一种提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法

摘要

本发明公开了一种提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法。本发明通过幼虫样品采集、表型分类、分子识别、综合评估和适时采苗等环节，在天然海区能够成功获取大量香港牡蛎稚贝。不但提高了天然采苗数量，保证了苗种质量，而且解决了以往盲目性采苗存在的数量不稳、种类混杂、多次复采等问题，这为香港牡蛎资源恢复及其养殖产业发展提供了充足的苗种来源。

说明书

技术领域：

本发明属于海洋农业中贝类苗种繁育领域，具体涉及一种提高香港牡蛎天然采苗效率的 预报方法。

背景技术：

香港牡蛎Crassostreahongkongensis是我国华南沿海养殖的主要养殖经济种，喜欢生活在 近河口或附近有淡水注入的地方，主要分布在广东、广西等地，年产量在130多万吨，产值 在80-100亿元（中国渔业年鉴，2013）。

香港牡蛎在我国已有近千年的养殖历史，传统上蚝民们是以天然采作为苗种的唯一来源。 学者们很早就开始研究牡蛎的天然采苗，包括对近江牡蛎（胡家财等，1994；陈振汉&李友， 1997；莫新，2004，钟方杰等，2012）、葡萄牙牡蛎（宋传福，2013）、长牡蛎等采苗技术研 究。但由于采苗预报精确度不足，往往会导致采苗失败，存在稳定性差，苗种相对混杂等缺 陷。尤其是与香港牡蛎生活在一起近江牡蛎，俗称红肉，是一种经济价值低劣的废品蚝，在 香港牡蛎采苗时，很有可能会有不同比例近江牡蛎苗种混淆，如果混淆比例过高，大大影响 了香港牡蛎苗种的经济价值。为此，采苗预报非常重要，传统的牡蛎采苗主要是靠定期观测， 在牡蛎繁殖季节到来之前，早早投放附着基，担心采不到牡蛎幼虫。这种做法实际上存在着 一些问题，牡蛎幼虫是否可以采得到，需要有天时地利人和，更要有科学的采苗预报技术。

发明内容：

本发明的目的是为了打破香港牡蛎苗种长期匮乏局面；提高香港牡蛎天然采苗效率；保 证采苗数量、质量；回避多次复采所带来的劳动力及其资源浪费；来提高采苗效率的一种预 报方法。

本发明提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、幼虫采集：在天然海区，当香港牡蛎进入繁殖季节时，定期采集牡蛎样品，观测是否 产卵排精，当发现牡蛎受刺激后消瘦，经过10～15天后，受精卵发育至眼点前期幼虫，采集 海区表层0.5～1m处的贝类幼虫作为样本；

b、表型分类：对采集的样品，首先通过显微镜观察分类，将牡蛎幼虫、其他双壳贝类幼 虫和藤壶幼虫进行区分，确定牡蛎幼虫的占比、牡蛎眼点前期幼虫的占比以及藤壶幼虫的占 比；

c、分子识别：随机提取若干个单个牡蛎眼点前期幼虫的DNA，用4种巨蛎属牡蛎的复 合COI引物进行复合PCR扩增（Wang&Guo,2008），再经过特异性识别，即可得知牡蛎 眼点前期幼虫的种类，确定香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例，以及其密度；

所述的4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物具体为：

COI引物1：AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG(T)G

COI引物2：AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG(C)G

COI引物3：GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG

COI引物4：AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC(A)C

LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

HC02198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

LCO1490和HC02198是巨蛎属牡蛎的通用引物，只要是巨蛎属牡蛎，用COI基因组D  NA作为模板的话，都能扩增出一条都有的条带；

d、综合评估：当香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例≥70%，香港牡蛎眼点前期幼虫 的密度≥50个/m³，敌害生物藤壶幼虫/牡蛎幼虫的比例≤10%时，即达到采苗要求；

e、适时采苗：当香港牡蛎眼点前期幼虫发育至眼点后期阶段时，发送采苗预报，投放附 着基至海区，即可采收到大量天然香港牡蛎苗种。

步骤a所述的刺激为台风或者暴雨等刺激。

所述的采集海区表层0.5～1m处的贝类幼虫作为样本，采用300目筛绢网进行优选取样。

本发明的4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物及其鉴定4种巨蛎属牡蛎的方法公开于Wang, H.,Guo,X.,2008a.IdentificationofCrassostreaariakensisandrelatedoystersbymultiple  species-specificPCR.JournalofShellfishResearch27,481–487。

