猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种猪源衣原体(C.cuis)Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。本方法根据靶序列上MOMP的1个区域设计2条引物和一条MGB探针，可特异性的扩增猪源衣原体。该试剂盒包括扩增反应液管、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明只需两步扩增反应及信号收集就可快速、高效、特异、灵敏地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

动物衣原体病(Chlamydiosis)是由各类衣原体(Chlamydia)感染哺乳动物、禽类等动物所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病。该病呈地方流行，常造成很大危害及经济损失。衣原体科的最新分类研究表明，衣原体科（Chlamydiaceae）分为衣原体属（Chlamydia）和嗜衣原体属（Chlamydophila），包括沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、猪源衣原体(Chlamydia suis)、鼠沙眼衣原体（Chlamydia muridarum）、流产嗜衣原体(Chlamydophila abortus)、猫嗜衣原体(Chlamydophilafelis)、家畜嗜衣原体(Chlamydophila pecorum)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)和鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)。感染动物的衣原体主要有6种：猪源衣原体、猫衣原体、家畜衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体。猪源衣原体是属于衣原体属的一个种，猪是猪源衣原体的天然宿主。目前只是从猪中分离得到，在猪的肠道样品中分离率最高。猪源衣原体对养猪业有着很大的影响。各种品系的猪都能感染猪源衣原体，并导致猪的结膜炎、肺炎或无症状亚临床感染，本病对四环素敏感。从美国爱荷华州和内布拉斯加州、意大利和比利时的农场分离出对四环素不敏感的猪源衣原体，这种稳定的耐四环素表现型与染色体中存在耐药基因有关。由此可见猪源衣原体的防控对养猪业尤为重要。从而也可以通过检测猪肉食品中是否含有猪源衣原体来进一步降低感染的可能性。

 TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5^，末端，淬灭基团则在3，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3^，端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5^，外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。

    TaqMan-MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。

中国发明专利（申请号为：200910103457.4 、200910094278、200480005196.8、201310009019.8 、201180015187.7 、201110143186.2、201110279330.5 、200910200396.3、200910200393.X 、200910094272.1、200910094279.3 等）分别公开了采用荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR扩增技术检测猪源衣原体(C .cuis)的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种猪源衣原体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物的检测试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物和试剂盒检测肉制品的检测方法。

为了实现上述第一个目的，本发明提供的猪源衣原体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，包括猪源衣原体上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.1;猪源衣原体下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.2；猪源衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO.3。

为了实现上述第二个目的，本发明采用的技术方案是：猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的猪源衣原体上游引物0.4μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmmol/L的猪源衣原体下游引物0.4μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的猪源衣原体MGB探针0.4μL；

2×Premix Ex Taq缓冲液 10μL；

灭菌去离子水 7.8μL；

合计19μL，为单次反应的用量。

所述阳性对照管，管内为猪源衣原体阳性重组质粒DNA，体积为20μL；

核苷酸序列为SEQ ID NO.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.5的PCR下游引物按常规PCR进行扩增，将PCR产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。

所述阴性对照管，管内为无猪源衣原体感染猪的血液基因组DNA，体积为20μL。

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。 

为了实现上述第三个目的，提供一种猪源衣原体荧光定量PCR扩增技术快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：采用商品化的DNA提取试剂盒，提取待测样品中的DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

3）猪源衣原体实时荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s（使用ABI 7500建议采用34s） 40个循环；在60℃ 30s进行荧光信号的采集。

4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

   本发明的原理是：针对一段1000bp左右的靶序列上MOMP保守区域设计2条引物和一条MGB探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5^，端标记有报告基团FAM，3^，端标记有非淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本低信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，可以将MGB探针设计的更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率大为提高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR 固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。

TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测。现有的猪源衣原体的检测周期较长，约1天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需50min左右。

本发明的优点是（1）、不需要特殊试剂与设备；（2）、高特异性：应用MOMP的保守区段，2条引物及一条MGB探针，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.5%，假阳性率小于0.1%；（3）、快速、高效扩增：检测时间50min左右；（4）、灵敏度高：最低检测极限达到1.7×10²拷贝∕μL，比普通的PCR高100倍，其所建立的标准曲线相关系数R²=0.999，扩增效率为达到104.6％，由此可见所建立的标准曲线的扩增效率是比较好的，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性比较好，准确度比较高，标本的检出率达到98.8%；（5）、鉴定简便：通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精确的，无需电泳等其他任何分析步骤；（6）、用途：可用于猪及其相关产品的快速检测。

附图说明

图1特异性试验结果；

图2灵敏度试验结果;

图3稳定性试验结果；

图4 标准曲线的建立；

图1中：分别采用了猪源衣原体菌株VR-1474，肺炎衣原体菌株53592，流产衣原体菌株VR-656，鹦鹉热衣原体，沙眼衣原体菌株VR-878，小鼠衣原体VR-123,猫衣原体，阴性对照。

