用于检测青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用

摘要

本发明公开用于检测青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用，特点是工作电极为固载了MWCNTs-Fe3O4/Au-HRP-Ab的磁性玻碳电极，其制备方法包括多壁碳纳米管羧基化步骤；Fe3O4/Au复合纳米粒子制备步骤；Fe3O4/Au磁性纳米粒子-HRP-青霉素抗体制备步骤；将羧基化的碳纳米管、Fe3O4/Au-HRP-Ab依次修饰到碳纳米管玻碳电极表面，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成电化学生物传感器的步骤，将电化学传感器浸入待测样品中，根据相应电流值与青霉素浓度的定量关系，确定待测样品中青霉素的浓度，优点是是灵敏度高、选择性强、准确性高且检测速度快。

说明书

技术领域

本发明涉及青霉素检测技术，尤其是涉及一种基于MWCNTs-Fe₃O₄/Au的用于检测青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用。 

背景技术

青霉素是一种β-内酰胺类抗生素，广泛用于治疗牛乳腺炎和预防细菌感染，然而由于人类的不合理使用，经常会导致生物组织中青霉素的大量残留，特别是在食品中会对人类造成潜在的危害。首先，青霉素含量超标会对人畜肠道的微生物产生抗药性，引起菌群失调，从而引发过敏反应等一系列疾病。其次，采用青霉素预防和治疗奶牛中疾病后，其体内会产生抗生素累积。长期食用含有过量青霉素的牛奶，将会给人的脏器带来不可逆转的损害，因此，对于食品中青霉素的检测非常重要。 

目前，有关青霉素的检测手段主要集中在微生物法、高效液相色谱法、质谱法、免疫荧光法、电导法，这些方法在灵敏度和专一性上都可以很好的对青霉素进行定性和定量，但是也存在衍生化、萃取和纯化等操作，使得其耗时耗力、步骤繁琐从而不适合实际应用。因此，电化学生物传感器应运而生，它既结合了传统的抗原抗体的特异性，又结合了电化学的低成本、高度灵敏性及其快速响应性，从而在食品、医学等方面有其巨大的应用价值。其中，差分脉冲伏安法拥有较高的灵敏度，因此常用作高灵敏度的检测。 

碳纳米管，特别是多壁碳纳米管（MWCNTs）因其具有良好的电化学性能和大的比表面积及较强吸附特性，在电化学生物传感器的研制中得到广泛应用。碳纳米管应用于电化学传感器制备不仅能降低底物的过电位、促进电子传递、增大响应电流，对其酸化处理后还能对某些物质产生特有的吸附和催化效应。Fe₃O₄ 纳米粒子除了具有一般纳米粒子的性质之外，还具有独特的超顺磁性，可以起到磁性分离及富集目标生物分子的作用。金纳米粒子具有稳定性强及合成操作简单等点。Fe₃O₄/Au纳米粒子可以提高辣根过氧化物酶（HRP）的负载量，进而增大催化电流，提高免疫检测的灵敏度；同时抗体与Fe₃O₄/Au复合纳米粒子反应后，通过磁场即可将与其游离的抗体分离，避免了离心分离操作步骤。但是，目前国内外还没有公开任何关于利用碳纳米管和Fe₃O₄/Au纳米复合材料作为电化学传感界面材料制备用于检测青霉素的电化学生物传感器的相关研究报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、准确性和灵敏度高且易于操作的用于检测青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测青霉素的电化学生物传感器，包括对电极、参比电极和工作电极，所述的对电极为铂丝电极，所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述的工作电极为固载了MWCNTs-Fe₃O₄/Au-HRP-Ab的磁性玻碳电极。 

一种用于检测青霉素的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下： 

（1）碳纳米管羧基化

将多壁碳纳米管与由硫酸与硝酸组成的混合液按质量体积比15mg：20ml的比例混合后超声7-9h，然后通过孔径为0.22 μm的聚偏氟乙烯微孔过滤膜真空过滤，取滤液用超纯水多次洗涤直到滤液为中性，即得到羧基化的碳纳米管水溶液；

