亚洲玉米螟OfAK基因及其编码蛋白和OfAK基因RNAi干扰工程菌株构建的方法

摘要

亚洲玉米螟OfAK基因及其编码蛋白和OfAK基因RNAi干扰工程菌株构建的方法，它涉及玉米螟OfAK基因片段及其RNAi干扰载体，本发明提供亚洲玉米螟精氨酸激酶部分cDNA序列及其RNAi干扰载体工程菌株构建，目的为降低亚洲玉米螟对几种杀虫剂的耐受性，增强玉米自身防御反应对亚洲玉米螟的作用，减少田间杀虫剂使用。本发明亚洲玉米螟OfAK基因序列如序列表Seq ID No：1所示。亚洲玉米螟OfAK基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。本发明OfAK基因RNAi干扰菌株，降低亚洲玉米螟对几种杀虫剂的耐受性，增强玉米自身防御反应对亚洲玉米螟的作用，满足绿色农业、安全农业的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及亚洲玉米螟OfAK基因及其编码蛋白和OfAK基因干扰工程菌株构建。

背景技术

亚洲玉米螟分布广泛，分布于在我国华北、东北、西北地区等粮食产区。据推测，春玉米受玉米螟危害减产量达7-10%，夏玉米减产达15%左右。在东北，玉米螟的危害尤其严重。据统计2011年，齐齐哈尔玉米螟发生面积为79.84万hm²，占全市玉米播种面积的72.58%，造成玉米产量损失8.4万吨。同时亚洲玉米螟的危害也显著加重了玉米病害的发生。

精氨酸激酶（ArginineKinase，AK，EC2.7.3.3）为磷酸源激酶家族一员。广泛存在于昆虫中。该酶在昆虫体内的能量贮存与代谢中起到重要作用。通过催化ATP和精氨酸之间的可逆反应，可将能量贮存于磷酸精氨酸的高能磷酸键中。精氨酸激酶在昆虫与昆虫肌肉收缩和细胞内能量转运中起到重要作用。

发明内容

本发明提供的是亚洲玉米螟精氨酸激酶的部分cDNA序列及其RNAi干扰载体工程菌株构建的方法，目的增强玉米自身防御反应及几种农药对亚洲玉米螟的毒杀作用，减少田间高效氯氰菊酯的使用量，为绿色农业和昆虫防治提供一条新的途径。

本发明的亚洲玉米螟OfAK基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

本发明的亚洲玉米螟OfAK基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

本发明的亚洲玉米螟OfAK基因RNAi干扰工程菌株构建的方法，它的构建方法如下：

一、OfAK基因克隆

以由亚洲玉米螟三龄幼虫总RNA反转录而成的cDNA为PCR模板，采用如下引物：

P1，5’-GTAGATCTATGGTGGACGCCGCAAC-3’；

P2，5’-GGAAGCTTGATCAGTTCAGCGATGCC-3’；

进行PCR扩增，扩增后，纯化PCR产物，回收纯化PCR产物；

二、OfAK基因干扰工程菌株的构建

使用BgI Ⅱ和Hind Ⅲ分别酶切步骤一回收纯化的PCR产物和L4440载体，对酶切后的PCR产物和L4440载体进行连接，然后转入大肠杆菌HT115感受态细胞中，将验证为阳性的克隆进行测序，测序成功的菌株，即为亚洲玉米螟OfAK基因RNAi干扰工程菌株。

本发明包含以下有益效果：

本发明的OfAK基因能够有效的杀死亚洲玉米螟，这是因为在几种杀虫剂的作用过程中，OfAK通过抑制昆虫肌肉的能量供应，降低昆虫的运动能力。使昆虫无法趋避杀虫剂。同时，阻碍亚洲玉米螟运动，使虫体产生新的神经冲动，从而增强几种农药的作用。

