一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法

摘要

本发明提出了一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法，其包括：（1）将核酸酶GR-5与互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面；（2）将待测样品加入到步骤（1）所得到的PCR反应容器中，其中，在铅离子存在时，在所述核酸酶GR-5的作用下，所述互补DNA在核糖核苷酸处发生断裂，以便产生短核酸链；（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去未固定化的核酸分子；（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对固定的互补DNA进行实时荧光定量PCR；（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct值，确定所述样品中的铅离子浓度。该方法可以提出了一种全新的、简单快速的、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测样品中铅离子的浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及化学领域，具体地，涉及一种确定样品中铅离子浓度的方法，更具体地，涉及一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法。

背景技术

铅及其化合物是一种带有剧毒的全球性环境污染物之一。在汽车尾气、塑料燃烧的烟气、油漆、劣质儿童玩具、铅酸蓄电池、工业电镀、冶炼产生的废水中也有大量的铅，食品中的爆米花、皮蛋、锡箔纸包装的食物中也含有铅，这些铅最终富积在水中并无法降解，对环境生命体对人特别是对儿童的危害极大，其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调和肾损伤、生殖系统损伤等。由于人们对铅污染的高度关注，对铅离子的痕量检测技术要求也越来越高，铅离子含量指标成为被关注的热点之一。

对铅离子的检测方法主要有：原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、阳极溶出伏安法、示波极谱法、生物染色剂试纸法等。但这些方法往往还需要大量的预处理，增加了很多成本，而且对操作人员有很高的技术要求，所以对铅离子简便、快速的高选择性、高灵敏度的检测方法仍是不断探索和实践的方向。

因而，目前的铅离子检测方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。

根据本发明的实施例，本发明提出了一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法，其包括：（1）将核酸酶GR-5与互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面；（2）将待测样品加入到步骤（1）所得到的PCR反应容器中，其中，在铅离子存在时，在所述核酸酶GR-5的作用下，所述互补DNA在核糖核苷酸处发生断裂，以便产生短核酸链；（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去未固定化的核酸分子；（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对固定的互补DNA进行实时荧光定量PCR；（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，确定所述样品中的铅离子浓度。该方法可以提出了一种全新的、简单快速的、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测样品中铅离子的浓度。

根据本发明的实施例，核酸酶GR-5是一种特异性识别Pb²⁺离子的核酸酶，在Pb²⁺存在的情况下，核酸酶的互补链会在其核糖核苷酸处即rA处裂解，产生两条短的核酸链。

实时荧光定量PCR技术是90年代中期发展起来的一种生物技术，该技术为进行基因定量的表达研究提供了有力地解决方法。实时荧光定量PCR的主要技术优势在于，它可以通过加入荧光染料实时检测PCR过程中扩增产物的积累，了解PCR产物动态增加的全过程。目前该技术已经在生物化学、生物技术等科学技术领域得到了广泛的应用。

根据本发明的实施例，利用核酸酶GR-5在金属铅离子存在的情况下，核酸酶的互补链会在其核糖核苷酸处即rA处裂解，产生两条短的核酸链。然后基于实时荧光定量PCR技术，开发了一种简便、快速、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测水中铅离子的含量，极大地提高了铅离子的检测限。

根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征：

在本发明的一个实施例中，所述核酸酶GR-5具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并且所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的5’末端被生物素修饰。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，所述互补DNA具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。并且所述SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列被核糖核苷酸rA修饰。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，在步骤（1）中，将核酸酶GR-5与互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括：用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理；用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理；向所述PCR反应容器中加入所述核酸酶GR-5与互补DNA，以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述核酸酶GR-5与互补DNA。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，步骤（1）进一步包括：用20微升0.8%的戊二醛溶液在37摄氏度下对所述PCR反应容器进行处理5小时，并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗；用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37摄氏度下对所述PCR反应容器处理2小时，其中链霉亲和素在所述PCR容器中的终浓度为12.5 ng/mL，并用PBST溶液进行清洗，其中，所述PBST溶液含有10mM PBS，pH 7.2，0.05% Tween-20；向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为10nM的所述核酸酶GR-5与互补DNA的混合物，在37摄氏度下反应40分钟，并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗，其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mM NaCl，75mM C₆H₅Na₃O₇。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，所述待测样品中铅离子浓度不低于0.07ng/mL。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，所述待测样品中铅离子浓度为0.1ng/mL~50 ng/mL。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，所述引物组由下列引物构成：

