一种新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1的制备与应用

摘要

本发明公开了一种基于白喉毒素分子（DT）效应基团DT390与肿瘤转移靶向性多肽TMTP1的三个重复序列的可靶向高转移肿瘤的新型重组融合蛋白及其制备方法，它是由白喉毒素蛋白效应基团、具有靶向高转移肿瘤导向肽TMTP1的三个重复串联序列和融合的His表达标签组成，其中DT390是白喉毒素第1-390个氨基酸。所述高转移肿瘤靶向的可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1是在大肠杆菌BL21中用37℃诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的DT390-triTMTP1蛋白。该融合蛋白可通过更大程度上达到靶向性杀灭肿瘤细胞的治疗目的，对正常细胞无明显影响，而对于有高转移潜能的肿瘤细胞，包括前列腺癌和胃癌，有显著的抑制增殖和诱导凋亡的效应，对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，并可有效抑制肿瘤转移，且对动物无明显的治疗相关毒性，并为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1的制备与应用，其技术特征在于：构建白喉毒素分子（DT）效应基团DT390与肿瘤转移靶向性多肽TMTP1的三个重复序列串联（即GGNVVRQGGGGSNVVRQGGGGSNVVRQ）的重组原核表达载体，并进行重组蛋白的制备、表达、纯化与复性。经体内外实验证实该新型可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1可作为抗肿瘤药物，能选择性杀伤肿瘤细胞，有效地抑制肿瘤的生长与转移，且对正常细胞和组织没有明显的毒副作用。本发明内容属于医药生物技术领域。 

  

背景技术

恶性肿瘤严重威胁广大人民的健康与生命，全球每年癌症新发病例约有1000万例，因癌症导致死亡的病例约700万。而转移是肿瘤细胞播散的早期事件，是导致恶性肿瘤难以根治和高死亡率的重要原因。有效控制肿瘤转移就意味着显著改善肿瘤患者的生存期。临床上治疗恶性肿瘤的常规方法主要包括手术，化疗，放疗等。手术是早期恶性肿瘤患者的首选治疗手段，化疗是最常用的辅助治疗手段，能发挥清除手术残余病灶或转移灶的作用。化疗与手术联用，能较好的控制多种类型恶性肿瘤。但是，化疗药物会引起明显的全身性毒副作用和患者的不良反应，且多疗程的重复化疗容易引起肿瘤细胞的耐药性，抵抗化疗药物的作用。随着全球老龄化社会的到来以及肿瘤发病率的不断上升，降低恶性肿瘤传统的治疗方法复发率，提高肿瘤治疗的有效率是目前对治疗恶性肿瘤的迫切要求。临床上迫切需要研发一些药物针对常规治疗效果不理想的难治性肿瘤(高转移性肿瘤，耐药性肿瘤)。靶向治疗药物应运而生，其目的是提高病灶局部的药物浓度，减少药物毒副反应，降低用药剂量，使药物能安全有效的发挥作用。 

分子靶向治疗作为近年来的一项新兴技术，引起肿瘤界的极大关注。目前放疗和化疗等常规辅助肿瘤在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也有不同程度的损伤，从而引起肿瘤治疗毒副作用，严重者可影响治疗进行、甚至危及患者生命，因此应用多肽进行肿瘤靶向性生物治疗是目前肿瘤生物治疗发展的方向。在临床上，大多数化疗药物并不是优先在肿瘤病灶浓聚。有研究表明，到达肿瘤灶的化疗药物的总量只占正常组织的5%～10%，同时化疗药物的毒副作用常常限制了化疗药物的最佳使用量，最终导致化疗不完全、早期复发和化疗耐药。迄今，已有许多优化方法被使用来提高化疗药物的选择毒性，如化疗药物的包被，单克隆抗体或肿瘤特异性受体/肽配体的导向等等。目前分子靶向诊治的手段主要有两类：单克隆抗体和靶向性多肽（Homing peptide）。靶向性多肽（homing peptide）是目前认为比较理想的一种肿瘤诊断和靶向性治疗的载体，较单克隆抗体而言，其优点为： 血浆清除速度快、高亲和力、高特异性；良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞摄取；易于化学合成和低免疫原性的特点。近十余年，国内外研究者应用肽库技术针对不同的靶点进行不同的肿瘤靶向肽筛选，例如Arap W等对乳腺癌荷瘤小鼠进行肽库筛选后获得一系列与肿瘤血管特异性结合的短肽，其中的RGD序列被证实可与整合素结合，可特异性靶向多种肿瘤。在巨大的医疗需求的推动下，利用导向肽制备用于肿瘤诊断、治疗的造影剂、药物和制备基因治疗载体制剂将有可能在数年内正式上市成为临床治疗药物，成为肿瘤现有治疗体系的一个不可缺少的组成部分，为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望。Arap W利用RGD序列与阿霉素交联后应用于荷瘤小鼠，发现药物的抗肿瘤疗效显著增加而毒性作用明显减少。新近对新多肽SP94与脂质体阿霉素交联后应用于肝癌重度联合免疫缺陷荷瘤小鼠的研究发现，优化药物释放系统增加肿瘤细胞的凋亡和降低肿瘤血管生成，从而显著增加抗瘤效应。 

