植物光合作用相关蛋白OsPSF1及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种植物光合作用相关蛋白及其编码基因和应用，植物光合作用相关蛋白其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，编码该蛋白的基因其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示或SEQIDNO:3所示，或其简并序列。将本发明基因导入水稻过表达，能够互补水稻psf1突变体的黄叶表型，并提高氧化胁迫处理后转基因植株叶片的光合速率。本发明植物光合作用相关蛋白OsPSF1的基因组基因及其cDNA基因为培育具有经济价值的高光效作物提供了基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物光合作用相关蛋白OsPSF1及其编码基因和应用。 

背景技术

植物利用光能将二氧化碳和水转变成碳水化合物并释放氧气的过程称为光合作用。光合作用是生物界赖以生存的基础，也是地球碳氧循环的重要媒介。叶片是高等植物进行光合作用的主要场所，在这个过程中，首先由位于叶绿体内的叶绿素捕获光能并传递到光合反应中心，从而开始了能量的转化过程。光合作用被认为是地球上最重要的化学反应，光合作用是作物产量形成的物质基础, 90~ 95% 的植物干重来自光合产物。目前，我国水稻光能利用率很低，一般只有0.5~1.0%左右，最高的也不过2%。理论上，植物光能利用率可达13~14% ，水稻理想的光能利用率应达3~5%，所以提高水稻高光效具有很大潜力。 

如何充分利用照射到地球表面的太阳辐射能进行光合作用，是农业生产中的一个根本性问题。作物对光能的利用是一个综合过程, 影响作物光能利用率的原因很多，大体可以分为作物本身特征以及光照、温度、二氧化碳、水分和旱涝、盐碱、病虫害等外界环境变化。提高作物光效需要提高最适条件下的光能利用率以及作物对非最佳外界环境的适应，可以分为叶绿体水平、单叶水平、植株水平以及群体水平不同层次的策略。本发明鉴定出一个新的影响植物光合作用的相关因子，可以作为设计培育高光效种质的靶点。 

发明内容

本发明的目的是提供一种植物光合作用相关蛋白及其编码基因和应用，将该编码基因导入水稻中过表达，能够提高转基因水稻光合作用效率。 

本发明提供的植物光合作用相关蛋白（OsPSF1, Oryza sativa photosynthesis factor 1），来源于粳稻品种“日本晴”（Oryza sativa subsp. japonicacv. Nipponbare），其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 

SEQ ID NO:1的序列由172个氨基酸残基组成。 

本发明还提供将SEQ ID NO:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由SEQ ID NO:1序列衍生的蛋白质。 

为了使所述的植物光合作用相关蛋白（OsPSF1）便于纯化，可在由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 

表1 标签的序列 

标签残基序列Poly-Arg5-6（通常为5个）RRRRRPoly-His2-10（通常为6个）HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag 8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

上述由SEQ ID NO:1序列衍生的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，其编码基因可通过将SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还提供一种编码所述植物光合作用相关蛋白（OsPSF1）的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或SEQ ID NO:3所示，或其简并序列。 

同时，本发明还提供如SEQ ID NO:2所示或SEQ ID NO:3所示的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。 

本发明还提供在在严格条件下与SEQ ID NO:2所示或SEQ ID NO:3所示的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；同时还提供与该DNA分子具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；所述严格条件可为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65^oC下杂交,然后用2×SSC,0.1% SDS和1×SSC,0.1% SDS各洗膜一次。 

SEQ ID NO:3所示的DNA分子由3734个核苷酸组成，自5’端1-1495位为启动子，1496-1839为第一外显子，2179-2299为内含子，2583-3191为第二外显子。 

本发明还提供所述基因的重组表达载体。 

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。 

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 

所述重组表达载体是将所述基因插入pCAMBIA1300和pCAMBIA2300的多克隆位点得到的重组质粒。 

含有以上任一所述基因（OsPSF1）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。 

扩增所述基因（OsPSF1）全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 

本发明还提供所述的基因在培育光合效率提高的转基因植物中的应用。 

上述应用是将编码所述植物光合作用相关蛋白的基因导入目的植物（如植物细胞或组织）中，得到光合效率高于所述目的植物的转基因植物。具体地，将所述重组表达载体导入目的植物中，得到转基因植物的光合效率高于所述受体植物。 

