一种从金银花中分离纯化绿原酸及3,5-二咖啡酰奎尼酸的方法

摘要

本发明涉及从金银花中分离纯化绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸的方法，是以金银花为原料，经过下述步骤：（1）金银花粗提物的制备；（2）萃取；（3）大孔吸附树脂分离纯化；（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到2种高纯度的成分，经鉴定分别是绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸。本工艺过程绿色环保，对环境无严重危害,综合成本低。

说明书

技术领域

本发明属于化工领域，具体是涉及一种从金银花中分离纯化绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸的方法。

背景技术

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thumb.）的干燥花蕾或带初开的花，性寒，味甘，归肺、心、胃经，具有清热解毒、凉散风热的功能，用于治疗急性扁桃体炎、咽炎、乳腺炎、痢疾、肺炎、流感、肝炎、阑尾炎等疾病。金银花含有酚酸、黄酮、皂苷、挥发油等多种成分，其中酚酸类成分（包括绿原酸、咖啡酸、异绿原酸等）为主要活性成分。异绿原酸是结构极为相近的7种异构体的混合物，其中3，5-二咖啡酰奎尼酸是其中含量最高的一种。药理实验及临床实践表明金银花中的酚酸类化合物具有显著的抗癌、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、保肝利胆、降血脂、止血、增强免疫等药理作用，此外还可以促进胃液分泌及胃肠蠕动。除了其药用价值以外，金银花在保健食品、化妆品等许多领域也具有广阔的市场前景。

有关金银花中绿原酸的提取、分离、纯化研究的报道很多，但是涉及3，5-二咖啡酰奎尼酸的研究报道非常少，为了实现对金银花的综合利用，本发明提供了一种简单快速的从金银花中分离纯化绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单快速的从金银花中分离纯化绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸的方法。

本发明的方案如下：

从金银花中分离纯化绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸的方法，其步骤为：

（1）金银花粗提物的制备：取粉碎好的金银花，用70%乙醇（盐酸调pH至4左右）加热回流提取，过滤，乙醇提取液经减压浓缩得粗提物浸膏。

（2）萃取：将上述粗提物浸膏溶于70℃左右的热水中，加盐酸调pH至2左右，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得金银花总酚酸提取物。

（3）大孔吸附树脂分离纯化：将金银花总酚酸提取物上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再依次用20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液为流动相梯度洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，浓缩得样品1，收集80%乙醇洗脱部分，浓缩得样品2。

（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：将样品1和样品2分别用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为C₁₈ SMB 100柱，流动相为甲醇-水，检测波长为325 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。 

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时提取时间为1-3小时，提取次数为2-6次。更加优选的是，提取时间为2小时，提取次数为4次。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时所用乙醇的浓度为50%-95%（优选70%）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）对金银花总酚酸粗提物的粗分离所用的HPD系列的大孔吸附树脂的型号有100、400、500、600、722和826（优选400）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（4）对样品1的分离纯化所用甲醇的浓度为15%-25%（优选20%），对样品2的分离纯化所用甲醇的浓度为30%-40%（优选35%）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（4）分离纯化用甲醇-水溶液进行洗脱，洗脱液的流速为20-30 mL/min（优选25 mL/min）。

本发明涉及从金银花中分离纯化绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸的方法，步骤为：（1）金银花粗提物的制备：取粉碎好的金银花，用70%乙醇（盐酸调pH至4左右）加热回流提取，过滤，乙醇提取液经减压浓缩得粗提物浸膏。（2）萃取：将上述粗提物浸膏溶于70℃左右的热水中，加盐酸调pH至2左右，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得金银花总酚酸提取物。（3）大孔吸附树脂分离纯化：将金银花总酚酸提取物上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再依次用20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液为流动相梯度洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，浓缩得样品1，收集80%乙醇洗脱部分，浓缩得样品2。（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：将样品1和样品2分别用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为C18 SMB 100柱，流动相为甲醇-水，检测波长为325 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。该工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

本发明从金银花中分离纯化绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸的方法，首先用萃取的方法将酚酸类化合物自粗提物中提取出来，同时还可以将粗提物中绝大多数强极性杂质除去，这一点可以从图1中看出；再用大孔吸附树脂对金银花总酚酸提取物进行粗分离，经过粗分离可以对化合物实现分组，这一点可以从图2和图3中看出；最后用半制备型高效液相色谱法进行分离纯化就可以得到2种化合物，所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图6和图7中看出。除此之外，还具有如下优势：

（1）金银花粗提物溶于热水，调至弱酸性后经乙酸乙酯萃取可以除去绝大多数强极性杂质，使混合物的组成得到了简化，可以为后续的分离工作降低难度，并且可以保护半制备型高效液相色谱柱不被污染，有效地延长了色谱柱的使用寿命。

（2）用大孔吸附树脂对金银花总酚酸提取物进行粗分离，用水作流动相可以除去绝大多数强极性杂质，用不同浓度的乙醇-水溶液梯度洗脱可以使混合物实现分组，组成得到简化，并且大孔吸附树脂可以经过再生后重复使用多次。

（3）用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到2种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。

（4）纯化过程中不使用对环境和人体危害大的氯仿等有机溶剂，洗脱液经减压蒸馏回收后可以重复使用多次，绿色环保。

（5）优化了层析方法的条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和效率都大为提高。

附图说明

图1是金银花总酚酸提取物的高效液相色谱图。

图2是样品1的高效液相色谱图。

图3是样品2的高效液相色谱图。

图4是样品1的半制备型高效液相色谱图。

图5是样品1的半制备型高效液相色谱图。  

图6是绿原酸的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图7是3，5-二咖啡酰奎尼酸的高效液相色谱图及紫外光谱图。

