一种甜叶菊毛状根诱导和培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的方法

摘要

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种采用发根农杆菌遗传转化甜叶菊建立毛状根培养体系生产绿原酸及二咖啡酰奎宁酸的方法。内容包括甜叶菊外植体制备、发根农杆菌活化培养、悬浮培养及绿原酸和二咖啡酰奎宁酸的生产。经PCR检测，证明甜叶菊毛状根为转化产生，HPLC检测表明甜叶菊毛状根能够生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸。由于所使用的毛状根具备在无激素培养基上快速生长的特性，因此该方法操作简单、成本较低、不受气候、土地等自然条件的限制等优点。为利用毛状根培养生产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸提供了一种稳定、可持续的新型药源和食品功能因子，为今后应用生物反应器进行绿原酸和二咖啡酰奎宁酸规模化生产提供可靠的来源和物质基础。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种采用发根农杆菌侵染甜叶菊诱导产生毛状 根的方法，并用此毛状根生产次生代谢产物绿原酸和二咖啡酰奎宁酸。

背景技术

植物能够产生天然药用成分，但随之也带来植物资源大量消耗的局面。利用植物生物工 程生产药用植物有效成分，能有效保护自然资源、节约土地，对于现代社会可持续发展意义 重大。植物遗传转化发根农杆菌载体系统具有遗传和生物合成的稳定性以及毛状根生长快、 易于培养、有效成分高等独特优势，为植物次生代谢物的工业化生产提供了广阔的前景。

目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化植物获得次生代谢产物的毛状根的相关研究 较多，但对遗传转化甜叶菊获得产绿原酸和二咖啡酰奎宁酸毛状根研究仍为空白。甜叶菊 (Stevia rebaubiana)，双子叶植物纲，属菊料斯台维亚属的一种小型多年生草本植物，又名甜 草、甜菊、甜茶等。原产南美洲亚热带地区，巴拉圭和巴西交界的阿曼拜山脉。我国自1976 年开始由南京中山植物园、中国农业科学院等科研单位先后从日本引进甜叶菊试种成功。80 年代初向全国各地推广种植，生产的甜叶菊干叶主要出口日本。甜叶菊植物体内含有很多种 物质，包括挥发油，二、三萜类，香豆素类，咖啡酸以及绿原酸等。其中，甜菊糖苷(Stevioside，St) 是甜叶菊叶子中的二萜类化合物，是天然的高甜度的甜味物质，甜度是蔗糖的200～300倍， 一直受到人们的关注。甜叶菊中还含有一类很有价值的成分绿原酸和二咖啡酰奎宁酸，但含 量较低，目前尚未得到有效利用。绿原酸，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、升高白细胞、免疫 调节、抗肿瘤、降血压、降血脂等作用。同时有研究结果表明，绿原酸是很有希望的抗艾滋 病毒(HIV)的先导化合物。二咖啡酰奎宁酸是一类由奎宁酸与数目不等的咖啡酸通过酯化反应 缩合而成的酚酸类天然成分，广泛存在于植物界如金银花、旋覆花等中药及茶叶、山楂等果 树中，具有抗肝纤维化及脂质过氧化作用。随着生物工程技术的不断提高，利用毛状根进行 离体培养快速生产有效成分，已成为药用植物资源可持续发展的有效途径之一。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种转基因技术遗传转化甜叶菊获得产药用成分绿原酸和二咖 啡酰奎宁酸的毛状根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入甜叶菊中，获得甜 叶菊毛状根，为有效利用甜叶菊资源提供一条新途径。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1、甜叶菊种子置于MS、B5、WPM等培养基培养；

2、采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA至甜叶菊叶片中，包括以下步骤：

a.发根农杆菌接种在YEB培养基活化；

b.用发根农杆菌侵染甜叶菊无菌外植体；

c.发根农杆菌与甜叶菊外植体共培养；

d.外植体在羧苄西林钠、头孢噻肟钠等抗生素除菌培养。

3、甜叶菊毛状根获得与继代培养；

4、甜叶菊毛状根的分子检测，方法如下：

a.提取甜叶菊毛状根DNA；

b.获得含有rolB和rolC引物的PCR反应体系；

c.PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

d.电泳检测目标条带。

5、甜叶菊毛状根中绿原酸的含量检测。

6、甜叶菊绿原酸和二咖啡酰奎宁酸提取和纯化

本发明中涉及的缩写术语、培养基：

1.外植体——甜叶菊无菌苗切成的茎段以及子叶节；

2.发根农杆菌培养基：YEB、LB；

3.植物基本培养基：MS(Murashige and Skoog,1962)、B5、WPM、White；

4.抗生素：利福平Rif(Rifampicin)、卡那霉素(kan)、头孢噻肟钠Cef(Cefotaxime)、羧苄西 林钠Cb(Carbenicillin)等抗生素。