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得耐旱能力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。 

实验表明，将本发明的编码调控植物光合作用相关因子OsPSF1的DNA序列导入水稻中过表达，能够提高转基因水稻光合作用效率。本发明的编码调控植物光合作用相关因子OsPSF1的基因组基因及其cDNA基因为培育其他具有经济价值的高光效植物提供了基础。 

附图说明

图1为从突变体库中筛选出的psf1突变体，其中A为2周龄野生型和psf1突变体幼苗，B为2周龄野生型和psf1突变体叶片。 

图2为psf1突变体叶片叶绿素含量，其中A为野生型和psf1突变体叶片叶绿素a和叶绿素b总量，B为野生型和psf1突变体叶片叶绿素a与叶绿素b比值。 

图3为psf1突变位点测序谱图。 

图4为互补转基因植株叶片叶绿素含量。 

图5为互补转基因植株PCR鉴定。 

图6为互补转基因植株测序图谱。 

图7为过表达转基因植株PCR鉴定。 

图8为过表达转基因植株RT-PCR鉴定。 

图9为过表达转基因植株叶片光合速率的测定。 

  

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。 

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，实验均设置三次重复，结果取平均值。 

实施例1：psf1突变体的筛选及突变基因的图位克隆

一、水稻突变体库的筛选

        取2000g粳稻品种“日本晴”（Oryza sativa subsp. japonicacv. Nipponbare）（中国农业科学院作物科学研究所，编号WD-10576；原始来源不清）种子，先用水浸种16小时，再用0.5%的甲基磺酸乙醋(EMS)在28℃下处理12小时，然后用大量自来水冲洗10遍，得到M1种子，将M1种子播种，单株收获，得到M2突变体库。

将2000份M2突变体种子萌发，在2周幼苗期观察叶片颜色，发现一浅黄色突变体，命名为psf1，如图1所示。80%丙酮提取野生型和psf1突变体叶片色素，比色法测定叶绿素含量，结果如图2所示，psf1叶绿素a和b均减少，总量仅为野生型植株的50%，叶绿素a/b是野生型的5倍，表明叶绿素b比叶绿素a降低的幅度更大(图2AB)。 

二、psf1突变体突变基因的图位克隆 

将psf1突变体与日本晴野生型回交，统计F2回交分离群体幼苗中浅黄叶植株与绿叶植株的比例，结果如表2所示。对3个独立的F2回交群体浅黄叶与正常叶色植株的比例按卡方检验和二项式检验两种方法分析发现符合单基因控制的1:3分离比(表2)。

表2 psf1突变体回交F2代植株浅黄叶与绿叶正常植株分离比 

 将psf1突变体与Dular的杂交获得F1，F1自交得到F2群体，利用SSR分子标记对352个F2浅黄叶分离单株连锁分析发现该突变位点与分子标记Chr7-20.1和Chr7-20.2紧密连锁，对该区段全部8个ORF测序发现psf1突变体ORF7第284位T突变为G，编码氨基酸由中性的亮氨酸变为碱性的精氨酸，而Dular该位点与野生型相同(图3)。ORF7编码一个推测定位于质体的具有ankyrin结构域的蛋白，我们命名为OsPSF1蛋白(LOC_Os07g33660)。

  

实施例2：OsPSF1 cDNA和基因组基因的克隆

一、OsPSF1 cDNA的克隆

取0.2g粳稻品种“日本晴”（Oryza sativa subsp. japonicacv. Nipponbare）的叶片，液氮研磨，TRIzol法提取总RNA。取2μg总RNA用M-MLV反转录酶进行反转录，合成cDNA第一链，以此为模板，以特异引物对甲进行PCR反应。PCR产物经电泳分离回收后，克隆到pEASY-T（北京全式金生物技术有限公司），命名为pEASY-T-OsPSF1ORF，进行测序。

特异引物对甲如下： 

上游引物：5’-ATGGCATCCATCCCGTGCAC-3’；

下游引物：5’-TCAGGCGGCCAAGGTGGCGG-3’。

测序结果表明，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质。 

二、OsDRPSF1基因组基因的获得 

CTAB法提取日本晴叶片的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以特异引物对乙进行反应。PCR产物经电泳分离回收后，克隆到pEASY-T（北京全式金生物技术有限公司），进行测序。

