黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白、截短片段及其重组表达载体和应用

摘要

本发明公开了黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白（Bb toxin）、截短片段及其重组表达载体和应用，黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其截短片段如SEQ ID NO.8所示，家蚕幼虫添食截短片段后家蚕存活率明显下降（约30%），表明该基因编码的是一个可导致鳞翅目昆虫家蚕致死的毒性蛋白，能够用于制备抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白（Bb toxin）和黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段，还涉及含黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的重组表达载体和应用。 

背景技术

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白（Bt Cry）对鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）等多种昆虫具有杀虫活性。Bt Cry基因导入烟草和番茄并表现出抗虫特性后，又相继获得抗虫转基因的玉米、水稻、马铃薯、甘蓝、棉花、杨树等。以我国的转基因棉花为例，每年带来的直接经济效益达150亿元，每亩增收节支150元左右，减少化学农药用量2000-3000万公斤。但长期使用Bt Cry转基因作物也导致抗性昆虫的相继产生，如棉铃虫（Helicoverpa armigeraHubner）、小菜蛾（Plutella xylostella）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）等。早在2007年，科研工作者采用两种不同类型的Bt Cry协同组合使用来应对抗性昆虫的蔓延，这种方式虽然在一定程度上可以延缓Bt Cry抗性昆虫的产生，但没有从根本上解决问题，还会出现对Bt Cry更高抵抗性的害虫，最终促使Bt Cry应用于作物防虫的价值消失，有可能导致农业昆虫灾害的新一轮大爆发。因此，从其它物种的基因组中鉴定新的与抗虫害相关的基因，应用于作物的分子育种，缓解或替代害虫对转Bt作物的抗性是当前农业迫切需要解决的科学问题。 

黑胸败血芽孢杆菌（Bacillus bombyseptieus，简称Bb）是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，对昆虫具有强烈致病性，但对其致病机制研究报道较少。16s rRNA进化分析表明Bb与Bt在进化上具有较近的亲缘关系；参与Bt致病的相关基因都不同程度地被Bb诱导表达且其表达模式与Bt类似，暗示Bb可能具有类似于Bt的致病机制；另外，Bb类似于Bt，在形成芽孢的同时也能产生蛋白性质的伴孢晶体毒素，而Bb感染后在中肠上形成孔洞，暗示Bb伴孢毒素蛋白具有类似于Bt Cry的重要的生物学功能。因此，对Bb伴孢晶体毒素蛋白的鉴定和全长序列克隆，将在对阐明Bb毒素蛋白致病性和致病机理产生重要的理论价值和实践意义。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段，本发明的目的之二在于提供上述截短片段的编码基因；本发明的目的之三在于提供黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白；本发明的目的之四在于提供黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的编码基因；本发明的目的之五在于提供含有所述编码基因的重组表达载体；本发明的目的之六在于提供含有所述重组表达载体的工程菌；本发明的目的之七在于提供黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段或黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的应用。 

1.黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段，所述截短片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。 

2.所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段的编码基因。 

优选的，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。 

3.黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 

4.所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白的编码基因。 

优选的，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

5.含有所述编码基因的重组表达载体。 

优选的，所述重组表达载体是将SEQ ID NO.7所示的核苷酸连入pET28a载体的Nde I和Xho I酶切位点处。 

6.含有所述重组表达载体的工程菌，优选的工程菌为大肠杆菌BL21。 

7.所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段或所述黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白在制备抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂中的应用。 

优选的，所述鳞翅目害虫为家蚕。 

本发明的有益效果在于：本发明从病原微生物黑胸败血芽孢杆菌中分离到一个导致家蚕幼虫致死的伴孢晶体毒素蛋白，并克隆到编码该蛋白的基因，还获得一个具有活性的伴孢晶体毒素蛋白截短片段，家蚕幼虫经口添食该截短片段后可导致家蚕死亡，因此伴孢晶体毒素蛋白及其截短片段是除Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白外唯一一个经口饲养家蚕可导致家蚕死亡的伴孢晶体毒素蛋白，这将为抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂提供新的靶标。 

