大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI基因及其编码蛋白和应用

摘要

本发明属于生物技术领域，本发明提供了克隆了一个大腹园蛛的丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI基因，其cDNA全长为572bp，该基因具有SEQ ID No.1中的碱基序列，编码具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列，氨基酸序列比对结果显示，AvSPI同时含有TIL（Trypsin Inhibitor Like Cysteine Rich Domain）和Kunitz两种结构域，体外重组了该基因的编码蛋白，重组蛋白具有较强的胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K抑制活性。该基因及其重组蛋白活性的研究，对进一步了解同时含有TIL和Kunitz两种结构域与其他已报道丝氨酸蛋白酶之间的差异及该抑制剂基因在大腹园蛛先天性免疫中的作用，对研制新的人类疾病防治药物具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地指一种大腹园蛛丝氨酸蛋白酶 抑制剂AvSPI基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

蛋白酶是所有生物体维持正常生命活动所必需的一类蛋白，其活 性通过不同的方式在生物体内被严格控制，其中，蛋白酶抑制剂是蛋 白酶活性的主要调节因子，通过调控蛋白酶的生物活性而控制生物体 的生理活动并发挥其功能。研究发现，蛋白酶抑制剂广泛存在于病毒， 细菌及动植物等生物体内。根据蛋白酶抑制剂的作用靶标主要分为丝 氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天 冬氨酸蛋白酶抑制剂四大家族。其中以丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI） 研究较为广泛和深入，至今，丝氨酸蛋白酶抑制剂家族已报道几百个 成员，根据序列的同源性、半胱氨酸残基和分子中二硫键数目，丝氨 酸蛋白酶抑制剂可分为Kunitz、Kazal、Bowman-Birk、Serpin、TIL （Trypsin Inhibitor Like Cysteine Rich Domain）等几个家族。丝氨酸 蛋白酶抑制剂通过与靶标酶相互结合形成稳定的复合体调节酶的活 性，防止丝氨酸蛋白酶的过度水解激活，在一系列的生理和病理过程 中：如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等发挥着关键性的调 控作用，同时也是生物体免疫系统的重要组成部分。

同时，丝氨酸蛋蛋白酶抑制剂在医学上具有良好的药用价值，据 文献报道，丝氨酸蛋白酶抑制剂Aprotinin已在临床上用于胃炎、胰 腺炎等疾病的治疗。药用水蛭中发现的胰蛋白酶抑制剂hirudin和吸 血椿象中两个Kazal型结构域丝氨酸蛋白酶抑制剂具有抗凝血酶活 性。水蛭来源的胰蛋白酶抑制剂LDTI能够抑制HIV-1的复制，可用 于艾滋病的防治。

蜘蛛是陆地上最成功的无脊椎动物之一，蜘蛛毒素具有良好的药 用功效，据报道，蜘蛛毒液对治疗脑溢血等疾病的效果较好，可预防 癫痛、老年性痴呆、脑动脉硬化、脑供血不足、中风后遗症等疾病； 其综合利用潜力有待进一步的开发，以提高其药用价值。研究表明， 截至目前只对少数蜘蛛的丝氨酸蛋蛋白酶抑制剂进行了研究。其功能 为胰蛋白酶抑制活性、抗纤维蛋白溶解活性及神经毒性。因此，对大 腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI的研究可以进一步揭示蜘蛛自身 防御机制，又可为其在药用领域的应用提供基础数据。

发明内容

本发明目的在于提供一种大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI 基因

本发明的另一个目的在于提供一种涉及制备胰凝乳蛋白酶类抑 制剂药物、制备枯草杆菌蛋白酶类抑制剂药物和制备蛋白酶K类抑 制剂药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种大腹园蛛丝氨酸蛋白酶 抑制剂AvSPI，其氨基酸序列为：

1）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者；

2）与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在95～100%编 码相同功能蛋白质的氨基酸序列，或者；

3）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或 多个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白。

编码上述大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI的基因属于本发 明的范围，本发明提供一个大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI的核 苷酸序列如SEQ ID No.1。

本发明合成用于编码大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI的基 因，其全长为572bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。其中，该 基因ORF为432bp，该基因编码的蛋白具有144个氨基酸，其氨基 酸序列如SEQ ID No.2。

应该明确的是，本领域技术人员可根据本发明公开的SEQ ID  No.2氨基酸序列，在不影响其蛋白生物活性的前提下，对于其实施 取代、缺少和/或增加一个或多个氨基酸，蛋白质序列比对同源性在 95%以上，所得到所述蛋白的突变体序列。因此本发明还包括对SEQ  ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺少和/或增加一个或多个氨基酸 得到高同源性且具有生物活性和相同功能的衍生蛋白。

本发明还提供了一种含有权利要求大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制 剂AvSPI基因的供体质粒，供体质粒是pFastBac1。

本发明还提供了一种含有大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI 基因的大肠杆菌DH10Bac菌株。