特异引物对乙如下： 

上游引物：5’-GTGTGCTGTTGTCCCAGTATG-3’；

下游引物：5’-AACCTGTTAGCCCTACGAGTG-3’。

测序结果表明，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。 

将SEQ ID NO:1所示的蛋白质命名为OsPSF1，将OsPSF1的编码基因命名为OsPSF1。将SEQ ID NO:2所示核苷酸与pEASY-T连接得到的重组质粒命名为pEASY-T-OsPSF1。 

  

实施例3：psf1突变体的功能互补

一、pCAMBIA1300-OsPSF1表达载体的构建

1、用限制性内切酶XbaI和KpnI酶切实施1中重组质粒pEASY-T-OsPSF1，回收包含OsPSF1序列 的3.7kb片段。

2、用限制性内切酶XbaI和KpnI酶切pCAMBIA1300（Cambia，GPO Box 3200， Canberra, ACT 2601，Australia），回收骨架。 

3、将步骤1得到的片段和步骤2得到的片段连接，得到pCAMBIA1300-OsPSF1。 

二、转基因植物的获得 

1、利用电击法将重组表达载体pCAMBIA1300-OsPSF1导入农杆菌AGL0（ATCC? BAA-100www.atcc.org）。

5、将含有pCAMBIA1300-OsPSF1的农杆菌AGL0侵染psf1突变体诱导产生的胚型愈伤组织，然后在MS培养基 (含有30mg/L潮霉素) 中筛选抗性愈伤组织，每代15天，共计3代，而后将抗性愈伤组织诱导成完整植株，插秧于大田，收获转基因植物的T1代种子。 

将OsPSF1转化psf1突变体T1代种子萌发，2周后发现幼苗叶色恢复正常，测定叶绿素含量发现与野生型对照相同，显著高于psf1突变体叶绿素含量(图4)。 

CTAB法提取叶片DNA，以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)特异性引物5’-CATCGAAATTGCCGTCAACC-3’和5’-AGCCTGACCTATTGCATCTC-3’PCR检测，结果表明psf1突变体互补转基因植株(com)中有特异性扩增条带，而野生型和psf1突变体DNA无特异扩增条带(图5)。这表明载体上的筛选标记hpt基因已经导入psf1突变体互补转基因植株。 

因为pCAMBIA1300-OsPSF1质粒载体上野生型OsPSF1 DNA片段与hpt基因串联共同位于T-DNA区，可以推测野生型OsPSF1 DNA片段与hpt基因片段共同导入psf1突变体互补转基因植株中。因psf1突变体为点突变，PCR方法无法将被导入的野生型OsPSF1 DNA与psf1突变体基因组中突变片段分开，我们以OsPSF1基因特异性引物　　　5’-ATGGCATCCATCCCGTGCAC-3’和5’-TCAGGCGGCCAAGGTGGCGG-3’分别从野生型、psf1突变体和互补转基因植株基因组DNA中PCR扩增，然后将PCR产物测序，结果如图6所示。互补转基因植株(com)OsPSF1 ORF 284位呈T/G杂合，这明确证明野生型OsPSF1片段已经导入psf1突变体。 

以上结果表明，向psf1突变体中导入OsPSF1基因序列能够使浅黄色表型转变为正常叶色，进一步证明了OsPSF1基因突变是导致其呈浅黄色表型的基因。 

  

实施例4：OsPSF1在水稻中的超表达

一、pCAMBIA2300-Act-OsPSF1表达载体的构建

1、以实施1中重组质粒pEASY-T-OsPSF1ORF为模版，以下列特异性引物扩增得到OsPSF1序列。

上游引物：5’-TCCCCCGGGATGGCATCCATCCCGTGC-3’； 

　　　下游引物：5’-AACTGCAGTCAGGCGGCCAAGGTGGCGG-3’。

PCR产物电泳分离后，切胶回收520bp DNA片段，然后以限制性内切酶XmaI和PstI酶切。 

2、用限制性内切酶XmaI和PstI酶切pCAMBIA2300-ACT(Actin启动子) (Cambia，GPO Box 3200， Canberra, ACT 2601，Australia)，回收骨架。 