本发明方法的有益的效果体现在：：

1、在本发明中，利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入甜叶菊细胞获得毛状根， 通过筛选优良无性系，获得绿原酸和二咖啡酰奎宁酸含量相对较高而稳定的毛状根无性 系，为甜叶菊的生产提供一种新型优质的可持续药源和食品功能因子；

2、与田间栽培甜叶菊相比，甜叶菊毛状根可获得稳定质量和产量，不受自然条件的限制，不 占用耕地面积，可以工业化连续生产；

3、通过人工调控优化培养条件，可显著提高毛状根的生长和次生代谢产物的积累，具有可调 节性；

4、该技术在毛状根培养过程中，不添加任何激素，因此，可以大大降低成本。

附图说明

附图1为甜叶菊无菌苗照片。

附图2为发根农杆菌诱导产生的毛状根照片。

附图3为毛状根在固体培养基上快速生长照片。

附图4为毛状根rol基因的PCR检测照片。

附图5为液体培养的甜叶菊毛状根照片。

附图6为甜叶菊毛状根中绿原酸含量。

具体实施方式

以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属 技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的 目的。

实施例1 甜叶菊无菌外植体的获得

人工去除甜叶菊种子上的冠毛，在20-40℃水浴锅内保温1-28小时，滤纸吸干，将甜叶菊 种子用70％酒精消毒20-60S，用无菌水冲洗2-3次，再用0.1％的汞液消毒2-20min，用无菌水冲 洗5-6次。接种在固体培养基上，该培养基配方为：MS基本培养基，10～60g/L蔗糖，0.01～1mg/L NAA和0～1mg/L BA，再添加7-8g/L的琼脂粉。温度25±2℃条件下培养，黑暗培养10-20d， 然后移至光室，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d，得到无菌苗。

实施例2 发根农杆菌遗传转化甜叶菊获得毛状根

1、发根农杆菌的活化

将发根农杆菌接种于含利福平等抗生素的YEB固体培养基，挑取单菌落，接种在含利福 平等抗生素YEB液体培养基中，温度28～30℃，转速50～400r/min，震荡过夜培养，再取活 化后的菌液10-500μL加入到10～50mL含Rif等抗生素的YEB(LB)液体培养基中，温度28℃， 50～400rpm震荡暗培养至OD值为0.5-1.0。

2、发根农杆菌的重悬浮

室温10000～5000rpm离心2-20min，弃上清，菌体用等体积的1/2MS重悬浮，在25-35℃， 50-200rpm震荡暗培养半小时，使菌液浓度达到OD600＝0.2-1.5左右，用于侵染。

3、外植体的预培养

剪取培养在MS固体培养基上的甜叶菊无菌苗叶片和茎段外植体，接种到含有AS的MS 培养基中，25℃暗培养2d。

4、发根农杆菌于甜叶菊共培养

将上述经预培养的甜叶菊叶片外植体(如幼嫩叶片)，放入含活化好的上述发根农杆菌工 程菌的1/2MS悬液中浸泡10min(轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的叶片 用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2-6d。

5、甜叶菊的除菌培养

将共培养3d后的甜叶菊叶片用无菌水冲洗数次后用无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于 除菌培养基1/2MS+100-500mg/LCb上除菌培养，7-10天后，转接到1/2MS+400～600mg/L头 孢噻腭钠(Cef)上，在此期间，甜叶菊叶片的伤口处将会陆续出现白色毛状根；1-2周后将 其转接到1/2MS+100～300mg/L头孢噻腭钠(Cef)上，1-2周后再转到1/2MS+100～300mg/L 头孢噻腭钠(Cef)上，两周后基本除菌完毕后，转移至不含抗生素的1/2MS培养基上。培 养条件为25±2℃，黑暗培养。

6、毛状根优质株系的筛选

挑选除菌彻底、经过PCR检测的毛状根，将分枝多、生长快速的毛状根转移至1/2MS 培养液中，进行继代培养。

实施例3 甜叶菊毛状根的分子检测

1、甜叶菊毛状根基因组DNA的提取，方法如下：

1)取幼嫩甜叶菊毛状根100-200mg，加入液氮磨成粉末；

2)将磨成粉末的甜叶菊毛状根装入1.5mlEppendorf的离心管中，加入600μl经60℃预热 的2×CTAB以及10μl的巯基乙醇，混匀后置于60℃水浴锅中40-50min，期间不时颠倒混匀；

