一种胶冻样芽孢杆菌菌株及其在海藻生物肥料中的应用

摘要

本发明涉及一种胶冻样芽孢杆菌菌株，其分类命名为胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus），已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7549。本发明还涉及胶冻样芽孢杆菌在制备海藻生物肥料中的应用。本发明所述胶冻样芽孢杆菌菌株具有较强的海藻降解能力，利用该菌株制备的海藻微生物肥料含有丰富的胶冻样芽孢杆菌繁殖代谢产生的荚膜多糖（或胞外多糖）和由海藻成分经生物发酵降解转化的海藻酸、海藻寡糖、赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）等植物生长调节活性物质，有效活菌数≥2.0×10

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种胶冻样芽孢杆菌菌株及其在海藻生物肥料中的应用。 

背景技术

胶冻样芽孢杆菌为大荚膜芽孢杆菌，革兰氏染色阴性，荚膜多糖丰富，芽孢为椭圆形，能分解由硅铝酸盐和硅酸盐组成的岩石矿物，因此也称为硅酸盐细菌。利用胶冻样芽孢杆菌生产的微生物肥料，可对植物进行叶面喷施和根部施肥，可促进植株对土壤中磷钾的吸收，减少植物病害的发生，提高产量，改善果实品质，是目前广泛应用的微生物肥料中的一种重要功能菌。 

海藻（Alga）是生长在海中的藻类，是植物界的隐花植物。它们一般被认为是简单的植物，主要特征为：无维管束组织，没有真正根、茎、叶的分化现象；不开花，无果实和种子；生殖器官无特化的保护组织，常直接由单一细胞产生孢子或配子；以及无胚胎的形成。由于藻类的结构简单，所以有的植物学家将它跟菌类同归于低等植物的“叶状体植物群”。 

海藻属低等植物，种类繁多。根据海藻中所含色素的不同，可将其分为绿藻（如石莼）、褐藻（如海带、马尾藻、海藻、巨藻等）、蓝藻（如束毛藻）、黄藻（如海球藻）、金藻（如钙板藻）等。 

褐藻是藻类植物中较高级的一个类群。褐藻的形状和大小各异，从呈异丝体的附生藻(水云属（Ectocarpus）)到复杂、巨大的长1～100公尺的大型褐藻(海带属（Laminaria）、巨藻属（Macrocystis）等)。岩藻是褐藻的一个类型，浮生(马尾藻属（Sargassum）)或附生于岩石海岸，主要包括墨角藻属（Fucus）、海藻属（Ascophyllum）。 

海藻肥料是以海洋植物海藻作为主要原料，经科学加工制成的生物肥料，主要成分是从海藻中提取的有利于植物生长发育的天然生物活性物质和海藻从海洋中吸收并富集在体内的矿质营养元素，包括海藻多糖、酚类多聚化合物、甘露醇、甜菜碱、植物生长调节物质(细胞分裂素、赤霉素、生长素及脱落酸等)和氮、磷、钾、铁、硼、钼、碘等微量元素。因此，海藻肥料具有营养丰富、活性强、易被吸收、可改良土壤、安全无公害等特点。由于具有上述一系列的优点，海藻肥料正逐渐成为人们竞相研发的热点。 

但是，在现有的海藻肥料生产技术中，其中的消化剂大多以碳酸氢钠、氢氧化钠以及无机酸为主，如中国发明专利CN98101040、CN03138729等，这些技术的缺点是，提取过程中过多地使用无机盐、碱或酸，不但不能全面提取海藻中的营养成分，而且会对植物造成盐害。 

发明内容

针对现有技术中传统化学肥料和普通微生物肥料的不足，本发明的目的是提供一种胶冻样芽孢杆菌菌株，利用筛选到的一种胶冻样芽孢杆菌菌株制备高效的海藻生物肥料，该海藻生物肥料不仅可避免化学工艺对海藻活性成分的破坏，还可以更多地有效提取海藻中的活性成分，使产品的使用效果更好，应用领域更广。 