本发明通过幼虫样品采集、表型分类、分子识别、综合评估和适时采苗等环节，在天然 海区能够成功获取大量香港牡蛎稚贝。不但提高了天然采苗数量，保证了苗种质量，而且解 决了以往盲目性采苗存在的数量不稳、种类混杂、多次复采等问题，这为香港牡蛎资源恢复 及其养殖产业发展提供充足的苗种来源。

附图说明：

图1实线部分是本发明的技术路线图，虚线部分为传统采苗工艺。

图2是不同发育时期牡蛎幼虫示意图。A：面盘初期幼虫；B：面盘中期幼虫；C：面盘后期 幼虫（眼点前期幼虫）；D：眼点后期幼虫。

图3是参照Wang&Guo方法利用复合COI识别牡蛎幼虫种类，A：PCR产物琼脂糖电泳图； B：示意图。注：M是2000bpDNAmarker；粗线条表示每种牡蛎的特异性片段；Ar近江牡 蛎幼虫产生183bp特异片段；An葡萄牙牡蛎幼虫产生222bp特异片段；Hk香港牡蛎幼虫产 生387bp特异片段；Si熊本牡蛎幼虫产生546bp特异片段。

具体实施方式

以香港牡蛎天然采苗为实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例1

本实施例提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法，其技术方案如图1所示，具体步骤为：

（a）、幼虫采集：于2013年6-7月，香港牡蛎繁殖季节时，在湛江官渡定期采集牡蛎样 品，观测是否产卵排精。于6月20日，台风过后，发现牡蛎消瘦，海区中就存在牡蛎幼虫， 经过15d，幼虫即发育至眼点前期幼虫，利用300目筛绢网在海区表层0.5-1.0m处收集贝类 幼虫，经过浓缩，放置于采样瓶中作为样本。

（b）、表型分类：对于采集到的样品，首先通过显微镜观察进行分类。根据牡蛎幼虫在 壳顶中后期左右壳不等大，而绝大部分其他双壳贝类幼虫左右壳大小相等这一特点进行区分。 结果发现，该海区中，大部分牡蛎幼虫已经进入眼点前期幼虫阶段，还有部分处于壳顶初期 及中期阶段（图2）；样品里面有少部分双壳类幼虫及其藤壶幼虫。应用视野法进行计数发现， 牡蛎幼虫所占比例为90%，牡蛎眼点前期幼虫所占比例为75%左右，藤壶幼虫的占比约为8%。

（c）、分子识别：对这些大个体的牡蛎眼点前期幼虫，参考包振民等的专利方法（专利 号：ZL03112331.7，发明名称：贝类遗传图谱的快速构建方法）提取单个牡蛎眼点前期幼虫 的DNA，之后按照Wang&Guo方法（Wang,H.,Guo,X.,2008a.IdentificationofCrassostrea  ariakensisandrelatedoystersbymultiplexspecies-specificPCR.JournalofShellfishResearch27, 481–487），应用4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物进行复合PCR扩增，再经过特异性片段大 小差异，即可得知牡蛎幼虫的种类，估算香港牡蛎幼虫所占比例（图3）以及密度。结果发 现，所用的100个牡蛎眼点前期幼虫中，有87个是香港牡蛎眼点前期幼虫、9个是近江牡蛎 眼点前期幼虫、4个为熊本牡蛎眼点前期幼虫，也就是说，香港牡蛎眼点前期幼虫比例为87%， 是优势群体，且存在着一些杂蚝幼虫（图3）。

