抗Lp(a)单克隆抗体及Lp(a)胶乳增强免疫比浊检测试剂盒

摘要

本发明公开了抗Lp(a)单克隆抗体及Lp(a)胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。本发明提供了一株微生物保藏号是：CGMCC No.8509的稳定分泌抗Lp(a)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明杂交瘤细胞株能够稳定地生产抗Lp(a)单克隆抗体，可以实现自身配对、特异性结合Lp(a)且与Kringle IV-2无结合。LPa-3单抗所配Lp(a)试剂盒检测病人血清样本的试验表明，用本发明抗Lp(a)单克隆抗体制备的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒与市售试剂盒测值符合度高，准确度可靠，可以应用于Lp(a)的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株以及分泌的单克隆抗体，尤其涉及一种抗脂蛋白(a)[Lipoprtein(a),Lp(a)]的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明进一步Lp(a)胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，属于脂蛋白(a)的检测领域。 

背景技术

脂蛋白(a)［Lipoprotein(a)，Lp(a)］是人体内一种独特的脂蛋白，由低密度脂蛋白(LDL)样微粒和载脂蛋白(a)［apolipoprotein(a)，apo(a)］组成。Apo(a)与纤溶酶原的基因高度同源，属于人类纤溶酶原基因超家族成员。Apo(a)由多拷贝的纤溶酶原Kringle IV样的重复片断和单拷贝的Kringle V和丝氨酸蛋白酶区域构成。Apo(a)有10种纤溶酶原Kringle IV样的基序(命名为Kringle IV-1～Kringle IV-10)，除了Kringle IV-2外，每种Kringle IV都是单拷贝。Apo(a)多态性受基因控制，不同apo(a)亚型Kringle IV-2的拷贝数为3-40不等。关于Lp(a)的最大的流行病学研究已证明Lp(a)水平与心脏疾病和缺血性脑卒中存在连续的独立的中等程度的相关，高Lp(a)作为心脑血管动脉粥样硬化性疾病的独立危险因素已得到公认。 

Lp(a)浓度检测常用的方法有双抗体夹心ELISA法、免疫比浊法与胶乳增强免疫比浊法。这三种方法均需要用到Lp(a)抗体，其中后两种方法在临床检验上应用更多，特别是胶乳增强免疫比浊法。由于Lp(a)分子量大，结构复杂，目前还无法通过人工表达手段制备Lp(a)抗原。多克隆抗体（多抗）制备用Lp(a)抗原只能从血清中纯化制备，由于Lp(a)在不同人之间具有多态性，受血清来源的限制，Lp(a)抗原的批间差较难控制，最终导致Lp(a)多抗的批间差较大。另外，由于apo(a)分子Kringle IV-2拷贝数的差异，用针对该位点的单抗或多抗作为原料制备的试剂盒会受到抗原多态性的影响，造成检测结果的不准确。 

多克隆抗体（多抗）制备用Lp(a)抗原只能从血清中纯化制备，由于Lp(a)在不同人之间具有多态性，受血清来源的限制，Lp(a)抗原的批间差较难控制，最终导致Lp(a)多抗的批间差较大。单克隆抗体（单抗）虽然不依赖Lp(a)抗原，但现有单抗要么识别多态性位点，要么需要与其他单抗进行配对使用。以胶乳增强免疫比浊试剂为例：试剂配制中，抗体种类的增加会相应的偶联工序与浓度调整工序，工作量成倍增长，试剂盒性能差异变大的风险也会由此产生。 

开发识别apo(a)分子Kringle IV-2以外抗原表位的单克隆抗体，可以很好解决抗体批间差大与apo(a)多态性影响的问题。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一株能生产自身配对，特异性结合Lp(a)，且能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株； 

本发明的目的之二是提供由所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体； 

本发明的进一步目的是将该单克隆抗体应用于检测Lp(a)并提供一种Lp(a)胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

本发明人用Lp(a)分子中的多态性片段Kringle IV-2为筛选抗原，采用间接ELISA法进行Lp(a)特异性单克隆抗体筛选，用棋盘法进行单抗的配对筛选，最终获得了1株能够产生自身配对、特异性结合Lp(a)、且与Kringle IV-2无结合的单抗目标细胞株，从而完成了本发明。 

本发明首先提供一株产生能自身配对、特异性结合Lp(a)且与Kringle IV-2无结合的抗Lp(a)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

本发明将所筛选得到的杂交瘤细胞株将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8509；分类命名为：脂蛋白（a）单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏日期：2013年11月20日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