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案之一，是提供一种胶冻样芽孢杆菌JK-2菌株，所述菌株的分类命名为胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus），已于2013年05月04日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7549，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。 

优选地，所述胶冻样芽孢杆菌菌株的单个菌落呈半玻璃珠状，边缘整齐，表面湿润光滑，有光泽，无色透明；芽孢位于孢囊中部，孢囊不膨大；菌体为杆状（1.0-1.5cm×3.0-5.0um），两端钝圆，菌体外有肥厚荚膜，革兰氏反应阴性。 

本发明所采用的技术方案之二，是提供上述胶冻样芽孢杆菌在制备海藻生物肥料中的应用。 

优选地，所述海藻生物肥料是海藻生物叶面肥。 

优选地，所述海藻生物叶面肥中胶冻样芽孢杆菌的有效活菌数≥2.0×10⁹CFU/ml，有机质≥35%。 

本发明的有益效果： 

本发明所述胶冻样芽孢杆菌菌株具有较强的海藻降解能力，利用该菌株制备的海藻微生物肥料含有丰富的胶冻样芽孢杆菌繁殖代谢产生的荚膜多糖（或胞外多糖）和由海藻成分经生物发酵降解转化的海藻酸、海藻寡糖、赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）等植物生长调节活性物质，有效活菌数≥2.0×10⁹CFU/ml，便于被作物直接吸收,肥效快，并且能有效地促进植物高产、早熟，改善作物的品质，是一种优质的有机食品专用肥料。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的详细说明。 

（一）胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）CGMCC No.7549的获得方法： 

从青岛地区某大棚蔬菜土壤中取回土样，按胶冻样芽孢杆菌的筛选培养基和条件，筛选胶冻样芽孢杆菌，并分离纯化，最终获得纯菌株。 

筛选培养基为硅酸盐培养基： 

蔗糖5g， 

Na₂HPO₄ 2g， 

MgSO₄·7H₂O 0.5g， 

FeCl₃ 0.005g， 

CaCO₃ 0.1g， 

铝土矿0.5g， 

琼脂l0～20g， 

水1000ml， 

pH7.0～7.5 

置于28℃下，培养3-4天； 

通过显微镜观察判断是否为纯菌株； 

采用平板划线法获得纯种。 

（二）胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）CGMCC No.7549的培养方法： 

培养温度为：28-32℃ 

培养基组成为： 

蔗糖：10g 

磷酸二氢钾：0.5g 

硫酸镁：0.2g 

氯化钠：0.2g 

碳酸钙：1.0g 

酵母粉：0.4g 

琼脂：15-20g 

培养基配制方法：先将各成分溶入水中煮沸，加入琼脂，使之溶解，分装在三角瓶中，121℃，20min灭菌，倒平板，待凝固冷却后接种。 

将接种后的平板，置于28℃下，培养3-4天。 

（三）胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）CGMCC No.7549的具体特征： 

细菌形态特征：菌体为杆状（1.0-1.5cm×3.0-5.0um），两端钝圆，革兰氏反应阴性。 

芽孢形态特征：在硅酸盐细菌培养基上易形成芽孢，芽孢位于孢囊中部，孢囊不膨大。菌体外有肥厚荚膜。 

菌落形态特征：单个菌落呈半玻璃珠状，边缘整齐，表面湿润光滑，有光泽，无色透明。 

生理生化特性：见表1 

表1 

生理生化特征 菌株No.7549 胶质芽孢杆菌

[0051] 

过氧化氢酶测定 + + 溶菌酶抗性 + nd 从甘油产二羟基丙酮 - - 酪素水解 + + 明胶水解 - - 酪氨酸水解 - - 苯丙氨酸脱氨 - - 卵磷脂酶测定 - - 淀粉水解 + + 在含5%NaCl的培养基中生长 - - PH5.7的sabouraud葡萄糖培养基 - nd V.P试验 - - 吲哚试验 - - 糖发酵产物甘露醇 +- +- 木糖 +- +- 葡萄糖 +- +- L-阿拉伯糖 +- +-