免疫毒素是蛋白毒素分子(植物毒素、细菌毒素、真菌毒素、动物毒素等)与来自免疫系统的靶向分子(单克隆抗体、免疫球蛋白、生长因子等)通过化学连接或者基因工程技术偶联形成的融合毒素。近年来，随着基因工程技术的发展，一般都是采用该技术构建毒素分子与靶向分子的融合基因，然后再表达和纯化融合蛋白。常用的毒素分子通常来自细菌毒素的白喉毒素(DT)或假单胞菌外毒素(PE)。靶向性融合毒素为恶性肿瘤患者提供了一种令人鼓舞的全新治疗方法。尤其是一些对放疗，化疗等传统治疗效果不理想的患者，应用靶向性融合毒素治疗的意义更为深远。靶向性融合毒素治疗策略很简单:携带了毒素蛋白的靶向分子能识别并结合肿瘤细胞，然后进入细胞内，由毒素蛋白发挥毒性杀死细胞。多种不同的靶向分子都能用于制备靶向性融合毒素，如能识别肿瘤细胞表面特异性表位的抗体分子，或者能够识别并结合肿瘤细胞表面特殊受体的配体分子等。发挥细胞毒性作用的毒素分子通常来源于细菌(如白喉毒素DT或假单胞菌外毒素)或植物(如蓖麻毒素或相思豆毒素)。这些毒素通过不同作用机制抑制细胞蛋白质合成，引起细胞死亡。蓖麻毒素通过切断核糖体，而白喉毒素和假单胞菌外毒素通过发挥ADP-核糖基化活性抑制细胞蛋内白质合成，最终导致细胞凋亡。因为融合毒素分子只能进入表面具有导向分子识别和结合受体的细胞。所以理论上这种靶向融合毒素能选择性的最大程度杀伤肿瘤细胞，同时降低治疗的副反应。 

白喉毒素是一种毒性十分强大的细胞毒素。天然的白喉毒素分子能广谱杀伤真核细胞，通过其天然受体结合域(R区)与哺乳类动物细胞表面的肝素结合表皮生长因子受体结合，经过胞吞作用，被运输到酸性吞噬小泡，进行PH值依赖性的构型改变，酶活性域(C区)被剪切并释放到胞内。胞内的酶活性域通过催化延长因子2的ADP核糖基化，引起蛋白合成受到阻断，细胞凋亡。近年来，靶向性融合毒素的开发和应用都发展迅速。通过基因工程技术将能选择性靶向到恶性肿瘤细胞表面的配体取代白喉毒素天然受体结合域(R区)，产生大量截短或重组的白喉毒素融合蛋白。这些融合毒素代表一类新型的细胞毒性药物。与化疗药物不同，白喉毒素类融合毒素通过靶向分子引起受体介导的内吞，选择性的进入毒素敏感细胞内，引起靶细胞凋亡。迄今为止，基于白喉毒素的融合毒素主要包括:DT508-MSF，DT486-IL-2，DT390-GM-CSF，DT390-IL3，DT388-GM-CSF，DT388-IL-3，DT385-VEGF，以及DT388与μPA的融合。这些融合毒素中，nT388-IL3在临床试验中取得了一些比较好的效果，然而只有DT389-IL2重组融合毒素(地尼白介素2)被美国FDA批准上市，用于治疗成人皮肤T细胞淋巴瘤。 

采用基因工程技术连接配体和毒素的策略不仅克服了化学连接方法的缺点，还展示了其如高精确度，更强的稳定性等优点。生产的白喉毒素类融合毒素已被用于肿瘤，传染病，血液病的治疗，部分药物取得了很好的临床疗效。在毒素与配体之间增加一个连接物，通过更好的受体、配体间相互作用促使融合毒素发挥更好的效应，与血清半衰期长的配体结合能使小分子量分子的半衰期延长，根据选择性靶向肿瘤细胞表面高表达分子的策略制备的免疫毒素副作用小甚至没有副作用，且对周围正常组织显示更好的安全性。 

过去的几十年中，学者们通过培养的细胞，动物模型，以及临床病人研发了大量抗各种各样恶性肿瘤的免疫毒素。其中，由生长因子或Fv片段作为导向分子构成的小分子融合毒素的效应最好。免疫毒素在体内外实验中都显示了良好的生物效应，但实际上，到目前为止，仅仅适用于实验研究以及临床上体外应用。Woo JH等人制备的双价抗人T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(ΜCHT1)将白喉毒素与两个串联的单链抗体sFv融合表达，结果显示二价重组毒素的结合力是一价的七倍，而杀伤力增强至十倍。今后的临床应用中可以将免疫毒素与多价的靶向分子联用，以克服免疫毒素的低肿瘤渗透性，非特异性毒性和免疫原性等问题。研制开发出的靶向性抗肿瘤新型生物制剂，可有效弥补目前基因治疗靶向性的不足；同时减轻对正常组织的毒副作用，从根本上改善基因治疗的安全性问题，对高效、安全的靶向性治疗药物的研发具有指导意义，可望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。 

发明内容

基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种基于白喉毒素分子（DT）效应基团DT390与肿瘤转移靶向性多肽TMTP1的三个重复序列串联的可溶性融合蛋白及其制备方法，通过该方案获得的可溶性融合蛋白具有高效靶向抑制高转移潜能肿瘤生长与增殖、可有效抑制其转移等明显优势，而对正常的细胞或组织没有明显的毒副作用，可以弥补目前肿瘤治疗领域的不足之处，为将来肿瘤转移的生物靶向治疗提供新的选择。 

