检测技术及环境雌激素作用途径研究进展

2金鱼卵黄原蛋白的分离纯化及性质鉴定

3金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的制备及鉴定

4E2诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的分泌

5久效磷诱导雄性金鱼分泌卵黄原蛋白的研究

6多种农药的环境雌激素活性的筛选

7鲫鱼和鲤鱼卵黄原蛋白的分离纯化及与兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的交叉反应

结论

参考文献

致谢

附录