本发明还提供了一种含有大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI 基因的重组病毒基因组。

作为优选方案，上述重组病毒基因组为重组杆状病毒基因组 Bacmid DNA

本发明提供了一种大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI制备方 法，包括以下步骤：将由SEQ ID No.1中第15位至第446位核苷酸 克隆入pFastBac1（购于Invitrogen）质粒的多克隆位点，获得重组供 体质粒pFastBac1-AvSPI，再将重组供体质粒pFastBac1-AvSPI转入大 肠杆菌DH10Bac（购于Invitrogen）菌株中，使其在大肠杆菌体内进 行转座，产生含AvSPI基因的重组杆状病毒基因组Bacmid DNA，将上 述重组杆状病毒基因组Bacmid DNA转染sf21细胞获得重组杆状病 毒AcMNPV-AvSPI，再用AcMNPV-AvSPI感染sf21细胞至细胞出现肿 胀和破裂，收集细胞培养液，用Ni²⁺-NTA亲和层析纯化，即制得重组 大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI全序列氨基酸 结构经蛋白质数据库进行搜寻比对分析，未发现有任何相同蛋白。本 发明的大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI编码基因经基因数据库 进行搜寻比对分析，未发现任何相同基因。

2、本发明克隆了一个大腹园蛛的丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI基 因的cDNA全长，该基因具有SEQ ID No.1中的碱基序列，编码具有 SEQ ID No.2中的氨基酸序列，氨基酸序列比对结果显示，AvSPI同 时含有TIL（Trypsin Inhibitor Like Cysteine Rich Domain）和Kunitz 两种结构域，体外重组了该基因的编码蛋白，重组蛋白具有较强的胰 凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K抑制活性。该基因及其 重组蛋白活性的研究，对进一步了解同时含有TIL和Kunitz两种结 构域与其他已报道丝氨酸蛋白酶之间的差异及该抑制剂基因在大腹 园蛛先天性免疫中的作用，对研制新的人类疾病防治药物具有重要的 意义。

附图说明

图1为AvSPI cDNA全长序列及其编码的氨基酸序列，其中方框 内为起始密码子和终止密码子，下划虚线为信号肽序列，单下划线部 分为TIL结构域，双下划线部分为Kunitz结构域，灰色背景方框为 保守半胱氨酸残基，灰色背景圆框为反应位点P1残基，斜体加粗为 可能的多腺苷酸化信号。

图2为AvSPI中TIL结构域与TIL家族其他成员的序列比对， 其中保守的半胱氨酸残基用黑色圆点标出，黑色星号所标示的为反应 位点P1残基。

图3为AvSPI中Kunitz结构域与Kunitz家族其他成员的序列比 对，其中保守的半胱氨酸残基用黑色圆点标出，黑色星号所标示的为 反应位点P1残基。

图4为重组大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI的纯化电泳图。

图5为重组大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI的糖蛋白染色电 泳图。

图6为重组大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI对胰凝乳蛋白酶 抑制活性，误差棒表示平均值的标准误（n=3）。

图7为重组大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI对枯草杆菌蛋白 酶A的抑制活性，误差棒表示平均值的标准误（n=3）。

图8为重组大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI对蛋白酶K抑 制活性，误差棒表示平均值的标准误（n=3）。

图9为pFastBac1的图谱。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明 的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI基因的克隆和序 列分析

大腹园蛛cDNA文库构建：利用Promega公司的SV Total RNA  Isolation System从大腹园蛛组织中提取总RNA，根据Synthesis Kit及Gigapack III Gold Cloning Kit （Stratagene）试剂盒使用说明书分离纯化mRNA，合成cDNA第一 条链、第二条链，补平cDNA末端，连接EcoR I接头并磷酸化，Xho I限制性内切酶消化，获得两端具有不同粘性末端的完全单向cDNA。

将该片段插入Uni-ZAP XR Vector（lambda phage）。经包装，滴 度测定和扩增，利用Help Phage和SOLR菌株从Uni-ZAP XR Vector上体外切割噬菌体。

大腹园蛛cDNA文库EST序列的大规模测定：文库中筛选阳性 克隆，使用载体通用引物T3进行序列测定，利用DNAMAN软件将 获得的EST数据进行聚类拼接，生成拼接而成的Contigs和未拼接的 Singletons。分别将所获得Contigs与Singletons在NCBI数据库中进 行BLASTx分析。对比对结果进行分析寻找出与丝氨酸蛋白酶抑制 剂基因同源的EST序列。

SEQ ID No.1为目的基因大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI基 因的核酸序列，AvSPI cDNA序列全长572nt（SEQ ID No.1中第1 位至572位核苷酸），开放阅读框（ORF）为432nt（SEQ ID No.1中 第15位至446位核苷酸），共编码144个氨基酸（SEQ ID No.2中第 1位至144位氨基酸），其中包括一个含有15个氨基酸残基组成的信 号肽（SEQ ID No.2中第1位至15位氨基酸），预测编码蛋白的分子 量为14432.06Da，等电点为4.23，由一个含有10个半胱氨酸残基的 TIL结构域和一个含有6个半胱氨酸残基的Kunitz结构域组成，属于 丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。