本发明的技术方案是：一种靶向高转移潜能可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1，其特征是：它是由白喉毒素蛋白效应基团、具有靶向高转移肿瘤的导向肽TMTP1的三个重复序列和融合的His表达标签组成；其中DT390是白喉毒素第1-390个氨基酸。 

所述的DT390包含白喉毒素的催化区（酶活化区，第1-193位氨基酸）、跨膜转运区(第205-379氨基酸) ；所述的具有靶向高转移肿瘤的导向肽TMTP1是该可溶性融合蛋白的羧基末端；所述的融合的His表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端。 

所述靶向高转移肿瘤的可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1是在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中用37℃诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的DT390-triTMTP1蛋白。 

与现有的免疫毒素相比，本发明达到了以下效果： 

1本可溶性融合蛋白DT390-triTMTP1构建包含白喉毒素的第1-390位氨基酸及具有靶向高转移肿瘤的导向肽TMTP1的三个重复序列，在理论上既保留了白喉毒素的杀伤效应，同时又发挥了肿瘤转移导向肽TMTP1靶向效应。由于这种全新的设计，使这一新的构建体可更大程度上实现靶向性杀灭肿瘤细胞，达到抑制肿瘤细胞生长和转移目的。此外，本发明也将为后继其他分子治疗提供一种新的设计模式。

2体外实验结果表明，该可溶性融合蛋白对于有高转移潜能的肿瘤细胞，包括前列腺癌和胃癌，有显著的抑制增殖和诱导凋亡的效应，而对正常细胞无明显影响。 

3对肿瘤动物模型的体内模型研究证实，通过腹腔注射的用药途径，该可溶性融合蛋白对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，并可有效抑制肿瘤转移，且对动物无明显的治疗相关毒性。 

4制备出肿瘤导向肽与白喉毒素的融合蛋白，作为一种有效的抗肿瘤的生物治疗制剂，由于其既具有白喉毒素高效细胞毒性，又能在高转移肿瘤细胞处富集，因此该新型可溶性融合蛋白具备临床开发应用的前景，比如在高转移的晚期卵巢癌和胃癌等患者，作为一种新的生物治疗策略。 

  

附图说明:　

图1、融合蛋白DT390-triTMTP1的构建示意图；　

图2、融合蛋白DT390-triTMTP1的三维模拟图；　

图3、融合蛋白DT390-triTMTP1的纯化的电泳图；　

图4、融合蛋白DT390-triTMTP1抑制肿瘤细胞的增殖；　

图5、融合蛋白DT390-triTMTP1诱导肿瘤细胞凋亡；　

图6、融合蛋白DT390-triTMTP1体内抗肿瘤生长作用； 　

图7、融合蛋白DT390-triTMTP1体内对肿瘤转移的抑制作用；

图8、融合蛋白DT390-triTMTP1在裸鼠体内各脏器的分布

具体实施方式： 

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

依照本发明的技术方案制备的三个重复序列的具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTP1与白喉毒素蛋白效应基团DT390融合蛋白，应用基因克隆技术，构建了三个重复序列的具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTP1与白喉毒素蛋白效应基团DT390的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。 

实现本发明的三个重复序列的具有靶向高转移潜能倾向的肿瘤导向肽TMTP1与白喉毒素蛋白效应基团DT390融合蛋白的制备方法，按以下步骤制备： 

（一）DT390-triTMTP1基因片段的获得：

在DT390-triTMTP1引物两端分别设计了限制性酶切位点Ndel和Xhol，以便定向克隆。并在下游引物上设计了一段编码三个TMTP1的序列。用上述引物从含有白喉毒素全长序列的质粒中PCR扩增，获得DT390与TMTP1融合的基因片段，简称DT390-triTMTP1片段

1. PCR扩增目的基因：

根据白喉毒素第1-390位氨基酸序列，采用引物设计软件Oligo 6.0,设计特异性扩增TMTP1-triDT390引物，在5'端分别加上Nde I和Xho I的酶切位点序列，引物序列为： 

上游: 5'- CAT ATG GGC GCT GAT GAT GTT GTT G -3'

下游: 5'- CTC GAG ATT ATT GAC GCA CCA CGT TAG AAC CAC CAC CAC CTT GAC GCA CCA CGT TTG AAC CAC CAC CAC CTT GAC GCA CCA CGT TAC CAC C -3'

以我室保存含白喉毒素的质粒作为模板：

PCR反应体系（50μl）

Taq酶  10×bμffer                            5μl

MgCl₂   (25mM)                                  3μl

dNTP  (10mM)                                   1μl

目的基因上游引物                               0.5μl

目的基因下游引物                               0.5μl

GAPDH上游引物                                0.5μl

GAPDH下游引物                                0.5μl

含白喉毒素的质粒                                 1μl

Taq酶                                                 2μl

ddH₂O                                                38μl

混匀，简单离心。基因的扩增条件为：95℃预变性5min；94℃ 30s, 60℃ 1min，5个循环；94℃ 30s, 68℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。利用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。 

（二）目的基因与T easy克隆载体的连接 

1.PCR产物纯化后与T easy载体连接过夜。

    2×bμffer              5μl 

                PCR产物              3μl

                T载体                  1μl

                T4DNA连接酶       1μl

              