本发明还提供了一种制备所述的杂交瘤细胞株的方法，包括：用Lp(a)分子中的多态性片段Kringle IV-2为筛选抗原，采用间接ELISA法和双抗夹心ELISA法进行Lp(a)特异性单克隆抗体筛选的工序，筛选得到所述杂交瘤细胞株。 

本发明中的杂交瘤细胞株与抗Lp(a)单克隆抗体可以通过下文所述的方法产生。进一步，本领域的技术人员可以使用这些根据下文描述及本领域中已知技术改造过的更适合的方法。 

（1）免疫原的制备 

本发明采用天然提取纯化的Lp(a)分子为免疫原。可以是Lp(a)校准品抗原经过分子筛，如GE公司S-200填料分离纯化得到，也可以是商品化的高纯度Lp(a)天然抗原，还可以从Lp(a)含量较高的血清中按文献方法进行制备。 

（2）检测抗原的制备 

检测抗原包括Lp(a)天然抗原、APOB抗原和Lp(a)Kringle IV-2原核表达抗原。Lp(a)天然抗原、APOB抗原可以通过购买或其他方式获得。Lp(a)Kringle IV-2通过原核表达纯化获得，具体的为：从NCBI网站上获得Kringle IV-2的氨基酸序列（SEQ ID No.2），用Vector NTI软件反译成大肠杆菌偏爱的密码子基因序列（SEQ ID No.1），送外包公司进行全基因合成，插入表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达与蛋白纯化。 

（3）单克隆抗体的制备 

Lp(a)分子量大，容易诱导产生抗体，本发明采用Lp(a)天然抗原免疫小鼠，进行3-5次免疫。在最后一次免疫接种2-5天（优选3天）后收集脾细胞，将这些组织中产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合后选择与Lp(a)具有特异性结合的杂交瘤，从而制备产单克隆抗体的细胞。 

融合可以按照公知的方法进行，例如可以举出如下方法：将脾细胞与瘤细胞按5-10:1的比例混合，离心去上清后，向沉淀物中加入融合促进试剂，然后用DMEM培养基终止融合促进试剂的作用。离心弃上清后细胞用合适体积的HAT培养基重悬，制成融合细胞，融合细胞在培养杂交瘤的孔格中进行培养。 对于骨髓瘤细胞可以使用公知的骨髓瘤细胞，例如可以举出SP2/0-Ag14(SP2/0)、P3/X63-Ag8(X63)、P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)、P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)等小鼠来源的细胞系，其中优选为SP2/0。融合促进试剂可以为聚乙二醇₁₄₅₀（PEG₁₄₅₀）、聚乙二醇₄₀₀₀（PEG₄₀₀₀）等，优选为PEG₁₄₅₀。 

单克隆抗体的选择可以根据已知的方法进行。一般地是在添加有HAT的用于动物细胞的细胞培养基中进行的。用于选择与培养的培养基例如可以举出：体积比为5%-20%胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培养基。细胞一般在5-10%CO2气体的环境中于36.5℃-37.5℃，培养10-14天。 

从培养杂交瘤的孔格中收集培养物的上清液，分泌目的抗体的培养孔可通过间接ELISA方法来选择。首先，Lp(a)天然抗原反应、APOB抗原和Kringle IV-2等3种抗原被固定在96孔酶标板中，并用吐温-20磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤酶标板，然后将培养上清样品加入到不同抗原包被孔中，37℃温育30分钟后，加入1:10000稀释的作为酶标二抗的羊抗鼠-HRP，37℃温育30分钟后加入过氧化氢脲-四甲基联苯胺底物（H₂O₂-TMB）作为底物进行显色，用酸终止反应后，测量450nm下的吸光值。 

选取与Lp(a)天然抗原反应，而与APOB抗原和Kringle IV-2无反应的培养孔，通过公知的有限稀释法进行克隆。通过培养该杂交瘤细胞株可以大量的获得抗Lp(a)单克隆抗体。该抗Lp(a)单克隆抗体的获取方法，大地可以划分为两种。一种是使用培养基，在烧瓶等培养容器中进行培养，从该上清液中获取抗体的方法。例如为体积比是10%-20%胎牛血清的DMEM培养液。另一种方法是将用培养容器培养的杂交瘤细胞株通过同系小鼠体内诱生法接种到同系的动物中，来获得抗Lp(a)的单克隆抗体。 

本发明的采用间接ELISA法进行Lp(a)特异性单克隆抗体的筛选的工序中， 

包括将抗原抗原固定在96孔酶标板中，并用吐温-20磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤酶标板的包被酶标板；将培养上清样品加入到不同抗原包被孔中，37℃温育30分钟后，用PBST洗涤酶标板的添加培养上清样品的工序；加入1:10000稀释的作为酶标二抗的羊抗鼠-HRP，37℃温育30分钟后用PBST洗涤酶标板的添加酶标二 抗的工序；以及进行显色的工序。 