具体实施方式

实施例1，引物的设计及筛选

猪源衣原体荧光定量PCR扩增引物及探针，其设计是根据GenBank公布的猪源衣原体MOMP基因的参考序列，用MEGA5进行比对，分析序列并在其保守区域进行引物与探针的设计。采用探针设计软件Primer Express 3.0，设计4套荧光定量引物，由英骏（上海）有限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一组荧光定量PCR扩增引物，分别标记为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3。其中猪源衣原体引物组中引物上游: SEQ ID NO.1；引物下游: SEQ ID NO.2；探针: SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3的浓度分别为10 μmol/L，10 μmol/L ，10 μmol/L，体积比为1:1:1。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分别为：PCR上游引物：SEQ ID NO.4；PCR下游引物：SEQ ID NO.5；它们的体积比为1:1。

SEQ ID NO.1代表的序列为：5’-CGTCTCCATGCAAATCAA-3’。

SEQ ID NO.2代表的序列为：5’-TCGTCGATTAAGCGAGTC-3’。

SEQ ID NO.3代表的序列为:5’FAM-CAACAGTAACTGCGTATT-MGB3’。

SEQ ID NO.4代表的序列为：5’-CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3’。

SEQ ID NO.5代表的序列为：5’-GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3’。

实施例2，阳性对照品的制备

采用商品化的试剂盒提取猪源衣原体细胞培养物的核酸，将其核酸进行PCR及电泳鉴定，采用PCR上游引物SEQ ID NO.4和PCR下游引物SEQ ID NO.5进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1：10的比例和pMD19-T载体进行连接反应，4℃连接过夜，转化DH5α菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之间。从而获得阳性重组质粒DNA。

实施例3，阴性对照品的制备

采用商品化的试剂盒提取无猪源衣原体感染的猪血液基因组DNA，进行PCR及电泳鉴定。

实施例4，猪源衣原体实时荧光定量PCR扩增快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：采用商品化的DNA提取试剂盒，提取待测样品中的DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：19μL试剂盒扩增管中的扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

3）猪源衣原体荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s（使用ABI 7500建议采用34s） 40个循环；在60℃ 30s进行荧光信号的采集。

4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

实施例5，猪源衣原体实时荧光定量PCR扩增的特异性试验

采用实施例4中步骤3）的反应体系及反应条件进行特异性的试验，所采用的模板分别是猪源衣原体菌株VR-1474，肺炎衣原体菌株53592，流产衣原体菌株VR-656，鹦鹉热衣原体，沙眼衣原体菌株VR-878，小鼠衣原体VR-123,猫衣原体，阴性对照。

参见图1的结果显示：只有猪源衣原体菌株VR-1474有扩增曲线。（图中两条曲线均表示VR-1474株猪源衣原体菌扩增结果。）

实施例6，猪源衣原体荧光定量PCR扩增的灵敏度试验

    将所建立的猪源衣原体质控标准品（即前面构建的阳性质粒）进行10倍倍比稀释（1.7×10⁸拷贝/μL~1.7×10拷贝/μL），采用实施例4中步骤3）的反应体系及反应条件进行灵敏度试验，结果显示出，本发明建立的方法最低能够检测出1.7×10²拷贝/μL的DNA样品。

参见图2的结果显示；图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别为1.7×10⁸拷贝/μL、1.7×10⁷拷贝/μL、1.7×10⁶拷贝/μL 、1.7×10⁵拷贝/μL、1.7×10⁴拷贝/μL、1.7×10³拷贝/μL、1.7×10²拷贝/μL、1.7×10¹拷贝/μL、1.7拷贝/μL。

实施例7，猪源衣原体实时荧光定量PCR扩增的重复性试验

以重组质粒标准品1.7×10⁷拷贝/μL与 1.7×10⁶ 拷贝/μL为模板，采用实施例4中步骤3）的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数为 0.458％~1.174％，表明该方法具有较好的重复性。参见图3的结果显示。

实施例8，猪源衣原体荧光定量PCR扩增的标准曲线的建立

把重组质粒的标准品进行五个倍比稀释，进行标准曲线的制作，以荧光强度的对数值为横坐标，循环数为纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数R²=0.999，扩增效率达到104.6％，Y=3.2147x+41.218。由此可见本实验所建立的标准曲线的扩增效率是比较好的，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性比较好，准确度比较高。参见图4的结果显示。

SEQUENCE LISTING

 <110>  重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>  猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

<160>  5 

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400> SEQ ID NO.1

cgtctccatg caaatcaa                                                   18

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.2

tcgtcgatta agcgagtc                                                    18

        

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.3

FAM-caacagtaac tgcgtatt-MGB                                            18

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.4

ctccttrcaa gcyytgcctg t                                                  21

 

<210>  5

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.5

gtgagcwgct ctttcrtyra ttaarcg                                           27