Final volume           10μl 

2.大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备：

①从平板中挑取E.coli DH5α单个菌落接种于5m1 LB培养液中，37℃振摇225rpm过夜。

②按1: 100接种于150 ml LB培养液中继续振摇2-3h，至OD值为0.4-0.6。 

③将菌液冰浴10min, 4 ℃离心，4000g ×10min，收集细菌。 

④加入20 ml预冷的0.1 %CaC12，缓慢悬浮细胞，冰浴5min。 

⑤4 ℃离心，4000g ×10min，收集细菌。 

⑥加入 60 ml预冷的0.1 %CaCL2，缓慢悬浮细菌，冰浴30min。 

⑦将感受态细菌分装200μl一份，加终浓度为15%甘油保存液，-80℃保存备用。 

3.连接产物转化感受态细菌E coli.DH5α。 

①取感受态细菌，冰上解冻后加入连接产物5μl，轻轻混合后冰浴30min。 

②42℃热休克90s，迅速冰浴5min。 

③加入800μl LB培养液，37℃振摇225rpm, 60min。 

④混匀菌液，取100μl涂布于含IPTG、X-gal和Amp 100μg/μl的LB培养板上，37℃孵箱培养过夜。 

4.挑取阳性菌落，加至含Amp 100μg/ml的LB培养液5m1中，37℃ 225rpm震摇过夜，按质粒提取试剂盒说明提取质粒。 

5.Nde I和Xho I酶切鉴定后行1％琼脂糖凝胶电泳，大小相符后送上海英骏生物工程公司测序并与Genbank中序列比对。 

(三) pET-28a-DT390-triTMTP1原核表达载体的构建 

1.测序正确的含DT390-triTMTP1基因的T载体的质粒，及载体pET-28a均用Nde I和Xho I双酶切，行1％琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段及载体分别回收。

2.将目的片段与载体连接、转化、挑克隆、摇菌、提取质粒方法同上，重组质粒即为含完整DT390-triTMTP1基因的原核表达载体，命名为pET-28a-DT390-triTMTP1。用Nde I和Xho I双酶切，行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 

通过以上实验步骤得到重组融合蛋白pET-28a-DT390-triTMTP1，该融合蛋白由TMTP1的三个重复序列与白喉毒素蛋白效应基团DT390构建而成，其构建过程见图1。 

(四) DT390-triTMTP1融合蛋白的表达 

1.将重组质粒转化入原核表达宿主菌BL21（DE3）plysS，转化方法同前。挑取单菌落，接种至1ml含卡那霉素（50μg/ml）、氯霉素（34μg/ml）的LB培养基中摇菌，振摇6h～8h，PCR鉴定。分别按1:50、1:100、1:100的比例接种至5ml含卡那霉素（50μg/ml）、氯霉素（34μg/ml）的SOB培养基中；37℃剧烈振摇，直至OD值为0.6；加入IPTG至终浓度1mM、2mM；37℃继续培养，每1h取菌液1ml，培养4h；4,000g 10min收集菌体。

2.取不同诱导条件下的菌体，取一份加入超声缓冲液^*，充分混匀后液氮中冻10min，冰水中融化；简短脉冲超声（5W，30s×6次）；10，000g离心20min，其上清部分即为胞内可溶性蛋白，沉淀是胞内不可溶蛋白。另取一份加入20ml 30mMTris/HCL，20％蔗糖（pH8.0）,充分混匀后加EDTA至1mM，震荡摇匀后室温放置5-10min；8,000 4℃，10min，去除上清，重悬于20ml预冷的5mM MgSO4中，冰浴中震荡10min；8,000 4℃，10min，收集上清，即周质蛋白。 

*超声缓冲液（50Mm 磷酸钠；300mM NaCL pH 7.8） 

3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白表达情况。

① 试剂的配制： 

 30%聚丙烯酰胺：29g 丙烯酰胺溶于 80ml 三蒸水（加温至 35～37℃），再缓慢加入1g 双甲叉丙烯酰胺，边加边搅拌，加水至 100ml，滤纸过滤，置于棕色瓶中，室温保存。

 1.5mol/L Tris·Cl（pH8.8）、1mol/L Tris·Cl（pH6.8）、1mol/L Tris·Cl（pH7.4）：分别称取 18.2g、12.1g、12.1g Tris 碱，加水至 80ml，用 HCl调至相应 pH 值后，加水至 100ml。 

Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）：25 mmol/L Tris 碱，192 mmol/L 甘氨酸，0.1%SDS，用三蒸水配制。 

转移缓冲液（pH8.3）：25mmol/L Tris 碱，192 mmol/L 甘氨酸，20% 甲醇，用三蒸水配制。 

 2×SDS 凝胶加样缓冲液：50mmol/L Tris·Cl（pH6.8），20%甘油，4% SDS，0.001%溴酚兰，临用时加 5% 2-巯基乙醇。 

② 制胶 

                              分离胶和积层胶的配制成分表

       

成分                    10%分离胶(10 ml)         5%积层胶(5ml)

1.5mol/L Tris·Cl（pH8.8） 2.5ml 

1mol/L Tris·Cl（pH6.8）                                    630μl 

30%聚丙烯酰胺                   3.3ml                      830μl 

三蒸水                                 4ml                      3.4ml

10% SDS                           100μl                       50μl

10%过硫酸铵                     100μl                       50μl

TEMED                               4μl                         5μl

③上样与电泳

  取各组不同组分蛋白 20μl，加 20μl 2×SDS 凝胶加样缓冲液，混匀后置 100℃沸水中煮沸 5～10min，短暂离心，取 20μl 上样。电源正极接下槽、负极接上槽，用 60V电压至分离胶后，再用 120V电压至溴酚兰距离底线 1cm 左右。