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图： 

图1为分离纯化获得的黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白（M：标准蛋白Marker；1：纯化获得的黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白）。 

图2为黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白与不同类型的Bt Cry毒素蛋白进化分析（Bt  Cry1Aa（Genbank:AAA22353.1）；Bt Cry2Aa（Genbank:AAA22335.1）；Bt Cry3Aa（Genbank:AAA22336.1）；Bt Cry4Aa（Genbank:CAA68485.1）；Bt Cry5Aa（Genbank:AAA67694.1）；Bt Cry6Aa（Genbank:AAA22357.1）；Bt Cry7Aa（Genbank:AAA22351.1）；Bt Cry8Aa（Genbank:AAA21117.1）；Bt Cry9Aa（Genbank:CAA41122.1）；Bt Cry10Aa（Genbank:AAA22614.1）；Bt Cry11Aa（Genbank:AAA22352.1）；Bt Cry12Aa（Genbank:AAA22355.1）；Bt Cry13Aa（Genbank:AAA22356.1）；Bt Cry14Aa（Genbank:AAA215163.1）；Bt Cry15Aa（Genbank:AAA22333.1）；Bt Cry16Aa（Genbank:CAA63860.1）；Bt Cry17Aa（Genbank:CAA67841.1）；Bt Cry18Aa（Genbank:CAA67506.1）；Bt Cry19Aa（Genbank:CAA68875.1）；Bt Cry20Aa（Genbank:AAB93476.1））。 

图3为黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白在BL21中诱导表达电泳检测（1：对照沉淀；2：对照上清；3：16℃诱导20h沉淀；4：16℃诱导20h上清；5：37℃诱导4h沉淀；6：37℃诱导4h上清）。 

图4为黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段在BL21中诱导表达电泳检测（1：对照沉淀；2：对照上清；3：16℃诱导20h沉淀；4：16℃诱导20h上清；5：37℃诱导4h沉淀；6：37℃诱导4h上清）。 

图5为SDS-PAGE电泳检测Ni柱亲和层析纯化获得黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段。 

图6为家蚕添食黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段结果（A：存活率统计结果，其中1为添食等体积PBS的家蚕存活率；2为添食黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短片段的家蚕存活率；B：添食PBS后家蚕存活照；C：添食黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白截短后家蚕死亡照片）。 

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1、Bb toxin的分离纯化、活化和质谱鉴定 

根据苏云金芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白（Bt Cry1Ac）的分离纯化方法来纯化黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白（Bb toxin），具体为：将Bb菌接种于含有5mL LB培养基（胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl1%，pH7.2）的试管中，30℃，250r/min摇床培养过夜；以1%的体积接种于LB培养基中，30℃，250r/min培养大约34-38h，从34h开始，取样进行油 镜观察伴孢晶体和芽孢的产生；将菌液于4℃，7000rpm离心15分钟；用预冷的1M NaCl洗涤，以除去培养基中的杂蛋白，4℃，8000rpm离心15分钟（重复2次）；用预冷的灭菌水洗涤2次；沉淀中加入100mL裂解液（50mM Na₂CO₃，25mM EDTA，高温灭菌后加5%-巯基乙醇，用NaOH调pH到9.5），冰浴摇床轻摇12小时；然后在4℃，8000rpm离心30分钟，取上清倒入干净的离心管中，加入7mL4M的醋酸钠-醋酸缓冲液（pH4.5），用乙酸调pH至4.5；将离心管静置于冰上4小时使蛋白完全沉淀；再在4℃，12000rpm离心30分钟，取沉淀洗涤两次，以除去巯基乙醇；将所得的沉淀在4℃下溶于50mM Na₂CO₃（pH9.5），搅拌至完全溶解；用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）测定纯化获得Bb toxin蛋白浓度和SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示。电泳检测结果显示大约在40KD处获得了单一条带的蛋白，命名为黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体毒素蛋白，简称Bb toxin，然后将其分装保存于-80℃。 