本发明的另一个目的在于提供一种由该杂交瘤细胞株所产生的抗Lp(a)单克隆抗体。本发明的杂交瘤细胞株能够稳定地生产抗Lp(a)单克隆抗体，而由该杂交瘤细胞株产生的抗Lp(a)单克隆抗体可以实现自身配对、特异性结合Lp(a)，且与Kringle IV-2无结合。由于该抗Lp(a)单克隆抗体能够很好地满足Lp(a)检测的要求，因此可以应用于Lp(a)检测试剂盒中。 

因此，本发明提供了一种Lp(a)胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，由彼此独立的试剂1（R1）与试剂2（R2）组成；其中，R1试剂1的成分包括缓冲液，防腐剂等；试剂2的成分包括缓冲液、牛血清白蛋白（BSA）或小牛血清(NCS)、偶联有抗Lp(a)单克隆抗体的胶乳微球等。 

具体的，试剂1的成分可以是：1）10-50mM,pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS），0.02%-0.1%叠氮钠（NaN3）；或2）50-200mM,pH7.4Tris-HCl缓冲液，0.02%-0.1%NaN3；或3）50-200mM,pH7.4MOPS缓冲液，0.02%-0.1%NaN3。优选为：20mM,pH7.4磷酸盐缓冲液，0.1%NaN3。 

试剂2的成分可以是，1）10-50mM,pH7.4磷酸盐缓冲液，0.1-0.5%BSA或5-15%NCS，0.125%-0.25%偶联有抗体的胶乳微球（抗体偶联比：0.5-2mg/10mg胶乳微球；胶乳微球粒径：80-200nm）；或2）50-200mM,pH7.4Tris-HCl缓冲液，0.1-0.5%BSA或5-15%NCS，0.125%-0.25%偶联有抗体的胶乳微球（抗体偶联比：0.5-2mg/10mg胶乳微球；胶乳微球粒径：80-200nm）；或3）50-200mM,pH7.4MOPS缓冲液，0.1-0.5%BSA或5-15%NCS，0.125%-0.25%偶联有抗体的胶乳微球（抗体偶联比：0.5-2mg/10mg胶乳微球；胶乳微球粒径：80-200nm）；优选为：20mM,pH7.4磷酸盐缓冲液，0.1%BSA，0.2%偶联有抗体的胶乳微球（抗体偶联比：1mg/10mg胶乳微球；胶乳微球粒径：124nm）。 

本发明的杂交瘤细胞株能够稳定地生产抗Lp(a)单克隆抗体，而由该杂交瘤细胞株产生的抗Lp(a)单克隆抗体可以实现自身配对、特异性结合Lp(a)，且与Kringle IV-2无结合。LPa-3单抗所配Lp(a)试剂盒检测病人血清样本的试验表明， 由本发明的抗Lp(a)单抗配制的检测试剂盒与德赛公司Lp(a)试剂盒测值符合度高，准确度可靠，可以应用于Lp(a)试剂盒中。 