3、将步骤1得到的片段和步骤2得到的片段连接，得到pCAMBIA2300-Act-OsPSF1。 

二、转基因植物的获得 

1、利用电击法将重组表达载体pCAMBIA2300-Act-OsPSF1导入农杆菌AGL0。

5、将含有pCAMBIA2300-Act-OsPSF1的农杆菌AGL0侵染日本晴野生型诱导产生的胚型愈伤组织，然后在MS培养基 (含有100mg/L G418) 中筛选抗性愈伤组织，每代15天，共计3代，而后将抗性愈伤组织诱导成完整植株，插秧于大田，收获转基因植物的T1代种子。 

三、转基因植物的分子检测 

CTAB法提取叶片DNA，以Act-OsPSF1特异性引物5’-TCTGCGATCCGCCGTTGTTG-3’和5’-GCGCCTCCATCTTGTCGTAG

-3’PCR检测，结果表明转基因植株中有特异性扩增条带，而野生型DNA无特异扩增条带(图7)，这表明Act-OsPSF1已经导入转基因植株。

TRIzol方法提取2周龄野生型和Act-OsPSF1转基因植株(ox1, 2, 3)叶片总RNA，取2 μg总RNA，以2 u RQ1 RNase-free DNase (Promega) 37 °C 处理30 min，加终止反应液后，以polyA为引物，利用M-MLV反转录酶42 °C 1小时合成cDNA第一链，然后以cDNA为模板，以Actin (引物5’-GCCAATCGTGAGAAGATGAC-3’和5’-CTATGAAGGAAGGCTGGAAG-3’)为内参，PCR方法检测PSF1基因(引物5’-ATGGCATCCATCCCGTGCAC-3’和5’-TCAGGCGGCCAAGGTGGCGG-3’)表达，结果如图8所示。各植株之间Actin基因表达基本相同，而Act-OsPSF1转基因植株(ox1, 2, 3)PSF1基因表达水平约为对照植株的5-10倍。 

四、光合速率的测定 

   3周龄野生型和Act-OsPSF1转基因植株(ox1, 2, 3)叶片喷施50 μmol L^-1甲基紫精(MV)处理，以水为对照，3天后以LI6400XT(LI-COR, Inc)便携式光合仪测定3周龄野生型和Act-OsPSF1转基因植株(ox1, 2, 3)叶片的净光合速率，参数设定为CO2 400 μmol CO2 mol^-1，光强800 μmol m^-2 s^-1，温度30 °C，结果表明对照条件下转基因植株(ox1, 2, 3)与野生型叶片之间的净光合速率没有显著差异，而甲基紫精处理后转基因植株(ox1, 2, 3)叶片净光合速率高于野生型(图9)。这表明过表达OsPSF1基因能够提高转基因植株氧化胁迫后的光合速率。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120>植物光合作用相关蛋白OsPSF1及其编码基因和应用

<160> 3

<210> 1

<211>172

<212> 氨基酸

<400> 1

Met Ala Ser Ile Pro Cys Thr Phe Gln Leu Ser Ala Arg Ala Ser Ser Ala Ser Ala Ala  20

Ala Ala Ala Arg Arg Ser Pro Arg Ala Ala Ala Arg Leu Gly Trp Leu Arg Pro Ser Arg  40

Leu Ser Ala Val Val Pro Ala Ser Glu Ser Gly Arg Val Gly Pro Thr Cys Phe Phe Lys  60

Phe Gly Asn Lys Asp Ala Glu Gly Ala Gly Ile Tyr Gly Ser Gln Gly Arg Asp Asp Phe  80

Asp Arg Asp Asp Val Glu Gln Tyr Phe Asn Tyr Met Gly Met Leu Ala Val Glu Gly Thr 100

Tyr Asp Lys Met Glu Ala Leu Leu Asn Gln Asp Ile His Pro Val Asp Ile Leu Leu Met 120

Leu Ala Ala Ser Glu Gly Asp Lys Pro Lys Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ala Gly Ala Lys 140

Tyr Asp Val Lys Asp Val Asp Gly Arg Thr Ala Leu Asp Arg Ala Ala Asp Asp Thr Arg 160

Glu Phe Ile Leu Gly Phe Ala Ala Thr Leu Ala Ala                         172 

 

 <210> 2

<211>519

<212> DNA

<400> 2

 