（2）Fe₃O₄/Au复合纳米粒子制备

将Fe₃O₄磁性纳米粒子用超纯水多次洗涤后，采用四甲基羟胺作为分散剂定容，得到浓度为1 mg/mL的Fe₃O₄纳米悬浮液；然后 ,将Fe₃O₄纳米悬浮液与0.01wt%的柠檬酸钠水溶液按体积比1：20的比例混合后，在搅拌条件下加热至沸，然后迅速加入3/5Fe₃O₄纳米悬浮液体积的浓度为1.0mg/mL的氯金酸溶液 , 持续反应20-30min，直至溶液颜色变成酒红色，得到 Fe₃O₄/Au复合纳米粒子，经磁性分离后弃去上清液，再次用超纯水洗涤，配制成1mg/mL的Fe₃O₄/Au复合纳米粒子溶液，于4℃冷藏保存；

（3）Fe₃O₄ /Au-HRP-Ab制备

将Fe₃O₄ /Au纳米悬浮液用Na₂CO₃调pH至8.0，加入体积分别为Fe₃O₄/Au纳米悬浮液1/5的1.0mg/mL辣根过氧化物酶和10μg/mL青霉素抗体（Pen-Ab），于4℃下搅拌过夜，磁性分离后，将混合物分散在与Fe₃O₄/Au纳米悬浮液等体积的pH7.4含1wt%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭非特异性活性位点，再用PBS磷酸盐缓冲液清洗干净后，超声均匀分散于与Fe₃O₄/Au纳米悬浮液等体积的磷酸盐缓冲液中，得到Fe₃O₄ /Au-HRP-Ab溶液；

（4）电极预处理

将裸电极依次用去离子水、无水乙醇和去离子水分别超声5min，再依次用粒径为 1μm、0.3μm、0.05μm 的氧化铝粉末反复打磨至镜面，然后分别置于乙醇、去离子水中超声清洗5min，最后用氮气吹干备用；

（5）工作电极修饰及传感器制备

将步骤(1)中制备的羧基化的碳纳米管溶液5μL滴加于玻碳电极表面，室温下干燥，得到了碳纳米管修饰的玻碳电极（MWCNTs/GCE）；将步骤(3)中制备的Fe₃O₄/Au-HRP-Ab 溶液5μL滴加于碳纳米管修饰的玻碳电极表面，室温下干燥，得到Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs修饰的玻碳电极；将固定了Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs玻碳电极作为工作电极，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的用于检测青霉素的电化学生物传感器。

步骤（1）中硫酸与硝酸的体积比为3：1。 

一种应用上述电化学生物传感器检测青霉素浓度的方法，将Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs修饰到裸玻碳电极表面作为工作电极，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的电化学生物传感器，将电化学生物传感器浸入待测样品中，根据相应电流值与青霉素浓度的定量关系，确定待测样品中青霉素的浓度。 

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种用于检测青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用，基于MWCNTs-Fe₃O₄/Au-HRP-Ab免疫传感器的检测青霉素，首先将碳纳米管修饰到裸玻碳电极表面，其次通过磁铁的强吸附作用将Fe₃O₄/Au-HRP-Ab复合物固定到电极表面，组成电活性免疫磁性纳米探针。当检测体系中存在目标分析物青霉素时，目标物与固定在电极表面的抗体发生特异性免疫反应，随着目标物浓度的增加，越多的免疫复合物就会阻碍化学工作站中对苯二酚的氧化，阻碍电极表面电子的传递效应，降低氧化还原电流，从而实现对青霉素标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含有青霉素样品进行定量检测的目的。 