所述的4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物具体为：

COI引物1：AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG(T)G

COI引物2：AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG(C)G

COI引物3：GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG

COI引物4：AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC(A)C

LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

HC02198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

LCO1490和HC02198是巨蛎属牡蛎的通用引物，如图3所示，靠近750bp附近，Ar、 An、Hk、Si都有一个条带，就是LCO1490和HC02198扩增出来的。

（d）、综合评估：经过计算，香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例为72.5%，牡蛎幼 虫的密度是107个/m³，香港牡蛎眼点前期幼虫密度为93个/m³，敌害生物藤壶幼虫/牡蛎幼虫 的比例较低≤10%。总体上来讲，基本达到了采苗要求。

（e）、适时采苗：当香港牡蛎眼点前期幼虫发育至眼点后期阶段，即眼点又黑、又大、 又圆时，发送预报，投放附着基至海区。大约经过20-30d，即可看见附着基上采集到的香港 牡蛎稚贝，密度约在1.5-3.0个/cm²，比传统采苗的0.5-1.5个/cm²提高了2-3倍。

实施例2

（a）、幼虫采集：于2013年7-8月，香港牡蛎繁殖季节时，在湛江官渡采完实施例1苗 之后，牡蛎性腺逐步恢复。于7月17日，热带风暴过后，发现牡蛎性腺再次消瘦，按照图1 所示，经过13d，幼虫即发育至眼点前期幼虫，利用300目筛绢网在海区表层0.5-1.5m处收 集贝类幼虫，经过浓缩，放置于采样瓶中作为样本。

（b）、表型分类：按照实施例1中方法，发现该海区中，大部分牡蛎幼虫已经进入眼点 前期幼虫，还有少数处于壳顶初期及中期（图2）；样品里面有少量藤壶幼虫。应用视野法进 行计数发现，牡蛎幼虫所占比例为95%，牡蛎眼点前期幼虫比例在82%左右，藤壶幼虫的占 比约为5%。

（c）、分子识别：对这些大个体的牡蛎眼点前期幼虫，参考包振民等的专利方法（专利 号：ZL03112331.7，发明名称：贝类遗传图谱的快速构建方法）提取单个牡蛎眼点前期幼虫 的DNA，之后按照Wang&Guo方法（Wang,H.,Guo,X.,2008a.IdentificationofCrassostrea  ariakensisandrelatedoystersbymultiplexspecies-specificPCR.JournalofShellfishResearch27, 481–487），应用5种巨蛎属牡蛎的复合COI引物进行复合PCR扩增，再经过特异性片段大 小差异，即可得知牡蛎幼虫的种类，估算香港牡蛎幼虫所占比例（图3）以及密度。结果发 现，所用的100个牡蛎眼点前期幼虫中，有35个是香港牡蛎幼虫、62个是近江牡蛎幼虫、3 个为熊本牡蛎幼虫，即近江牡蛎幼虫是优势群体（图3）。

（d）、综合评估：经过计算，香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例为30.2%，牡蛎幼 虫密度是96个/m³，香港牡蛎眼点前期幼虫密度为34个/m³，敌害生物藤壶幼虫/牡蛎幼虫的 比例为5.3%。由于香港牡蛎眼点前期幼虫的密度较低，且牡蛎幼虫中近江牡蛎占据比例较大， 而近江牡蛎被蚝民们成为废品蚝（红肉），经济价值远远低于香港牡蛎，养殖效益差，未达到 采苗要求，所以不能投放附着基采苗。由于近江牡蛎与香港牡蛎常常生活在一起，通常会带 来近江牡蛎被当做香港牡蛎来采苗，结果当蚝民们发现了附着基上采到是近江牡蛎的时候， 已经过了采香港牡蛎苗种时节，给蚝民的采苗工作带来了很大麻烦。

为此，等到下一批次牡蛎产卵排精以后，重复实施例1中步骤，进行综合评估，如果达 到采苗标准，及时投放附着基。如果尚未达到标准，就暂时不投放附着基，免得还的将附着 基拿上来，晒干，重下，浪费人力、物力、财力等资源。