将Bb toxin与胰蛋白酶（购自Sigma）以质量比为25:1混合，在37℃下温育6小时；然后加入1/10体积4M醋酸钠-醋酸缓冲液（pH=4.5），4℃冰箱静置15分钟，12000rpm离心10分钟，取沉淀，加入双蒸水振荡溶解，重复该步骤三次；所得的沉淀用50mM Na₂CO₃（pH=10）溶解，得到有活性的Bb toxin毒素蛋白单体；用BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE电泳明确其的纯度，蛋白浓度为0.278ug/μL。 

将纯化获得的Bb toxin毒素蛋白用酸溶胶原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）酶解，酶解后样品重溶在质量分数为0.1%三氟乙酸（TFA）中，与基质（8mg/mL甲位己基桂醛HCA，50%醋酸-硝酸纤维素CAN，0.1%TFA）混合点靶，采用AB SCIEX TOF/TOF^TM5800质谱仪进行质谱鉴定；质谱数据采集：先用MS反射模式得到一级图谱，一级MS激光总shots750次，然后用interpretation方法自动选择母离子做二级，二级MS/MS激光总shots2500次，碰撞能量2KV，并运用Dynamic Exit算法进行MSMS数据采集；利用ProteinPilot4.0对Bb基因组数据库进行检索，结果如表1所示。由表1可知，最终比对到一个基因编号为Bb001019的蛋白，即Bb toxin。 

表1Bb toxin质谱鉴定比对Bb基因组数据库结果 

根据Bb基因组序列，对Bb toxin的全长CDS进行预测分析，获得了594bp的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。与目前已报道的300多种Bt Cry毒素蛋白进行序列同源性分析，结果如图2所示。结果显示序列相似性不高于10%；同时，与Bt Cry1Aa-Cry20Aa进化分析，发现Bb toxin与Bt Cry6Aa和Bt Cry15Aa聚成一簇，暗示纯化获得的Bb toxin伴孢晶体毒素蛋白与Bt Cry具有较近的亲缘关系，可能具有类似于Bt Cry伴孢晶体杀死昆虫的毒性功能。 

实施例2、Bb toxin克隆、原核表达及其截短片段表达和纯化 

根据Bb基因组序列设计了特异引物，Bb toxin的正向引物：5'-ccatatggtgagtctgaaaaagaaattagg-3'（SEQ ID NO.2），反向引物5'-ccctcgagttatttttcttccccagctt-3'（SEQ ID NO.3）。以Bb基因组DNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，然后95℃变性40秒、54℃退火40秒、72℃延伸50分钟，共28个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T Simple载体连接，连接反应在Solution I连接酶作用下，在16℃条件下连接2h，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆pMD19-T Simple/Bb toxin后送往华大基因公司测序，测序结果表明成功克隆了Bbtoxin基因的CDS序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 

提取重组质粒pMD19-T Simple/Bb toxin，然后用Nde I和Xho I进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收Bb toxin酶切片段，同时用Nde I和Xho I双酶切pET28a原核表达载体获得pET28a载体酶切片段，Bb toxin酶切片段和pET28a酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，获得pET28a-Bb toxin重组质粒载体；重组质粒pET28a-Bb toxin转化大肠杆菌BL21表达感受细胞，加入IPTG至终浓度为0.2mM后在16℃条件下培养20h和37℃条件下培养4小时分别进行Bb toxin毒素蛋白诱导表达，SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示。结果显示Bbtoxin全长蛋白没有被诱导表达。 