④ 考马斯亮蓝染色：凝胶固定后浸于染色液（0.25g考马斯亮蓝R250溶于100ml脱色液中，用滤纸除去不溶颗粒）中至少30min，水洗，转入脱色液（水：甲醛：冰醋酸为45：45：10）45－60℃至完全脱色。 

4.Western Blot检测带HIS标签的融合蛋白的表达。 

① SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳同上。 

② 电转移 

 电泳完成后，取下凝胶，切去积层胶和含溴酚兰部分，并标记左上角。按下列顺序制“三明治”夹心：有孔有机玻璃板、海绵、3～5 层滤纸、凝胶、PVDF 膜或硝酸纤维素（NC）滤膜、3～5 层滤纸、海绵、有机玻璃板。在制“三明治”夹心过程中，尽量排尽气泡，制好后放入盛有转移缓冲液的转移槽，NC 膜靠近正极，用 350mA 转移 1h。

③ 免疫印迹 

A 用TBST配的 5％的脱脂奶室温封闭 1h，或 4℃过夜；

B 弃去封闭液，加用封闭液 1：250 稀释的一抗，室温振摇孵育 1h，或室温振摇30min 后，4℃过夜；

C 用TBST 洗膜 10min，3 次；

D 加入 1：200 稀释的HRP标记的二抗，室温振摇 1h；

E TBST 洗膜 10min，3次；

F 加入 ECL显色底物；

G 5min后显影（可根据结果时间递减），定影，并流水冲洗，干燥保存，照相。

(五)融合蛋白的大量诱导表达、纯化、复性及浓缩。 

1.同小量表达方法，收获1000ml菌液。 

2.包涵体的提取与纯化 

将上述方法收集的表达菌渣置-80℃冰箱冻存10分钟，然后迅速取出放入37℃水浴10分钟，再放进-80℃冰箱冻存10分钟，如此反复冻融3次。加裂解缓冲液 50ml(lysing buffer)冰上超声裂解，30HZ持续30秒，间隔30秒，重复操作直至显微镜下检测细胞破碎率≥95%。4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用裂解缓冲液(不含Triton-X1OO)冰上超声洗涤，充分重悬后再次离心。按此操作重复洗涤包涵体3次，最后在 50ml离心管中收集包涵体沉淀。加 40ml溶解缓冲液(50mMGlycine，100mM Tris buffer，pH8.0)冰上超声重悬包涵体，弃上清，用变性缓冲液(8M urea;0.IM NaH2PO4;0.01M Tris-cl，PH8.0)冰上超声重悬包涵体，然后将包涵体悬液加入含6ml50%Ni-NTA His·Bind树脂的色谱柱中。4℃反应1小时。依次经包涵体洗涤缓冲液C(8M urea；0.1MNaH2PO4；0.01M Tris-CL pH6.3)及缓冲液D(8M urea；0.INaH2PO4; 0.01M Tris-CL pH5.9)过柱洗涤。最后用洗脱缓冲液E(8M urea；0.1MNaH2PO4；0.01M Tris-CL  pH4.5)洗脱。

3.提取包涵体的量及纯度检测 

取洗脱的包涵体样品10μl，加入2.5μl5x上样缓冲液混匀，微波炉煮沸10分钟。将蛋白marker和准备好的样品进行SDS-PAGE电泳(5%浓缩胶，10%分离胶)。凝胶电泳结束后，将凝胶泡入SDS-PAGE银氨染色凝胶固定液(确保固定液充分覆盖凝胶)，水平摇床，室温固定1小时。倒弃固定液，加入适量的考马斯亮蓝染色液(R250)，水平摇床缓慢摇动，室温避光染胶过夜。次日，回收考马斯亮蓝染色液，加入双蒸水，水平摇床缓慢摇动脱色，期间多次换水至凝胶背景干净透明。

实验结果显示：取携带测序结果证实构建成功的重组表达载体菌种，大量诱导重组质粒表达，经收集细菌，冰上超声裂解释放包涵体，然后用50%Ni-NTA His·Bind树脂纯化，最后用洗脱液将色谱柱中的包涵体蛋白分次洗脱下来，分别收集每次的洗脱物，热变性后经SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，检测每次洗脱下来的融合蛋白的量及纯度。如图3所示，第一次洗脱液中就包含目的蛋白，且前3次达到洗脱峰值，之后洗脱的包涵体蛋白逐渐减少，第9次洗脱液中的包涵体蛋白浓度极低。前2次洗脱液中总白蛋含有少许非目的蛋白的杂蛋白，第3次洗脱以后，杂蛋白消失，获得了纯度极高的目的蛋白(约55kd)。 

4.包涵体复性与浓缩 

纯化的包涵体溶液按l:10的比例与稀释复性液(1mM GSH，0.2mM GSSG)混合，4℃搅拌48小时。最后用超滤管4℃，4000rpm离心浓缩复性后的融合蛋白。取20μl复性后的融合蛋白，另取 2μg，4μg，6μg，1Oμg BSA，加入相应体积的上样缓冲液混匀后，微波炉煮沸10分钟。将蛋白marker和准备好的样品进行SDS-PAGE电泳(5%浓缩胶，10%分离胶)。再按前面介绍的方法将凝胶进行固定和考马斯亮蓝染色，漂洗，观察复性后融合蛋白的浓度与纯度。