3)待裂解液冷却至室温后加入等体积苯酚(pH8.0)，轻柔翻转混匀，静置10min；

4)12000rpm，离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；

5)加入等体积酚：氯仿(1：1)，轻柔翻转混匀，静置10min；

6)12000rpm，离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；

7)加入等体积氯仿，轻柔翻转混匀，静置10min；

8)12000rpm，离心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取时记下体积；

9)加入两倍体积遇冷的无水乙醇，析出絮状沉淀；

10)用吸头将白色絮状沉淀挑到EP管中，75％乙醇清洗两次，烘干；

11)加入无菌水充分溶解后再加入Rnase置于37℃水浴锅中30min，置于-20℃中备用。

2×CTAB提取液(1000ml)的配方如下：

2、甜叶菊毛状根中rolB和rolC基因的PCR检测

rolB基因扩增引物为

frolb(5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’)

和rrolb(5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’)

rolC基因扩增引物为

frolc(5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’)

和rrolc(5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’)

反应体系均为(50μL)：ddH2O16μL，Template DNA5μL，Forward Primer(10μM)2μL， Reverse Primer(10μM)2μL，2×EasyTaq PCR SuperMix25μL。

PCR反应条件为：94℃5min，35个循环(94℃60sec，55℃60sec，72℃90sec)， 72℃10min。

阳性对照为相应工程菌，甜叶菊叶片为阴性对照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检 测。rolB的扩增条带大小为423bp，rolC为626bp。

实施例4 甜叶菊毛状根中主要有效成分的测定

1、甜叶菊毛状根中主要有效成分的提取

收获甜叶菊毛状根，60℃烘干，研成粉末。称取0.2g左右粉末，加入5mL60％乙醇， 超声辅助提取30min，收集上清液，蒸馏水定容至10mL，制得甜叶菊毛状根提取液。

2、对照品标准曲线的制作

准确称取绿原酸标准品3.8mg，3，5-二咖啡酰奎宁酸3.7mg，4，5-二咖啡酰奎宁酸3.9mg， 1mL甲醇超声溶解，制得3.8mg/mL绿原酸、3.7mg/mL3，5-二咖啡酰奎宁酸、3.9mg/mL4，5- 二咖啡酰奎宁酸标准溶液，吸取一定量标准溶液，用蒸馏水稀释，得到0.095mg/mL，0.0925 mg/mL和0.0975mg/mL标准溶液，0.22μm微孔滤膜过滤，HPLC分析。色谱条件：高效液 相色谱仪(Agilent1260)，色谱柱为Waters C₁₈柱(4.6mm×250mm，5um)；流动相为甲醇- 醋酸水(梯度洗脱)，洗脱条件如下：

0 min    甲醇：水(含0.2％醋酸)＝30：70

10 min   甲醇：水(含0.2％醋酸)＝30：70

15 min   甲醇：水(含0.2％醋酸)＝55：45

25 min   甲醇：水(含0.2％醋酸)＝55：45

30 min   甲醇：水(含0.2％醋酸)＝30：70

流速：1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长：327nm。以相同浓度不同体积进样，得到色谱 图及色谱参数，分别以峰面积和含量(μg)进行线性回归，以含量为横坐标，对照品峰面积 为纵坐标，绘制标准曲线。

3、甜叶菊毛状根中绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸含量的测定

HPLC含量测定结果：甜叶菊毛状根中绿原酸的含量高达35.2mg/g，高于正常根(0.61 mg/g)和叶片(8.25mg/g)，分别是正常根的57倍和正常叶片的4.27倍；3，5-二咖啡酰奎宁酸 的含量高达55.69mg/g，分别是正常根的16.67倍(3.34mg/g)和叶片的1.93倍(28.8mg/g)； 4，5-二咖啡酰奎宁酸的含量为4.9mg/g，是正常根的4倍(1.22mg/g)，叶片的0.21倍(23.08 mg/g)。甜叶菊毛状根生长速度快，绿原酸含量高，可以成为工业化生产绿原酸的一种很有效 的方式。

实施例4 甜叶菊绿原酸和二咖啡酰奎宁酸提取和纯化实例

甜叶菊毛状根经干燥处理后，粉碎处理，加入1-100倍的水，蒸煮提取2～3次，合并提 取液，过滤，55-80℃减压浓缩，调至pH2-4，大孔树脂吸附，上柱吸附流速1-6BV/h，之后 用10-80％的乙醇，pH6-9，洗脱液流速1-4BV/h，进行洗脱，洗脱体积为3-8BV，减压浓缩回 收，得到产品。