ATGGCATCCATCCCGTGCACCTTCCAGCTGAGCGCGAGGGCGTCGTCGGC  50

GTCGGCGGCGGCGGCGGCGAGGAGGTCGCCGCGGGCGGCGGCGAGGCTGG  100

GGTGGCTGCGGCCGTCGCGGCTGAGCGCGGTGGTGCCGGCGAGCGAGAGC  150

GGGAGGGTGGGGCCGACGTGCTTCTTCAAGTTCGGGAACAAGGACGCCGA  200

GGGCGCCGGCATCTACGGCAGCCAGGGCAGGGACGACTTCGACCGCGACG  250

ACGTCGAGCAGTACTTCAACTACATGGGGATGCTGGCGGTGGAGGGCACC  300

TACGACAAGATGGAGGCGCTGCTGAACCAGGACATCCACCCGGTGGACAT  350

CCTCCTCATGCTCGCCGCCTCCGAGGGCGACAAGCCCAAGCTCGAGGAGC  400

TCCTCCGCGCCGGCGCCAAGTACGACGTCAAGGACGTCGACGGCCGGACG  450

GCGCTCGACCGCGCCGCCGACGACACCAGGGAGTTCATCCTCGGCTTCGC  500

CGCCACCTTGGCCGCCTGA  519

 