在图1-7中，I：绿原酸；II：3，5-二咖啡酰奎尼酸。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自济南试剂总厂，所用水为去离子水。

实施例：从金银花中分离纯化绿原酸及3，5-二咖啡酰奎尼酸的方法，其步骤为：

（1）金银花粗提物的制备：取粉碎好的金银花，用70%乙醇（盐酸调pH至4左右）加热回流提取，过滤，乙醇提取液经减压浓缩得粗提物浸膏。

（2）萃取：将上述粗提物浸膏溶于70℃左右的热水中，加盐酸调pH至2左右，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得金银花总酚酸提取物。

（3）大孔吸附树脂分离纯化：将金银花总酚酸提取物上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再依次用20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液为流动相梯度洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，浓缩得样品1，收集80%乙醇洗脱部分，浓缩得样品2。

（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：将样品1和样品2分别用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为C₁₈ SMB 100柱（400 mm×25.4 mm I. D., 10 μm，成都格莱普科技有限公司），流动相为甲醇-水（样品1：20：80；样品2：35：65；V/V），检测波长为325 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。 

发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30 mL/min（优选25 mL/min），优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：

表一 样品1的半制备型高效液相色谱分离条件

 洗脱液条件实施例125%甲醇-水等度洗脱实施例220%甲醇-水等度洗脱实施例315%甲醇-水等度洗脱实施例4甲醇-水梯度洗脱

在实施例1中，采用25%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分洗脱时间较短，但相互之间分离效果不够理想，所得成分纯度较低。实施例2中采用20%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例3中采用15%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分分离良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。

图4是当选用实施例2体系时的层析色谱图，由图4可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，纯度高于95%，这一点可从图6中看出。

表二 样品2的半制备型高效液相色谱分离条件

 洗脱液条件实施例540%甲醇-水等度洗脱实施例635%甲醇-水等度洗脱实施例730%甲醇-水等度洗脱实施例8甲醇-水梯度洗脱

在实施例5中，采用40%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分洗脱时间较短，但相互之间分离效果不够理想，所得成分纯度较低。实施例6中采用35%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例7中采用30%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分分离良好，但分离时间太长。实施例8采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。

图5是当选用实施例6体系时层析色谱图，由图5可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，纯度高于98%，这一点可从图7中看出。

经现代波谱数据证实所提取纯化得到的2个化合物的化学结构式如下：

 

2个化合物的鉴定结果如下：

化合物1（绿原酸）：¹H-NMR (400 MHZ, DMSO-d6): d ppm: 12.44 (1H, br, COOH), 9.62 (1H, s, 4’-OH), 9.21 (1H, s, 3’-OH), 7.54 (1H, d, J=16.0 Hz, H-7’), 7.11(1H, d, J=2.1 Hz, H-2’), 6.96 (1H, dd, J=8.2, 2.1 Hz, H-6’ ), 6.80 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5’), 6.27 (1H, d, J=16.0 Hz, H-8’), 5.61 (1H, s, 1-OH), 5.30 (1H, m, H-3), 5.15 (1H, s, 4-OH), 4.96 (1H, s, 5-OH), 4.19 (1H, m, H-5), 3.74 (1H, m, H-4), 2.00~2.25 (4H, m, H-6, H-2). ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): d ppm: 179.7 (COOH), 167.8 (C-9’), 149.0(C-4’), 146.2 (C-3’), 146.0 (C-7’), 127.1 (C-1’), 122.5 (C-6’), 116.2 (C-2’), 115.3 (C-5’), 115.0 (C-8’), 75.8 (C-1), 73.1 (C-3), 71.1 (C-4, C-5), 38.9 (C-6), 37.7 (C-2) .  

化合物II（3，5-二咖啡酰奎尼酸）：¹H-NMR (400 MHZ, CD₃OD): d ppm: 12.56 (1H, br, COOH), 9.69 (1H, s, 4’-OH), 9.66 (1H, s, 4’-OH), 9.20 (1H, s, 3’-OH), 9.18 (1H, s, 3’-OH), 7.54 (1H, d, J=16.0 Hz, H-7’), 7.50 (1H, d, J=16.0 Hz, H-7’), 7.01 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2’), 6.98 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2’), 6.79 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5’), 6.77 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5’), 6.91~6.85 (2H, m, H-6’), 6.27 (1H, d, J=16.0 Hz, H-8’), 6.18 (1H, d, J=16.0 Hz, H-8’), 5.49 (1H, s, 1-OH), 5.35 (1H, m, H-3), 5.30~5.25 (1H, m, H-5), 5.21 (1H, s, 4-OH), 3.87 (1H, m, H-4), 2.22~2.05 (2H, m, H-6), 2.15~2.10 (2H, m, H-2). ¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): d ppm: 177.4 (COOH), 169.0 (C-9’), 168.5 (C-9’), 149.6 (C-4’), 149.5 (C-4’), 146.8 (C-3’), 146.7 (C-3’), 147.4 (C-7’), 147.2 (C-7’), 127.9 (C-1’), 127.8 (C-1’), 123.3 (C-6’), 123.0 (C-6’), 115.6 (C-2’), 115.4 (C-2’), 116.4 (C-8’), 116.3 (C-8’), 115.4 (C-5’), 115.2 (C-5’), 74.5 (C-1), 72.5 (C-5), 72.1 (C-3), 70.6 (C-4), 37.7 (C-2), 36.8 (C-6) . 

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。