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’（SEQ ID NO：3）

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’（SEQ ID NO：4）。

由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，基于下列线性方程，确定所述样品中铅离子的浓度：y=0.91748x+6.90575，y为所述实时荧光定量PCR的Ct 值，x为相应的铅离子浓度。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

根据本发明的实施例，基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，确定所述样品中的铅离子浓度是通过将所述实时荧光定量PCR的Ct 值与标准曲线进行比较而完成的，其中，所述标准曲线是基于已知铅离子浓度分别为0.1nM、0.5 nM、1nM、5 nM、10nM、50nM的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，利用不同铅离子浓度标准样品进行实时荧光定量PCR所得到的扩增曲线，其中铅离子浓度分别取0.1nM、0.5 nM、1nM、5 nM、10nM、50nM。

图2显示了根据本发明一个实施例的铅离子标准曲线图。

图3 显示了根据本发明一个实施例的铅离子的特异性分析图。 

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

实施例1 设计与合成相应的寡核苷酸片段；

发明人设计了一段能够对铅离子具有依赖性的核酸酶GR-5，并在其5’段进行生物素化修饰。设计出互补DNA，最后根据此序列来设计实时荧光定量PCR用的上下游引物。序列通过DNA合成仪制备。

核酸酶GR-5：

5’-biotin-GGCTACGAGGGAAATGCGGTAATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTAGTG-3’ （SEQ ID NO：1）。

互补DNA：

5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCTTACCACTrAGGAAGAGATGATT-3’ （SEQ ID NO：2）

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’ （SEQ ID NO：3）

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’ （SEQ ID NO：4）

实施例2  DNA的杂交与的固定；

首先，向PCR管加入20μL0.8%的戊二醛溶液在37°C处理5小时，然后用超纯水清洗三次。

接下来，用20μL溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37°C再次处理2小时，其中链霉亲和素12.5 ng/mL。处理完后紧接着用PBST（10mM PBS，pH 7.2，0.05% Tween-20）清洗。

接下来，将核酸酶GR-5与互补DNA的混合液 20μL分别加入到PCR管中，其中核酸酶GR-5与互补DNA的浓度都是100nM，并在37°C反应40分钟。

最后，用柠檬酸钠缓冲液（750mM NaCl，75mM C₆H₅Na₃O₇）清洗3次。来去除没有固定的DNA。

实施例3  标准曲线的建立

依次向实施例2中所得到的PCR管中加入铅离子20μL, 使其最终浓度为 0.1nM、0.5 nM、1nM、5 nM、10nM、50nM，并在37°C反应40分钟，最后用柠檬酸钠缓冲液清洗3次，来清洗去除没有反应的DNA。最后依次向PCR管中加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR。

铅离子标准曲线的建立：利用实时荧光定量PCR仪测定不同铅离子浓度下扩增曲线的循环数，根据测定的不同铅离子浓度下扩增曲线的循环数，绘制铅离子浓度的标准曲线。

发明人发现：标准曲线的线性方程为y=0.91748x+6.90575，y为不同汞离子浓度下扩增曲线的循环数，x为相应铅离子的浓度，线性相关性>0.99。本传感器的线性范围0.1-50ng/mL，检测限为0.07ng/mL。

实施例4 铅离子的特异性测定；

取6个PCR管，重复实施例2后，依次向所得到的PCR管中加入Pb²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺各20μL。在37°C反应40分钟，最后用柠檬酸钠缓冲液清洗3次，来清洗去除没有反应的DNA。最后向PCR管中加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR。结果如图3所示。由实验结果得知本发明基于PCR技术的铅离子检测新技术具有很高的特异性。 

实施例5 实际添加样品的测定；

向自来水样品中分别添加0.5nM、2nM及10nM的铅离子，采用本发明的方法测定实际样本中的铅离子，结果总结于表1中。

表1.  自来水样品添加汞离子的测定

如表1所示，本发明的方法对铅离子含量的回收率在94%-105.00%之间，标准差小于4.66%，能够完全满足现实生活中对铅离子的检测需求。

                         序列表

 

<110>  常熟理工学院

 

<120>  一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法

 

<130>  xb13121301

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  核酸酶GR-5

 

<400>  1

ggctacgagg gaaatgcggt aatcatctct gaagtagcgc cgccgtagtg                50

 

 

<210>  2

<211>  69

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  互补DNA

 

<400>  2

aatctggttt agctacgcct tccccgtggc gatgtttctt agcgccttac cactraggaa     60

 

gagatgatt                                                             69

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  上游引物

 

<400>  3

aatctggttt agctacgcct tc                                              22

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  下游引物

 

<400>  4

gtaaggcgct aagaaacatc g                                               21