附图说明

图1为具体实施方式三中OfAK片段克隆电泳结果图；其中，M为MarkerDL2000条带，10为OfAK片段电泳条带；

图2为具体实施方式三中重组载体L4440-OfAK酶切鉴定电泳图；M为Marker条带，1为重组载体L4440-OfAK酶切电泳图；

图3为具体实施方式三中重组工程菌株HT115-L4440-OfAKPCR鉴定结果电泳图；其中，M为Marker条带；

图4为具体实施方式三中HT115-OfAK RNAi干扰工程菌对玉米防御反应的增效作用图；

图5为具体实施方式三中HT115-OfAK RNAi干扰工程菌对氯虫腈的增效作用图；

图6为具体实施方式三中HT115-OfAK RNAi干扰工程菌对溴虫腈的增效作用图；

图7为具体实施方式三中HT115-OfAK RNAi干扰工程菌对该高效氯氰菊酯的增效作用图；

图8为亚洲玉米螟取食响应过程中精氨酸激酶表达水平半定量验证电泳图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的亚洲玉米螟OfAK基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

本实施方式的亚洲玉米螟OfAK基因的cDNA片段共计1064bp，与预期一致；保守结构域分析表明此基因片段属于磷酸激酶超家族。包括ADP结合位点、磷酸结合位点，特异性底物结合位点。经Blast分析表明此基因片段的阅读框为+1，共编码354个氨基酸，OfAK基因表达的氨基酸序列如Seq ID No：2所示。

本实施方式的亚洲玉米螟幼虫取食响应中OfAK基因表达特异性分析：

分别提取取食正常玉米叶片的亚洲玉米螟中肠的总RNA和取食经茉莉酸诱导亚洲玉米螟三龄幼虫中肠的总RNA，分别进行半定量PCR反应，每个样品设三次重复，并对其亮度进行检测。检测OfAK基因表达情况，结果见图1所示，由图1可知OfAK基因片段大小为1064bp。

具体实施方式二：本实施方式的亚洲玉米螟OfAK基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

本实施方式的亚洲玉米螟OfAK基因编码蛋白的氨基酸序列，共计354个氨基酸。本实施方式的氨基酸序列包含一个保守的蛋白激酶结构域。

具体实施方式三：本实施方式的亚洲玉米螟OfAK基因RNAi干扰工程菌株构建的方法，它的构建方法如下：

一、OfAK基因克隆

以由亚洲玉米螟三龄幼虫总RNA反转录而成的cDNA为PCR模板，采用如下引物：

P1，5’-GTAGATCTATGGTGGACGCCGCAAC-3’；

P2，5’-GGAAGCTTGATCAGTTCAGCGATGCC-3’；

进行PCR扩增，扩增后，纯化PCR产物，回收纯化PCR产物；

二、OfAK基因干扰工程菌株的构建

使用BgIⅡ和HindⅢ分别酶切步骤一回收纯化的PCR产物和L4440载体，对酶切后的PCR产物和L4440载体进行连接，得重组载体L4440-OfAK，然后转入大肠杆菌HT115感受态细胞中，得重组工程菌株HT115-L4440-OfAK，将PCR验证为阳性的克隆进行测序，测序成功的菌株，即为亚洲玉米螟OfAK基因RNAi干扰工程菌株（以下称为HT115-OfAK RNAi干扰工程菌）。

本实施方式的BgI Ⅱ和Hind Ⅲ是市售产品，酶切体系参见产品说明书。本实施方式的PCR产物和L4440载体的连接采用市售的T4连接酶进行连接，连接体系详见产品说明书。

本实施方式步骤一中纯化PCR产物的电泳结果如图1所示，由图1可知，图中右边泳道的条带即为PCR产物，即OfAK基因（大小为1064bp）；其中，M为购买自Takara公司的DL2000。

图2为具体实施方式三中重组载体L4440-OfAK酶切鉴定电泳图；从图2可知，酶切后的OfAK基因大小为1064bp，说明重组载体L4440-OfAK构建成功。

图3为具体实施方式三中重组工程菌株HT115-L4440-OfAK PCR鉴定结果电泳图，从图3可知重组工程菌株HT115-L4440-OfAK构建成功。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：步骤一中所述的PCR反应条件如下：