本发明所涉及的术语定义 

本发明所说的“Lp(a)”除非特别说明，是指人血清或血浆中脂蛋白（a）及其相关产物，如的脂蛋白(a)前体、成熟形式或片段。 

本发明所说的“特异性结合”是指抗Lp(a)单抗仅与Lp(a)结合，而不与载脂蛋白B(APOB)结合。 

本发明所说的“抗体”是指能够与完整的全长度的Lp(a)分子或Lp(a)片段特异性结合的单抗，或者这些抗体的部分片段。 

本发明所说的自身配对是指一种单抗能以两个或以上的形式结合到同一个抗原分子上的现象，产生这种现象的原因是抗原分子上存在两个或以上相同或相似的抗原表位。 

附图说明

图1为由LPa-3杂交瘤细胞株所产生的单抗应用于试剂盒中的相关性分析图。 

具体实施例

下面结合具体实施方案来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实施例1杂交瘤细胞株的构建 

用Lp(a)抗原免疫4只6周龄雌性Balb/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐剂将抗原进行乳化，每只小鼠注射40ug抗原，然后采用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以21天为间隔进行第2-3次免疫。完成3次免疫后眼眶采血检测血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行细胞融合。融合前3天用不加佐剂的Lp(a)抗原对选定的小鼠进行冲击免疫，3天后将小鼠断颈椎处死，无菌分离脾脏，制备脾细胞悬液，将脾细胞与体外培养的SP2/0细胞按10：1比例混匀，离心洗涤后用PEG1450进行细胞融合，融合细胞培养8天，采用间接ELISA法对融合细胞培养上清进行筛选，检测抗原为Lp(a)、APOB和Kringle IV-2。用0.05M pH9.6Na2CO3-NaHCO3缓冲液将Lp(a)、APOB和Kringle IV-2稀释至1ug/ml，三种抗原按列交叉包被，每孔100ul加到酶标板中，4℃放置过夜，用0.15M pH7.4含0.05%吐温-20磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤酶标板1次，完成抗原包被；将培养上清加到酶标板中，每个培养孔取样3次，分别加到Lp(a)、APOB和KringleIV-2包被孔中，每孔60ul，37℃温育30min，用PBST洗板2次；将HRP-羊抗小鼠IgG稀释至工作浓度，每孔100ul加到酶标板中，37℃温育30min，用PBST洗板3次；加入TMB-H2O2底物，37℃避光显色10min；每孔加入50ul2M H2SO4终止显色，在酶标仪上读取450nm的吸光值。选取与Lp(a)呈强阳性反应，但与APOB和Kringle IV-2呈阴性反应的培养孔克隆化，并建立杂交瘤细胞株。 

实施例2抗Lp(a)单抗的配对筛选 

将克隆建株的Lp(a)单抗杂交瘤细胞用腹水法制备出Lp(a)单抗腹水，用Protein G柱纯化出Lp(a)单抗，过碘酸钠法对Lp(a)单抗进行HRP标记，然后用棋盘法对各株Lp(a)单抗的配对特性进行分析。将各株Lp(a)单抗用0.05M pH9.6Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释至5ug/ml，每孔100ul包被酶标板，每种单抗包被1列孔条；用PBST将Lp(a)抗原稀释成0.1ug/ml，每孔100ul，37℃温育30min，用PBST洗板2次；用PBST将各株单抗的HRP标记物稀释至工作浓度，每种单抗标记物加入1排板孔，每孔100ul，37℃温育30min，用PBST洗板3次；加入TMB-H2O2底物，37℃避光显色10min，每孔加入50ul2M H2SO4终止显 色，在酶标仪上读取OD450值。阳性反应孔对应的包被单抗与HRP标记单抗即为配对的单抗。选取配对效果较好的单抗作夹心ELISA法的初步应用。单抗配对筛选的数据见表1 

表1Lp(a)单抗棋盘法配对分析结果 

实施例3用LPa-3单抗配制的Lp(a)检测试剂盒 

1）试剂1为： 

PBS缓冲液（pH7.4） 

BSA                  0.5% 

吐温-20               0.1% 

NaN3                 0.1% 

2）试剂2为： 

PBS缓冲液（pH7.4） 

3)LPa-3单抗胶乳微球的制备 

a）用50mM HEPES缓冲液(pH7.4)将LPa-3单抗至1mg/ml。 

b）用MES缓冲液(10mM pH5.0)稀释100nm胶乳微球至质量浓度为2%，共400μl。 

c）用MES缓冲液(10mM pH5.0)分别配制EDC（2mg/ml）400μl，NHS(2mg/ml)400μl。 

d）向胶乳微球溶液中逐滴加入300μl EDC溶液，然后逐滴加入300μl NHS溶液，室温搅拌15min。 

e）将活化的微球和单抗混合，室温搅拌2小时。 

f）反应后离心，去上清，沉淀用6ml试剂2缓冲液重悬，超声分散。 

实施例4LPa-3单抗所配Lp(a)试剂盒检测病人血清样本的试验 

用LPa-3单抗所配Lp(a)试剂盒对30份不同Lp(a)含量的病人血清样本在全自动生化分析仪Olympus AU400上进行测定，用上海申能德赛公司Lp(a)胶乳增强免疫比浊试剂盒作为对照，测得值是Lp(a)的含量，其单位是mg/dL，正常人血清Lp(a)的含量低于30mg/dL。将两种测定结果进行对比，其结果示于表2中。其中，自配试剂盒测测定参数为：R1:R2:S=180ul:60ul:2ul，对照试剂盒按说明书参数进行设定。同时，将自配试剂盒与德赛商品试剂盒检测结果做相关性分析曲线，其结果参见图1。 

从表2和图1可知，自配试剂盒的检测结果与德赛公司Lp(a)试剂盒相关性较好：相关性方程为y=1.08x-6.3519，R²=0.9933。从该结果可知，由本发明的抗Lp(a)单抗配制的试剂盒与德赛公司Lp(a)试剂盒测值符合度高，准确度可靠，可以应用于Lp(a)试剂盒中。 

表2LPa-3单抗自配试剂盒与德赛试剂盒比对数据