本发明通过在玻碳电极表面修饰多壁纳米管（MWCNTs）、Fe₃O₄/Au 、HRP(辣根过氧化物酶)和青霉素抗体(Pen-Ab)，构建了适用于青霉素快速检测的高灵敏生物传感器。该Fe₃O₄/Au/MWCNTs复合物材料修饰的界面能提供更大的活性面积和更小的界面电阻，并且Fe₃O₄/Au中纳米金颗粒具有很强的催化性，纳米管和金纳米粒子的双重催化作用加强了催化效率，比单独在玻碳电极直接修饰羟基化碳纳米管组装的传感器（检测限1.05 ng/mL）或者在玻碳电极直接修饰Fe₃O₄/Au-HRP-Ab的免疫传感器（检测限1.00 ng/mL）检测限提高了10倍左右，从而大大加强了所制备修饰电极的灵敏度（检测限0.1050 ng/mL）、稳定性和重现性；通过电流时间实验，测得此传感器对青霉素的响应时间小于20s，比传统的高效液相色谱法测定的响应时间30min，酶连免疫法（ELISA）的测定时间2h都要少得多，大大缩短了电流响应时间，极大提高了检测速度，再次显示出此传感器在测定微量青霉素时的巨大应用。 

综上所述，本发明用于检测青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用，对于固定于Fe₃O₄/Au上的青霉素抗体能成功实现其直接电化学响应，达到了对青霉素快速、灵敏检测的目的，从而为监管食品安全与保证人民利益提供痕量残留检测技术的支持。 

附图说明

图1为基于Fe₃O₄ /Au-HRP-Ab-CNTs/GCE电化学传感器检测青霉素的原理图； 

图2为制备的Fe₃O₄的透射电镜图；

图3为制备的Fe₃O₄ /Au复合物的透射电镜图；

图4为制备的Fe₃O₄ /Au复合物的粒径分布图；

图5为制备Fe₃O₄ /Au-HRP-Ab复合物的表征图；a：制备的Fe₃O₄的紫外可见吸收光谱 ； b: 制备的Fe₃O₄ /Au复合物的紫外可见吸收光谱；c: 制备的Fe₃O₄/Au-HRP-Ab复合物的紫外可见吸收光谱；

图6为不同修饰电极的交流阻抗图谱；

图7为目标物青霉素电流信号与青霉素浓度建立的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 

具体实施例一 

一种用于检测青霉素的电化学生物传感器，该电化学传感器为三电极体系，包括对电极、参比电极和工作电极，其中对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，工作电极为固载了多壁碳纳米管（MWCNTs）-Fe₃O₄/Au磁性纳米粒子-HRP-青霉素抗体（Pen-Ab）的玻碳电极。

具体实施例二 

一种用于检测青霉素的电化学生物传感器的制备方法，电化学传感器检测青霉素的原理如图1所示，具体步骤如下：

（1）碳纳米管羧基化

将多壁碳纳米管（MWCNTs）与由硫酸与硝酸（3:1，v/v）组成的混合液按质量体积比15mg：20ml的比例混合后超声7-9h，然后通过聚偏氟乙烯微孔过滤膜（孔径为0.22 μm）真空过滤，取滤液用超纯水多次洗涤直到滤液为中性，即得到羧基化的碳纳米管水溶液；

（2）Fe₃O₄/Au复合纳米粒子制备

将Fe₃O₄磁性纳米粒子（可以通过共沉淀法和热分解法制备或者直接在西安金磁纳米生物技术有限公司购买，本发明采用的Fe₃O₄的透射电镜图如图2所示，可见Fe₃O₄颗粒分散均匀，粒径大致为20nm）用超纯水多次洗涤后，采用四甲基羟胺作为分散剂定容，得到浓度为1 mg/mL的Fe₃O₄纳米悬浮液；然后 ,将Fe₃O₄纳米悬浮液与0.01wt%的柠檬酸钠水溶液按体积比1：20的比例混合后，在搅拌条件下加热至沸，然后迅速加入3/5Fe₃O₄纳米悬浮液体积的浓度为1.0mg/mL的氯金酸溶液 , 持续反应20-30min，直至溶液颜色变成酒红色，得到 Fe₃O₄/Au复合纳米粒子（由图3的Fe₃O₄ /Au复合物的透射电镜图说明Fe₃O₄ /Au的粒径大致为35nm左右，这个比单纯的Fe₃O₄ 粒径大15nm左右，也说明了Au纳米粒子成功包被在Fe₃O₄ 的表面。图4粒径分布图说明制备的Fe₃O₄ /Au颗粒分散均匀，没有发生团聚现象），经磁性分离后弃去上清液，再次用超纯水洗涤，配制成1mg/mL的Fe₃O₄/Au复合纳米粒子溶液，于4℃冷藏保存；（图5为制备Fe₃O₄ /Au-HRP-Ab复合物的表征图；a：制备的Fe₃O₄的紫外可见吸收光谱 ； b: 制备的Fe₃O₄ /Au复合物的紫外可见吸收光谱；c: 制备的Fe₃O₄/Au-HRP-Ab复合物的紫外可见吸收光谱，可见单纯的Fe₃O₄ （a）没有特征吸收峰，而Fe₃O₄ /Au复合物(b)在540nm出现了明显的特征吸收峰，这是Au的特征吸收峰，而Fe₃O₄/Au-HRP-Ab复合物（c）在280nm也出现了辣根过氧化物酶的特征吸收峰,说明复合物成功合成）