由于原核表达系统未能表达全长的Bb toxin蛋白，同时考虑到Bt Cry伴孢晶体毒素也是要被中肠蛋白酶在N端水解后才能形成有活性的单体毒素行使生物学功能，因此Bb toxin也可以被胰蛋白酶水解形成有活性的单体毒素蛋白。因此，对Bb toxin伴孢晶体毒素的N端氨基酸序列不断的截短来获得可融表达的截短Bb toxin蛋白。设计Bb toxin的截短引物，正向引物：5'-cccatatgagcgataaagaagtatcaaaca-3'（SEQ ID NO.5），反向引物5'-ccctcgagttatttttcttccccagctt-3'（SEQ ID NO.6）。以pMD19-T Simple/Bb toxin质粒为模板进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，然后95℃变性40秒、54℃退火40秒、72℃延伸50分钟，共28个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，用 Nde I和Xho I进行双酶切后用AxyPrep^TM PCR cleanup试剂盒清洗PCR酶切产物，将截短Bbtoxin酶切片段和pET28a酶切片段进行连接转化，得pET28a-Bb toxin截短片段重组表达载体。将pET28a-Bb toxin截短片段重组表达载体送往华大基因公司测序，测序显示Bb toxin截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。提取重组质粒载体，转化表达感受细胞BL21，加入IPTG至终浓度为0.2mM后在16℃条件下培养20h和37℃条件下培养4小时分别进行诱导表达，SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示。结果显示在16℃和37℃条件下在上清中都获得了可融形式表达的Bb toxin截短片段。 

Bb toxin截短片段的亲和层析纯化：重组质粒菌扩大培养后用7000rpm离心10分钟收集，PBS清洗3次，液氮反复冻融3次后超声波破碎30min，16000rpm离心30分钟收集上清，上清用0.45μm滤膜抽滤；抽滤后的上清上柱到用PBS平衡过的Ni亲和柱中，分别用30mL PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS快速冲洗柱子以洗去未结合的蛋白，分别用10mL含100mM、500mM和1M咪唑的PBS缓慢冲洗柱子并收集洗脱液，大约每2mL收集一管，将收集到的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测以丢弃含有杂蛋白的洗脱液，用PBS溶液进行透析36小时，每8小时换透析液一次，最后进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图5所示。结果表明分离纯化获得了单一条带的Bb toxin截短毒素蛋白，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度，浓度为1.12μg/μL。 

实施例3鳞翅目昆虫家蚕添食Bb toxin截短片段的存活率检测 

取鳞翅目昆虫家蚕DZ品种蚕卵浸酸（盐酸比重为1.073，温度为46℃，时间为5分钟）以解除滞育，放于15℃和85%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境（温度：25℃，湿度：80%）中用桑叶饲养至4龄期。 

4龄期家蚕幼虫饥饿6h后，以60ug/头经口添食截短的Bb toxin伴孢晶体毒素蛋白，设置2个重复区，每个重复区40头蚕，同时设置2个添食相同体积PBS的4龄期家蚕作为对照区，连续统计存活率和死亡率，结果如图6A所示。结果显示，添食截短的Bb toxin毒素蛋白后家蚕幼虫的死亡率明显高于添食PBS的对照组，其中添食截短的Bb toxin存活率降低约30%。然后观察添食PBS后家蚕幼虫正常存活的照片（图6B）和添食截短的Bb toxin毒素蛋白后家蚕死亡照片（图6C） 

通过添食截短的Bb toxin毒素蛋白来观察Bb toxin伴孢晶体毒素蛋白对鳞翅目昆虫家蚕是否具有致病性。有趣的是，添食截短的Bb toxin导致家蚕幼虫存活率明显低于对照组，说明鉴定到的Bb toxin基因是编码一个可导致鳞翅目昆虫家蚕幼虫致死的伴孢晶体毒性蛋白。因此，该蛋白可作为害虫的生物农药杀虫剂，从而完成替代Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白或与不 同类型的Bt Cry毒素蛋白组合使用，来缓解或替代目前害虫对Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白形成的抗性。 

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。