+：阳性；-：阴性；nd：没有资料；+-：产酸不产气 

（四）利用胶冻样芽孢杆菌生产海藻生物肥的工艺过程： 

（1）海藻浸泡 

海藻加水浸泡2‐15小时；过滤，浸泡水备用； 

（2）物理破碎 

将浸泡好的海藻打碎，并与浸泡水混合； 

（3）发酵培养基的配制 

取步骤（2）所得海藻液1000重量份，添加6-10重量份酵母浸粉，1-5重量份蛋白胨，1-2重量份氯化钠，0.5-1重量份K₂HPO₄，0.1-0.5重量份MgSO₄，调节pH至7-8，即得所需发酵培养基； 

（4）接种并发酵 

将胶冻样芽孢杆菌（保藏号为CGMCC No.7549）接种到步骤（3）所得培养基中，发酵，即得海藻生物肥。 

实施例1 

（1）泡叶藻浸泡 

取50公斤泡叶藻，按照泡叶藻：水=1：10（重量比）的比例加水500kg，浸泡8小时，100目滤网过滤，滤液备用； 

（2）物理破碎 

用打碎机将泡叶藻打碎30min，并与浸泡水混合； 

（3）发酵培养基的配制 

取步骤（2）所得泡叶藻混合液1000kg，添加6kg酵母浸粉（0.6%，W/W），4kg蛋白胨（0.4%，W/W）；1kg氯化钠（0.1%，W/W）；1kg K₂HPO₄（0.1%W/W）；0.1kg MgSO₄（0.01%，W/W）；利用氨水调节培养基pH至7.0； 

（3）胶冻样芽孢杆菌JK-2种子活化 

将胶冻样芽孢杆菌JK-2（保藏号为CGMCC No.7549）从保存的斜面转接于新鲜试管斜面，于30℃恒温培养箱培养24h。取培养好的斜面，用接种环挑饱满一环，接种于盛有50mL无菌种子培养基的250mL三角瓶中，摇床30℃，180r/min振荡培养20h。种子质量标准：OD600值达到0.5（稀释5倍），菌含量达到8.0×108CFU，镜检菌体饱满，芽孢刚刚开始形成。接种量0.1%，采用火焰接种法接种； 

（4）发酵 

发酵参数控制如下：发酵温度：30℃；酵液pH：7.0；搅拌转速：0-4h，120rpm；4-20h，150rpm；20-24h，180rpm。通气量：0-4h，1:0.5；4-10h，1:0.8；10-20h，1:1.2；20-24h，1:0.5；罐压：0.02～0.03MPa。 

发酵过程中要始终保持罐体内正压，并根据发酵罐内泡沫的多少调节罐压，泡沫过多的时候，可适当增加罐压；消泡：根据产生泡沫的多少，通过流加的方式添加泡敌（已灭菌），或者在培养基配制过程中直接加入0.05～0.1%的泡敌。泡沫的多少与通气量大小、搅拌转速高低、培养基粘度、菌体含量、消泡剂多少等因素有关，可在发酵过程中灵活控制； 

每隔2小时取样，镜检菌体形态，OD600，芽孢形成比例以及总糖、总氮等参数。发酵时间达到24小时左右，视野中的芽孢率达到90%时停罐。菌体含量可达2.0×10⁹CFU/ml，停罐后打开冷水进行降温，温度一般降至20℃左右。再将发酵液转移到储罐中，检测合格后，计量包装即可。 

实施例2 

（1）海带浸泡 

取40公斤海带，按照海带：水=1：12（重量比）的比例加水480kg，浸泡15小时，80 目滤网过滤，滤液备用； 

（2）物理破碎 

用打碎机将海带打碎30min，并与浸泡水混合； 

（3）发酵培养基的配制 

取步骤（2）所得海带混合液1000kg，添加8kg酵母浸粉（0.8%，W/W），2kg蛋白胨（0.2%，W/W）；1.2kg氯化钠（0.12%，W/W）；0.7kg K₂HPO₄（0.07%W/W）；0.3kg MgSO₄（0.03%，W/W）；利用氨水调节培养基pH至7.0； 