（4）电极预处理

将裸电极依次用去离子水、无水乙醇和去离子水分别超声5min，再依次用粒径为 1μm、0.3μm、0.05μm 的氧化铝粉末反复打磨至镜面，然后分别置于乙醇、去离子水中超声清洗5min，最后用氮气吹干备用；

（5）工作电极修饰及传感器制备

将步骤(1)中制备的羧基化的碳纳米管溶液5μL滴加于玻碳电极表面，室温下干燥，得到了碳纳米管修饰的玻碳电极（MWCNTs/GCE）；将步骤(3)中制备的Fe₃O₄/Au-HRP-Ab 溶液5μL滴加于碳纳米管修饰的玻碳电极表面，室温下干燥，得到Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs修饰的玻碳电极；将固定了Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs玻碳电极作为工作电极，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的用于检测青霉素的电化学生物传感器。

将步骤(4)中处理的玻碳电极在CHI660B电化学工作站上测定含2 mM 对苯二酚和5 mM H₂O₂的溶液中的交流阻抗信号。实验结果如图6，裸GCE低频下基本为一直线，表明裸GCE具有较低的交流阻抗值，便于电化学传感界面电子传递；MWCNTs/GCE比裸电极（裸GCE)相比电流阻抗明显较小，更有利于电子转移，电流响应值可能会更大。而Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs/GCE+2 ppm青霉素抗原相比Fe₃O₄ /Au-HRP-Ab-MWCNTs/GCE阻抗较大，这可能是因为抗原抗体发生了特异性免疫识别反应在电极表面形成了免疫复合物从而阻止了电子的传递。 

 具体实施例三 

一种基于多壁碳纳米管（MWCNTs）-Fe₃O₄/Au磁性纳米粒子-HRP-青霉素抗体（Pen-Ab）的玻碳电极的电化学生物传感器检测青霉素浓度的方法

将上述具体实施例二中制备的羧基化的碳纳米管、Fe₃O₄/Au-HRP-Ab依次修饰到裸玻碳电极表面作为工作电极，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的电化学生物传感器。当检测体系中存在目标分析物青霉素时，目标物与固定在电极表面的抗体发生特异性免疫反应，随着目标物浓度的增加，越多的免疫复合物就会阻碍对苯二酚的氧化，阻碍电极表面电子的传递效应，降低氧化还原电流，从而实现对青霉素标准品进行检测，建立标准曲线，将电化学生物传感器浸入待测样品中，根据相应电流值与青霉素浓度的定量关系，确定待测样品中青霉素的浓度，从而达到对含有青霉素样品进行定量检测的目的（如图1所示）。