<210> 3

<211>3734

<212> DNA

<400> 3

GTGTGCTGTTGTCCCAGTATGGCACGGATCAAATTTATCCATCTTTTTTT  50

TCACCTTTACTTTTTACTGAAATTTATACACATACCCTTTTGAAGCAGAG  100

TTGCATACCCATTTTCTTTTTTTGGTTGCTATACAACGGAATCTCCTTCA  150

GACGTGATGATACCGATTAGTTATCAAGTCCTAATACCTAATCGGTATCG  200

GGTGATACATATCAAGTATCATACGATTCTACCACGTATTAGGTGATACT  250

TGGTTATTCCTATTAGGTATACGATTCTTACCACATAGAAGGTGATACTT  300

ACGAGATATTAGGTGATACCTATTAGGTATCATGCGATTCTTATCACGTA  350

GAAGGCTATACTTGCGAGATATCAGGTGATACCTATGAAGTATCAGGCGA  400

TACCTACTAGATAATAGGTGATTTCTACTGGGTATCAGAAGCTGGACATA  450

CCTGACGCCGACGCCGACGACCACTACCGCCCTTCCTCCCCTTGGCTCTA  500

GCCACCACCGCCGCTCCCTTTCCTGGCTCCGGCTACCACCGCTGCCCCTC  550

CCTCCTCTAGCTCTTGCCACCGTCACCACTGCGTTCCTTAGCTTCGGCCA  600

CCGACGCCCCTCGTCTCTTCGTTGATGTATCCCCCGCCGCCGGCTTGGCC  650

GCGACGCGCCGCTGCCTCGACGCGACACAGATGGGGTCCTCGACACCACG  700

GCAGCTCACCACAAGGGGCTCGTCGCCGGCGGCCTCGTCCTCTTCTCGCC  750

GAGCAGGTCCTCTTCCCCAGCCCGCGCCGAAGGTCCTCGCCAATAAGCGG  800

CAACCACCTCCTCCTCATGGCTCAGGCGTTCAGCTCTCGCTTCTCTTTGG  850

ATAGGCAAGGAGGACAAAGGATCCCGTCCCAACTGGATCCCGGTGCGTAG  900

CATTTCCGTTTCTTTTTTTCACATTTTTTATGGGTGTCTATTTCACATGG  950

TAATTAGACAGCTAATTCCAAGCTTAAAACCTGGCTTAATGCTACTGCTT  1000

TTTATCCTAGGAATCTATTTTGATTTCTCAAGAGGATGTCTTCTCGTAAG  1050

CTTAAAAACCATTCAAATGGTTATAAAAAAAATTCTAAAAAAATTAACAA  1100

CACTCATACAATTTACTTCCTCCGTTCAAAAAAAACCAACGGATGTGACC  1150

CCCTCCTAATACAGTAAATCTAAACAGCACTTAATCCAAATTTGTTATAT  1200

TAGGAGATGTCACATCCTTTTAGGTTGTTTTTTTGGTGACGGATTTTTTT  1250

TTTACGGAGGGATGGAGTATATCTCACACAGCTCTAGCACGTACTCCTAT  1300

CTCACACAGATTTATCACAAATCATACACTTTTTTTTAATATCTTCTACA  1350

CTGCACTTTATGAATATCTCATGTCCTGTCTTCCACAGGAAAAAAAGTGA  1400

AATAGTGAAAAGATTCAGAATTAGGAAGCATCTAATCACCTAACTTGACA  1450

GCAATCAGTTTCAAGTGGCCAAGTGCCAAACAGTTTCAAGATTACTTACA  1500

ACTTATCCGTTCCCTCCATATATCTCTCTCCCCTCTTCTCCACCTCTCGC  1550

TACTCCACCATCCAACGTGCGAGAAGCCATGGCATCCATCCCGTGCACCT  1600

TCCAGCTGAGCGCGAGGGCGTCGTCGGCGTCGGCGGCGGCGGCGGCGAGG  1650

AGGTCGCCGCGGGCGGCGGCGAGGCTGGGGTGGCTGCGGCCGTCGCGGCT  1700

GAGCGCGGTGGTGCCGGCGAGCGAGAGCGGGAGGGTGGGGCCGACGTGCT  1750

TCTTCAAGTTCGGGAACAAGGACGCCGAGGGCGCCGGCATCTACGGCAGC  1800

CAGGGCAGGGACGACTTCGACCGCGACGACGTCGAGCAGGTGAGCCAGCT  1850

TCTCGTTCTTCCTCCTCCCCATGTTGCCTTAGGTGTTCCTTGATTGCTCC  1900

AGTCCATGGGGAATGTGCTGACGAATGACTGAGATGCTACCTTACCACTG  1950

CTATATTACTTGGTGGATTGGTAATTCTGATCCTAATGTGAGACATACGA  2000

AGTAGTTGATTGCTATACTTGCTAGTTTGGTTTGAGGACAAATGATGCAG  2050

CATTTGATTTGAGTTGAATTAAGGCATGTCTTTTTCCTTATGCTTATACT  2100

TATCAACCAACATTTGAATTTTAAATTTGGAGTTGATTTAGAGGTTTTTT  2150

CATTGAAGTATATTTTTCAGCATTTGCTTTTAAATCTCTAAGAATATACA  2200

TATAAAAGTTTTATTTACAAATTACTTTTTATTTGCAAATATTCCGTTTC  2250

GCTTGCTTCGCTTATTCCGCGAATAAGCAAAACGATGGCTCGTATCATAG  2300

CCAGCAGTAGCAAAGAGGAAGAGAAGAAAAGAAAAAAACAACAATCACCT  2350

CGCAATTTAGTCTTTGTAGTTTCATGGACAAAATGCAAATTGCAGCTGCA  2400

GGGTATCTGAAATTCTGAATATGCTAATCAAGAATTCAAGATAGCTGTAG  2450

ACTAGCACATTCAGATTGAAGAACAGCACCTGAACATGGAAAGCTCTAGT  2500

GACAAGAAAGATTCAGAATAGTAACTTTGATTCCTGAGATGAGATTCTGA  2550

ATGTATCTGAATCTTTCTGTCTGCGCTTGTAGTACTTCAACTACATGGGG  2600

ATGCTGGCGGTGGAGGGCACCTACGACAAGATGGAGGCGCTGCTGAACCA  2650

GGACATCCACCCGGTGGACATCCTCCTCATGCTCGCCGCCTCCGAGGGCG  2700

ACAAGCCCAAGCTCGAGGAGCTCCTCCGCGCCGGCGCCAAGTACGACGTC  2750

AAGGACGTCGACGGCCGGACGGCGCTCGACCGCGCCGCCGACGACACCAG  2800

GGAGTTCATCCTCGGCTTCGCCGCCACCTTGGCCGCCTGATCGATCGCTT  2850

CGCCGACGACGACGACCTTGATGCCTGGATATGTTTCGGCTATACTAGTA  2900

TACTACGTATTTATCTTTTCTTATTTTTTTCTTTTTCAAGTTTCTCCAAG  2950

TTTTTCTTGTGTTTGGTAGAGTTTAGCCGGGAAATTCACAAGTTGTTTAC  3000

AGTTCAAGAGGAAGTAGCTTCATCTGTATCTTTCACTTTCTTCGCTGTGT  3050

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