（3）胶冻样芽孢杆菌JK-2种子活化 

将胶冻样芽孢杆菌JK-2（保藏号为CGMCC No.7549）从保存的斜面转接于新鲜试管斜面，于29℃恒温培养箱培养24h。取培养好的斜面，用接种环挑饱满一环，接种于盛有50mL无菌种子培养基的250mL三角瓶中，摇床29℃，180r/min振荡培养20h。种子质量标准：OD600值达到0.5（稀释5倍），菌含量达到8.0×108CFU，镜检菌体饱满，芽孢刚刚开始形成。接种量0.1%，采用火焰接种法接种； 

（4）发酵 

发酵参数控制如下：发酵温度：29℃；酵液pH：7.2；搅拌转速：0-4h，120rpm；4-20h，150rpm；20-24h，180rpm。通气量：0-4h，1:0.5；4-10h，1:0.8；10-20h，1:1.2；20-24h，1:0.5；罐压：0.02～0.03MPa。 

其它步骤同实施例1。 

实施例3 

（1）马尾藻浸泡 

取60公斤马尾藻，按照马尾藻：水=1：15（重量比）的比例加水900kg，浸泡12小时，150目滤网过滤，滤液备用； 

（2）物理破碎 

用打碎机将马尾藻打碎30min，并与浸泡水混合； 

（3）发酵培养基的配制 

取步骤（2）所得马尾藻混合液1000kg，添加9kg酵母浸粉（0.9%，W/W），1kg蛋白胨（0.1%，W/W）；1.5kg氯化钠（0.1%，W/W）；0.8kg K₂HPO₄（0.08%W/W）；0.4kg MgSO₄（0.04%，W/W）；利用氨水调节培养基pH至7.0； 

（3）胶冻样芽孢杆菌JK-2种子活化 

将胶冻样芽孢杆菌JK-2（保藏号为CGMCC No.7549）从保存的斜面转接于新鲜试管斜面，于32℃恒温培养箱培养24h。取培养好的斜面，用接种环挑饱满一环，接种于盛有50mL无 菌种子培养基的250mL三角瓶中，摇床32℃，180r/min振荡培养20h。种子质量标准：OD600值达到0.5（稀释5倍），菌含量达到8.0×108CFU，镜检菌体饱满，芽孢刚刚开始形成。接种量0.1%，采用火焰接种法接种； 

（4）发酵 

发酵参数控制如下：发酵温度：32℃；酵液pH：7.0；搅拌转速：0-4h，120rpm；4-20h，150rpm；20-24h，180rpm。通气量：0-4h，1:0.5；4-10h，1:0.8；10-20h，1:1.2；20-24h，1:0.5；罐压：0.02～0.03MPa。 

其它步骤同实施例1。 

取实施例1-3所得海藻生物肥，分析其中由胶冻样芽孢杆菌繁殖代谢产生的荚膜多糖和由海藻成分经生物发酵降解转化的海藻酸、海藻寡糖、赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）等植物生长调节活性物质的含量，结果见表2。 

表2 

  实施例1 实施例2 实施例3 荚膜多糖，g/L 3.8 3.2 4.7 海藻酸，g/L 6.2 6.8 7.1 海藻寡糖，g/L 0.16 0.13 0.15 赤霉素（GA），ppm 380 260 400 吲哚乙酸（IAA），ppm 520 600 620 有效活菌数，CFU/ml 2.1×10⁹3.5×10⁹3.3×10⁹

应用实施例 

取实施例1所得海藻生物肥用于苹果生产： 

在山西省临猗县果树种植基地，选取20亩条件完全相同的果树种植区域， 

在水肥管理条件相同的情况下，10亩地喷施海藻生物肥作为叶面肥，另10亩地作为对照，不喷施，施用方法为：幼果期喷施1次，果实膨大期喷施2次，着色成熟期喷施2～3次，使用间隔不少于10天。 

结果如下： 

使用海藻生物叶面肥的苹果种植区，糖度比对照提高1%，果实风味优于对照，果实的上色均匀度优于对照，产量比对照提高5～10%，果农收益增加500～1000元每亩。