（六）重组融合蛋白DT390-triTMTP1的对多种高转移性肿瘤细胞靶向杀伤效应的体外研究 

1.细胞培养

l)用棉手套从液氮内取出保种的PC-3M-1E8，MKN-45，HEK293细胞，迅速放入37℃水浴锅内摇动，快速解冻。

2)待细胞完全解冻为悬液后，800rpm，室温离心5分钟，用75%乙醇喷洒消毒，超净细胞台内用 1ml加样枪小心吸弃冻存液，加新鲜RPMI1640培养基重悬细胞沉淀，转入T25细胞培养瓶内，补RPMI1640培养基至总体积约6ml。置37℃，5%CO2培养箱培养。 

3)次日在倒置显微镜下观察，可见细胞贴壁良好，只有少许死亡细胞悬浮在培养液中，吸弃陈旧培养基，进行首次换液，置培养箱继续培养。 

4)48小时后再次观察，可见复苏细胞融合已达80%-90%，准备传代。吸弃旧培养基，用经高压灭菌过的PBS轻柔洗2遍，加37℃预热了的0.25%胰酶，覆盖培养瓶底，拧紧盖子在显微镜下观察，细胞界限变清楚，细胞开始变圆时，吸弃培养瓶内胰酶，拧好培养瓶的盖子，放置1分钟后，用吸管轻轻吹打细胞悬液使消化下来的细胞充分分散。并按1:3传代，补足培养液，吹均匀后置37℃培养箱培养。 

5)2-3天换培养液一次。 

6)选择处于对数生长细胞进行体外效应实验。 

2. MTT(噻唑蓝)实验操作步骤: 

1)消化上述对数生长期细胞，细胞计数板计数细胞悬液的浓度，调整细胞浓度，接种到96孔板，8000个/孔。

2)置37℃，5%C02温箱培养培养过夜。 

3)加入以下浓度的无菌融合毒素DT390-triTMTPI:l、2、3、4、5、6μg/ml，每个浓度设3个复孔，同时各设3孔未加融合蛋白的空白对照组及调零孔(无细胞，只有等体积的培养基)。置37℃，5%CO2温箱培养过夜。 

4)24小时后，用加样枪小心吸弃孔内上清，加入90μlRPMI1640培养液，接着加入10μg MTT溶液(5mg/ml)。37℃，5%CO2温箱培养4h。 

5)将96孔板置离心机内，常温 800rpm离心5分钟。 

6)加样枪小心吸弃孔内液体。加入150μl二甲基亚飒(DMSO)，置摇床上避光轻柔摇荡巧分钟，充分溶解结晶物。 

7)上酶标仪检测490nm波长处各孔的吸光值。 

8)结果的处理，所有吸光值均以平均值士SD表示。以各株细胞的空白对照孔吸光值为对照，计算不同融合毒素浓度作用下的平均细胞存活率(即处理组平均值:空白对照组平均值)。 

实验结果显示：如图4所示，DT390-triTMTP1融合毒素在不同作用浓度下(l-6μg/ml)，剂量依赖性的显著抑制肿瘤细胞的增殖，增加肿瘤细胞凋亡；6μg/ml DT390-triTMTP1引起几乎100%的PE-3M-1E8细胞凋亡，约95%MKN-45细胞凋亡，但是正常HEK293细胞没有明显凋亡(约12%凋亡)。即DT390-triTMTP1对前列腺癌PE-3M-1E8细胞剂量依赖性地发挥了剧烈的毒性作用，对胃癌MKN-45细胞也发挥了显著的杀伤效应，而对正常人胚肾上皮细胞HEK293没有明显的细胞毒性。 

3.流式细胞仪检测细胞凋亡 

实验步骤:

l)消化处于对数生长期的细胞，接种到6孔板内，调整细胞密度，使孔板内细胞融合度约60%。

2)置37℃，5%C02温箱培养培养过夜，使细胞贴壁。 

3)加入工作浓度为3μg/ml的DT390-triTMTPI融合毒素，同时设不加毒素的空白对照孔。 

4)为检测TMTP1小分子多肽对细胞的毒性，另外分别加入3μg/mlTMTP1，同样设不加处理因素的对照孔。 

5)作用24小时后，用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞。 

6)将消化收集的细胞37℃，800rpm离心5分钟。弃上清，用磷酸盐PBS重悬细胞调整浓度，收集l×10⁵个细胞，再次800rpm离心5分钟，用PBS重复洗细胞一次。 

7)吸弃PBS，加凯基凋亡试剂盒中的Binding Buffer500μL重悬细胞。 

8)加Annexinv-FITC 5μL，轻柔混匀后，加Propidium lodide 5μL，混匀。 

9)常温，避光反应10分钟。 

10)1小时内上流式细胞仪检测。 

11)调节流式细胞仪参数，将激发波长调到488nm;发射波长调到530nm。标记早期凋亡细胞的AnnexinV-FITC用FLIC通道检测，标记坏死细胞的PI用FL3通道检测。并用未加处理因素的空白对照细胞调节荧光补偿，设定十字门，去除光谱重叠。 

实验结果显示：如图5所示,与未处理的对照组相比，3μg/ml的TMTP1肽没有明显增加两种肿瘤细胞的凋亡率，而3μg/ml的DT390-triTMTP1融合毒素显著增加了MKN-45与PC-3M- 1E8细胞的凋亡率。 