PCR反应体系为：

PCR程序如下：94℃预变性10min，94℃变性1min，55.8℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保存。其它与具体实施方式三相同。

通过以下试验验证本发明的亚洲玉米螟OfAK基因及其编码蛋白和OfAK基因RNAi干扰菌株的相关性能，具体操作如下：

1、dsRNA的诱导表达

使用ITPG诱导HT115-OfAK RNAi干扰工程菌产生dsDNA；具体诱导方法如下：

一、将具体实施方式三得到的HT115-OfAK RNAi干扰工程菌在2×YT培养基中（2×YT培养基中含有0.1mg/mL的Amp和25μg/mL的Tet），在温度为37℃，转速为220rpm的条件下培养至OD595为0.5，向100mL的2×YT培养基内加入IPTG，使IPTG终浓度达到0.15mmol/L后，在温度为30℃的条件下进行dsRNA诱导表达4h；

二、将步骤一诱导表达后的菌液在转速为5000rpm、温度为4℃的条件下，离心10min，去上清，收集菌体，按照ddH₂O：培养基的体积比为1:50的比例加入Rnase-free ddH₂O，然后进行超声破碎，在转速为10000rpm、温度为4℃的条件下，离心10min，收集上清，向上清液中加入氯仿：异戊醇，其中，氯仿：异戊醇与上清的体积比为1:1，氯仿：异戊醇的体积比为24:1，反复混合，然后在转速为12000rpm、温度为4℃的条件下离心20min，吸取上清，将上清与异丙醇按体积比为1:1的比例混合，在-20℃温度下放置30min后，在转速为12000rpm、温度为4℃的条件下离心10min，收取沉淀放于1mLddH₂O中。加无水乙醇20mL至乙醇终浓度为75%，在-20℃温度下放置过夜后，在转速为12000rpm、温度为4℃的条件下离心10min，收集沉淀，按照Rnase-freeddH₂O：培养基的体积比为1:50的比例加入Rnase-freeddH₂O，得诱导表达的dsRNA溶液。

3、OfAKdsRNA对亚洲玉米螟生长发育的影响。

人工饲养亚洲玉米螟至三龄后，挑选长势一致的亚洲玉米螟幼虫与平板中饲喂三叶期玉米幼苗叶片。饲喂12后，随机选取亚洲玉米螟幼虫分别于平板中饲喂经茉莉酸甲酯处理和未经茉莉酸甲酯处理的玉米叶片。茉莉酸甲酯处理采用熏蒸法。处理时间12h，所用茉莉酸甲酯浓度为225μmol/L。分三组。每组15只。

使用SPSS17.0对不同时间下，亚洲玉米螟体重增量进行T-test检验。结果如图4所示，结果表明：在处理的12h和24h，处理组亚种玉米螟玉米螟幼虫体重增量显著低于对照组。并且在36h体重增量差异P值为0.09。

4、HT115-OfAK基因对几种农药的增效作用

挑选生长一致的亚洲玉米螟三龄幼虫饥饿过夜后，进行亚致死量高效氯酸菊酯、溴虫腈、氯虫腈自然饲喂试验。将上述得到的dsRNA溶液加到切碎的人工饲料上，每处理组以15头3龄幼虫进行单头饲养实验分为五组：ddH₂O组、HT115-OfAK组、农药组、L4440+农药组和HT115-OfAK+农药组。12小时后，统计各组亚洲玉米螟幼虫死亡率。

结果如图5至图8所示。图5至图8的结果表明：相对于L4440+农药组，农药+dsRNA组中亚洲玉米螟死亡率差异显著增高。说明OfAK基因能够有效的杀死亚洲玉米螟，这可能是因为在几种杀虫剂的作用过程中，OfAK通过抑制昆虫肌肉的能量供应，降低昆虫的运动能力。使昆虫无法趋避杀虫剂。同时，阻碍亚洲玉米螟运动，使虫体产生新的神经冲动，从而增强几种农药的作用。