利用MacVector(ver.6.5,Oxford Molecular Ltd.,Oxford,UK)软件 将AvSPI中TIL与Kunitz结构域分别与TIL家族（AMCI、BiVSPI、 ATI、BSTI、AcCI、Ixodidin和BmSI-7）和Kunitz家族（BmCI、cVamChi、 Oh11-1、BF9和HlChI）其他成员进行比对分析。结果由图2和图3 所示，与TIL家族其他成员相比，AvSPI中TIL结构域含有高度保守 的10个半胱氨酸残基，共形成5对二硫键（1-7、2-6、3-5、4-10和 8-9），AvSPI中TIL结构域属于典型的TIL家族丝氨酸蛋白酶抑制剂， 根据Bania等对TIL类蛋白酶抑制剂反应位点P1残基的研究，预测 AvSPI中TIL结构域中P1反应位点为Arg残基。同时，Kunitz家族 其他成员进行比对分析显示，AvSPI中Kunitz结构域含有高度保守的 6个半胱氨酸残基，共形成3对二硫键（1-6、2-4和3-5），AvSPI中 Kunitz结构域属于典型的Kunitz家族丝氨酸蛋白酶抑制剂，预测 AvSPI中Kunitz结构域中P反应位点为Leu残基。AvSPI与目前所报 道的丝氨酸蛋白酶抑制剂其他成员不同，根据上述的保守半胱氨酸数 目和结构域，推测本发明所述的AvSPI为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的 新成员。

实施例2大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI真核表达和纯化

对AvSPI基因整个开放阅读框（SEQ ID No.1中第15位至446 位核苷酸）进行PCR扩增，

引物序列如下：

正向引物为5’-ccggaattcatgaaagtcttggtgctgttatca-3’，

                 EcoRI

反向引物为5’-cggggtaccttaatgatgatgatgatgatgagccagacaagtagcttcgcattc-3’

                 KpnI

以文库中筛选的EST质粒为模版，扩增条件为：94℃预变性2 分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒， 共30个循环；最后延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖电泳分离割胶 回收纯化（promega）目的片段，经限制性内切酶EcoR I和Kpn I消 化后与同样被EcoR I和Kpn I消化后的pFastBac1在T4连接酶的作 用下进行连接，获得重组供体质粒pFastBac1-AvSPI。

重组供体质粒经测序验证后转入大肠杆菌DH10Bac菌株中，使 其在大肠杆菌体内进行转座，产生含AvSPI基因的重组杆状病毒基因 组Bacmid DNA，将上述重组杆状病毒基因组Bacmid DNA转染sf21 细胞获得重组杆状病毒AcMNPV-AvSPI，再用AcMNPV-AvSPI感染 sf21细胞至细胞出现肿胀和破裂，收集细胞培养液，用Ni²⁺-NTA亲 和层析纯化，用10%Tricine–SDS-PAGE进行检测，结果如图4所示， 重组杆状病毒AcMNPV-AvSPI侵染sf21细胞可高量表达重组AvSPI。 纯化后蛋白经糖蛋白染色试剂盒(GelCode Glycoprotein Staining Kit， Pierce,Rockford,IL,USA)检测显示，重组大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制 剂AvSPI为糖蛋白，结果见图5。后续活性实验中所述重组AvSPI采用 Bio-Rad Protein Assay试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行蛋白 浓度测定。

实施例3重组大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI对不同丝氨 酸蛋白酶的抑制活性

不同浓度的重组大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI溶解于 0.05M Tris-HCl（pH=8.0）缓冲溶液分别与胰凝乳蛋白酶（终浓度 为100nM）、枯草杆菌蛋白酶A（终浓度为100nM）和蛋白酶K（终 浓度为100nM）于0.05M Tris-HCl缓冲液于37℃下孵育30分钟后， 再加入终浓度为0.5mM发色底物 succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(Suc-AAPF-pNA,Sigma)启动反 应，应用Bio-rad（美国）公司生产的iMark吸收光酶标仪监测A410 的数值，加入同体积的0.05M Tris-HCl缓冲溶液与空白对照，此实 验重复3次，取平均值。结果见图6、图7和图8，重组大腹园蛛丝 氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI能很有效的抑制胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋 白酶A和蛋白酶K的活性。

综合上述研究结果：本发明克隆得到了一个含有TIL和Kunitz 两种结构域的新型丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI，制备了重组大腹园蛛 丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI并验证了AvSPI对胰凝乳蛋白酶、枯草 杆菌蛋白酶A和蛋白酶K具有很强的抑制活性。重组大腹园蛛丝氨 酸蛋白酶抑制剂AvSPI可能有助于胰凝乳蛋白酶类抑制剂、枯草杆菌 蛋白酶类抑制剂和蛋白酶K类抑制剂药物的开发与应用。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明 做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实 施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施 例，这些实施例都属于本发明保护范围。