（七）重组融合蛋白的DT390-triTMTPI融合毒素体内分布及肿瘤靶向治疗的体内研究 

1.原代裸鼠皮下瘤模型的建立

1）取处于对数生长期的PC-3M-1E8前列腺癌细胞和MKN-45胃癌细胞，用0.25%胰酶消化，800rpm离心5分钟收集细胞，无菌PBS重悬细胞，通过计数板计数后调整细胞浓度。

2）将雄性裸鼠固定后，拿棉签蘸碘伏消毒裸鼠左侧大腿根部皮肤，用1ml注射器取200μlPC-3M-1E8前列腺癌细胞悬液(浓度为1.5×l0¹⁰/L)，注射到消毒过的皮下。即每只裸鼠接种3×l0⁶个细胞。共注射雄性裸鼠3只。 

3）将雌性裸鼠固定后，拿棉签蘸碘伏消毒裸鼠左侧大腿根部皮肤，用 1ml注射器取200μl MKN-45胃癌细胞悬液(浓度为l×l0¹⁰/L)，注射到消毒过的皮下。即每只裸鼠接种2×l0⁶/L个细胞。共注射雌性裸鼠3只。 

4）放入SPF环境中继续饲养，每天观察注射部位的肿瘤形成情况，待10天左右皮下肿瘤已经明显形成后，隔天观察肿瘤生长情况并用游标卡尺测量肿瘤最大径及最小径的值。 

2.前列腺癌和胃癌皮下瘤模型的建立 

1）原代前列腺癌/胃癌皮下瘤生长至约1cm×1cm时，取皮下瘤生长状态好的前列腺癌和胃癌裸鼠各2只，颈椎脱臼术处死荷瘤裸鼠，在超净工作台内用锋利的无菌剪刀及镊子剥离瘤体，置无菌生理盐水中，去除结缔组织，用剪刀将瘤体剪成约2mm³大小的瘤块。

2）在超净工作台内抓牢固定待移植裸鼠，碘伏消毒左侧大腿根部，手术刀小心划开一长约3mm消毒过的皮肤，镊子小心钝性分离皮下组织，选一剪碎的瘤块置入其中，4.0号手术缝线缝合皮肤。前列腺癌移植20只裸鼠，胃癌移植16只裸鼠。 

3）放回SFP级动物房继续饲养，每天观察移植部位的肿瘤形成情况，待7天左右皮下肿瘤已经明显形成后，隔天观察肿瘤生长情况并用游标卡尺测量肿瘤最大径及最小径的值。 

3.前列腺癌和胃癌皮下瘤裸鼠分组处理 

1）当前列腺癌/胃癌皮下移植瘤生长至约3mm×3mm时，将15只前列腺癌荷瘤裸鼠随机分为3组，每组5只，每组为一笼，做好标记。将12只胃癌荷瘤裸鼠随机分为3组，每组4只，每组为一笼，做好标记。

2）前列腺癌/胃癌皮下移植瘤荷瘤裸鼠分别接受以下处理(均为腹腔注射):第一组:50μlPBS(空白对照组)，第二组；50μlPBS TMTPl(含10μg肽)，第三组；50μl DT390-triTMTPl(含10μg DT390-triTMTPl融合蛋白)。 

3.每3天按上述方式处理一次，并且每次处理前先用游标卡尺测量肿瘤最大径及最小径的值。 

4.处理21天(治疗8次)后，将各组前列腺癌皮下移植瘤裸鼠用乙醚麻醉后，相机拍照。并按公式V＝4/π×（d/2）²×（D/2）计算每次测量的肿瘤体积，d代表肿瘤最小径的值，D代表肿瘤最大径的值，绘制肿瘤体积增长曲线。拍照后停止处理，继续饲养，每天观察，直至第一次处理后第46天，观察各组荷瘤裸鼠死亡情况，记录死亡每天观察，绘制各组裸鼠生存曲线。 

5.处理21天(治疗8次)后，将各组胃癌皮下移植瘤裸鼠用乙醚麻醉后处死，剥离肿瘤，将各组肿瘤先用相机拍照，再用PBS洗净血迹后置3.7%多聚甲醛浸泡，固定液与瘤体的体积比为10:1，送武汉谷歌生物技术有限公司进行石蜡包埋，4μm切片。并按公式V＝4/π×（d/2）²×（D/2）计算每次测量的肿瘤体积，d代表肿瘤最小径的值，D代表肿瘤最大径的值[51，绘制肿瘤体积增长曲线。 

6.胃癌原位模型的建立 

1）原代胃癌皮下瘤生长至约1cm×1cm时，取皮下瘤生长状态好的裸鼠2只，颈椎脱臼术处死荷瘤裸鼠，在超净工作台内用锋利的无菌剪刀及镊子剥离瘤体，置无菌生理盐水中，去除结缔组织，用剪刀将瘤体剪成约1mm³大小的瘤块。

2）将12只预备造模的雌性裸鼠禁食12小时后，腹腔注射速眠新麻醉，碘伏和75%酒精消毒裸鼠左侧及中部腹部皮肤，镊子夹起消毒过的皮肤，剪刀剪开腹壁，在正中旁的左侧打开腹腔，将胃用镊子小心拉出，用缝针小心反复轻刺胃大弯侧前壁的浆膜层3-5次，选取一剪碎的新鲜胃癌皮下瘤瘤块置于此处，然后用5-0可吸收缝线将瘤块缝在刺伤的胃大弯浆膜层上。按正常解剖位置将胃放回腹腔，用1-0缝线缝合腹壁及皮肤。擦净血渍，放回紫外线消毒的笼子继续在SPF级动物房饲养。 