 具体实施例四 

本发明Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs的电化学生物传感器对青霉素的灵敏度及线性范围

将利用具体实施例二方法制备的Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs传感器置于青霉素标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为: 0 ng/mL、0.005 ng/mL、0.02 ng/mL、0.08 ng/mL、0.2 ng/mL、0 .6 ng/mL、、2 ng/mL、5 ng/mL、、10 ng/mL、50 ng/mL（标准品溶剂为PBS缓冲溶液），工作电压0～1V，工作缓冲体系为NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH＝7.4)，测得差分脉冲法(DPV)所得响应电流，建立标准曲线：y=4.5716LogC+18.244，R²=0.9985 (如图7所示),得到此电化学生物传感器对青霉素的线性范围为0.005-50 ng/mL，检测限为0.1050 ng/mL；该电极重现性好，性能稳定，制作简单且容易更新。

由实验测定可知，在玻碳电极上直接修饰羟基化碳纳米管组装的传感器，对青霉素的检测限为1.05 ng/mL，在玻碳电极直接修饰Fe₃O₄/Au-HRP-Ab的免疫传感器，对青霉素的检测限是1.00 ng/mL。但是本方法将多壁碳纳米管和Fe₃O₄/Au纳米材料共修饰于玻碳电极表面组成的电化学磁性免疫传感器的检测限是0.1050 ng/mL，比修饰单一的材料检测限提高了10倍左右，充分说明了此传感器具有比单独材料修饰更强的优势，具有更大的应用价值。 

 具体实施例五 

高选择性验证实验

在PBS溶液中分别加入相同浓度的其他抗生素，分别为氨苄青霉素、链霉素、罗红霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素，和青霉素对比，其影响分别为青霉素电流响应的9%、5.0%、6.0%、3.5%、4.5%和2.5%，结果显示上述添加的其他物质对青霉素的检测影响比较小，由此说明传感器具有极高的选择性。

 具体实施例六 

取市售的牛奶样品若干，在牛奶样品中加入已知量的青霉素，然后加入适量硫酸铵(6g/20 mL牛奶），于4℃以8000 r/min离心30 min。滤取其上清液配制不同浓度的PBS缓冲溶液。电压0～1V，工作缓冲体系为NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH＝7.4)，将上述具体实施例二中制备的Fe₃O₄ /Au-HRP-Ab-CNTs/GCE修饰的电化学生物传感器置于含有适量提取液的PBS缓冲溶液中,差分脉冲法(DPV)测得样品的电化学性质，结果如表1所示。

                    表1 牛奶中青霉素的检测结果 

牛奶试样加标浓度/ng/mL测定浓度/ng/mL回收率/%133.40113.3254.7998.6

由表1检测结果可知，Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs修饰的电化学生物传感器检测青霉素的方法的平均回收率为98.6～113.3%，表明本发明制备的，Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs电化学生物传感器对于青霉素的检测精密度高，结果准确可靠。

 具体实施例七 

准确称量若干等量的鸡肉和猪肉样品, 装入离心管, 分别加入适量的青霉素，超声 3min后, 按体积比 1：5向试管里加入 0.2 mol/L pH =7.4的磷酸缓冲溶液, 超声振荡 15min, 然后在 4℃下离心 5min，取上清液, 鸡肉按体积比 1：2的比例加入饱和硫酸铵，猪肉按体积比为１：0.5的比例加入三氯乙酸, 混匀后装入离心管离心 25min，此时溶液呈现 3层, 取中间层清液, 按体积比 1：1加入饱和硫酸铵（猪肉加体积比为１:１三氯乙酸）,以相同的方式二次离心。鸡肉和猪肉分别取上清液按体积比 1：1加入正已烷萃取1次, 静置5min, 得到最终处理样品。电压0～1V，工作缓冲体系为NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH＝7.4)，将上述具体实施例二中制备的Fe₃O₄ /Au-HRP-Ab-CNTs/GCE修饰的电化学生物传感器置于含有适量提取液的PBS缓冲溶液中,差分脉冲法(DPV)测得样品的电化学性质，结果如表2所示。

表2 鸡肉和猪肉中青霉素的检测结果 

由表2检测结果可知，Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs修饰的电化学生物传感器检测青霉素的方法的平均回收率为92.8～109%，表明本发明制备的Fe₃O₄/Au-HRP-Ab-MWCNTs修饰的电化学生物传感器对于青霉素的检测精密度高，结果准确可靠。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。