7.胃癌原位肿瘤的处理 

1）胃癌原位移植瘤术后第7天，15只术后裸鼠随机分为3组，每组5只，通过剪耳朵做好标记。

2）移植瘤裸鼠分别接受以下处理(均为腹腔注射): 第一组:50μlPBS(空白对照组)，第二组；50μlPBS TMTPl(含10μg肽)，第三组；50μl DT390-triTMTPl(含10μg DT390-triTMTPl融合蛋白)。 

3）每3天按上述方式处理一次。 

4）处理10次后乙醚麻醉处理裸鼠，解剖裸鼠，取出原位瘤，肝脏，脾脏及腹壁转移瘤，照相机拍照后，取原位瘤及各组织中肉眼可见的转移瘤，PBS洗净血迹后置3.7%多聚甲醛浸泡，固定液与瘤体的体积比为10:1，进行石蜡包埋，4μm切片，石蜡切片HE染色。 

5）记录各组裸鼠原位瘤及转移瘤的发生率，统计数据。 

实验结果显示：如图6所示，结果显示DT390-triTMTP1融合毒素显著抑制了PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤的生长并且显著延长了荷瘤裸鼠的生存期。DT39O-triTMTP1融合毒素处理后，荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显比TMTP1处理及对照组荷瘤裸鼠的肿瘤体积小(P<0.05)。同时，与TMTP1相比，DT390-triTMTPI融合毒素显著延长了裸鼠的生存期。与PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤的治疗效果相似，DT390-triTMTP1融合毒素显著抑制了MKN-45胃癌皮下瘤的生长，而TMTPI对MKN-45胃癌皮下瘤的生长无明显影响。 

如图7所示：各组裸鼠的胃组织可见巨大的原位肿瘤，除DT390-triTMTPI融合蛋白处理组外，肝脏或脾脏上也可见明显的白色转移灶，腹壁也有较大的转移瘤。统计各组裸鼠各脏器原位或转移瘤的发生率，如图7所示，PBS、TMTP1组裸鼠胃原位均100%发生肿瘤，PBS对照组裸鼠100%发生肝转移，TMTP1组66.7%发生肝转移，PBS、TMTP1组33.3%发生脾转移， PBS组100%发生腹壁转移， TMTP1组33.3%发生腹壁转移，而DT390-triTMTP1融合蛋白处理组裸鼠无肉眼可见肝脾转移灶、腹壁转移灶，且胃癌原位发生肿瘤率为33.3%。 

以上数据显示，融合蛋白DT390-triTMTP1具有显著抑制肿瘤的发生发展及抑制肿瘤转移的效应，有望成为一种新型抗肿瘤转移药物。 

8. DT390-triTMTPl在荷瘤裸鼠体内的分布与代谢 

1）按1.2.2介绍方法建立前列腺癌PC-3M-1E8皮下瘤。

2）取9只雄性荷瘤裸鼠，皮下瘤体积约0.5-1.0cm³，一只腹腔注射50μl PBS，另外8只都腹腔注射50μl DT390-triTMTPl(含10μg DT390-triTMTPl融合蛋白)。半小时后乙醚麻醉处死注射50μl PBS荷瘤裸鼠及一只注射了50μl DT390-triTMTPl的荷瘤裸鼠，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时，48小时分别麻醉处死注射了50μl DT390-triTMTPl的荷瘤裸鼠一只。 

3）新鲜解剖每次麻醉处死的荷瘤裸鼠，取皮下瘤，心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏，脑组织，PBS洗净血迹后置3.7%多聚甲醛浸泡过夜，固定液与组织的体积比为10:1，进行石蜡包埋，4μm切片，石蜡切片HE染色。 

实验结果显示：如图8所示，与PBS对照组相比，注射了DT390-triTMTP1融合蛋白的皮下瘤组织中His蛋白阳性表达明显增强。采用H-score评分，注射后1小时，DT390-triTMTP1融合蛋白开始在肿瘤组织内显著浓聚，持续至48小时后仍比对照组显著增高。提示DT390-triTMTP1融合蛋白在荷瘤裸鼠体内能短时间内有效靶向到肿瘤组织内。肝脏和肾脏组织在注射DT390-triTMTP1融合蛋白半小时后即出现一过性聚集，之后表达强度逐渐下降，48小时后组织中无阳性表达。 

以上结果显示DT39O-triTMTP1融合蛋白能高浓度靶向到肿瘤局部，同时毒副作用小，达到安全有效的发挥抗肿瘤作用的目的。 

  

白喉毒素分子（DT）效应基团DT390与肿瘤转移靶向肽TMTP1的三个重复序列融合基因的全序列： 

ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAACTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTcACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGaGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGGGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCgatAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGCATTGCAGATGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTGGAGGAAACGTGGTGCGTCAAGGAGGAGGAGGATCAAACGTGGTGCGTCAAGGTGGTGGTGGTTCTAACGTGGTGCGTCAATAA

氨基酸序列

MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIGSLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLGGNVVRQGGGGSNVVRQGGGGSNVVRQ*。