一种基于TTC染色法的高活力酵母细胞定量筛选方法

摘要

本发明公开了一种基于TTC染色法的高活力酵母细胞定量筛选方法，将待检测酵母细胞菌液涂布于平板，培养待其长出单菌落；然后接种于96孔细胞培养板各孔培养液中，培养至测定得到菌体OD值在1-3之间，离心弃上清；在96孔细胞培养板各孔中加入TTF萃取剂，震荡10-15S后离心；将震荡离心后的上清液吸取到96孔酶标板中，利用酶标仪在486nm波长下测定TTF吸收值，根据TTF标准曲线及测定的细胞OD值，计算每个孔中TTF含量，以此确定细胞活力大小。本方法筛选结果定量可靠地直接反应细胞活力，不仅能明显降低筛选时间，而且能降低操作过程中的视觉判断产生的人为错误。

说明书

技术领域

本发明适用于生物工程技术及医学、药学领域，具体涉及一种基于TTC染色法的高活力酵母定量筛选方法。

背景技术

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）是一种显色剂,能够对多种细胞（酵母，细菌，植物细胞等）发生呈色反应，TTC本身为无色，当其与正常细胞中的脱氢酶反应而呈红色,其原理是TTC在细胞呼吸中替代O₂接受H⁺，TTC被还原为红色的TTF（三苯基甲月替）而呈现红色。反应方程式如下：

 

由于以上显色反应，TTC作为呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，    能被活细胞中的呼吸链脱氢酶由无色的氧化态TTC还原为红色的TTF，所以，TTC染色法通常被用来测定细胞的活力，

TTC在1894年首次用来检测种子的生存能力，1958年曾被用来染色检测哺乳动物脑组织在缺血梗塞下的细胞形态、梗死面积等，来反映脑组织的缺血梗塞严重程度。目前TTC染色目测法被广泛应用于种子细胞、细菌呼吸活性等的检测，也被应用于高产乙醇酵母的筛选。刘华，梅兴国等人利用TTC法测定红豆杉细胞活力；杨天佑等人利用TTC-脱氢酶测定法研究低温真空环境对细菌呼吸活性的影响；董博宇等人通过TTC染色法筛选紫外诱变后高产乙醇的休哈塔假丝酵母。在呈色反应中产生的TTF在细胞内，且不溶于水，TTF需经有机溶剂萃取，在一定波长下测定其吸光值，其吸收值大小反映了细胞膜电子传递链的递氢能力大小。细胞内TTC反应所呈现的红色的深浅反映了其生命活力的强弱，颜色越深表明其活力越强。在酵母细胞中，乙醇发酵的主要途径包括葡萄糖酵解和丙酮酸的无氧降解，在此过程中糖-乙醇转化酶其主要作用，TTC能对酵母的代谢产物产生显色反应，通过其颜色的深浅可以判断其胞内转化酶活力的大小，颜色越深表明其细胞活性越强，产乙醇能力也越强。

在现有的这些研究中，还存在很多缺陷或者不足。第一是含有TTC培养基的平板制作复杂，接种酵母后生长比较缓慢，并且后续挑取颜色较深的酵母时，操作也比较繁琐，需时较长；第二是通过TTC染色法的呈色反应，利用人眼观测反应颜色的深浅来判断细胞活力从而预测酵母产乙醇的高低，由于待筛选细胞繁多，其缺陷在于：①无法定量，通过肉眼判断无法准确判断生成物含量，且很容易产生疲劳和差错，并且从不同的培养板上筛选所得高活力细胞会因为人眼视力的局限导致误判，使得最终筛选得到的细胞未必是所需高活力高产乙醇细胞；②筛选大量细胞时工作量大，耗时耗力，影响细胞筛选进度。

高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，利用96孔板和酶标仪作为实验工具载体，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，可在同一时间内定量检测大量样品。它具有定量、快速、灵敏和准确等特点。利用高通量筛选技术目前已广泛应用于药物筛选等领域，并已经取得了明显进步。在微生物菌种选育方面，文献报道中也有很多研究者利用96孔板开展选育工作，如张继林等人利用96孔板选育高产乙醇酵母，蔡万林等人利用96孔板和酿酒酵母生长圈符合筛选高产管囊酵母等。但是在这些研究中，亦存在许多不足之处，即这些文献报道只是将微生物培养中用比色杯中测定单位体积内菌体数目的检测转移到96孔板里面进行，后续研究中都需要将细胞培养板96孔中生长OD值较高的菌株涂布于平板培养基生长，再利用其他筛选方法进行高产乙醇菌株筛选，需时长，如蔡万林在利用96孔板和酿酒酵母生长圈符合筛选高产管囊酵母中后续酵母筛选需要生长7-9天。所以，这些方法虽利用了96孔板，但是没有明显减少工作时间及工作量，关键还在于，这些方法在利用96孔板时所测的结果仅仅是对细胞群体密度的定量，反映的是细胞在一定生长周期中的增殖情况，并非个体细胞的生命活力。因此，需要提高细胞筛选过程中的快速性、准确性和简便性。

发明内容

本发明在于提供基于TTC染色法及酶标仪和96孔板的高活力酵母高通量筛选方法，该方法通过酶标仪定量、快速检测，可以有效提高高活性细胞的筛选效率及筛选准确性，以此改进大规模筛选细胞工作量大，进度缓慢，准确性低的不足。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于TTC染色法的高活力酵母细胞定量筛选方法，包含以下步骤：

1）待检测酵母细胞培养：待检测酵母细胞菌液涂布于平板，培养待其长出单菌落；不同酵母细胞的培养时间不一，通常培养48-72h；

2）细胞单菌落转移至96孔细胞培养板。将步骤1）中培养的单菌落接种于96孔细胞培养板各孔培养液中，培养液中添加有TTC，培养至测定得到菌体OD值在1-3之间，离心弃上清；然后在96孔细胞培养板各孔中加入TTF萃取剂，震荡10-15S后离心；根据不同酵母细胞选择培养液，在通常情况下酵母细胞培养使用的培养液中添加TTC至一定浓度即可。

3）将步骤2）中震荡离心后的上清液吸取到96孔酶标板中，利用酶标仪在486nm下测定TTF吸收值，根据TTF标准曲线及步骤2）中测定的细胞OD值，计算每个孔中TTF含量，以此确定细胞活力大小。TTF含量越高，表明细胞呼吸活力越强。筛选TTF含量高的菌株即为高活力的酵母细胞。

步骤2）培养液中TTC浓度为0.3%-0.5%（W（g）/V(mL)），pH为6-8。

步骤2）中所述TTF萃取剂为二甲基亚砜水溶液，浓度范围（二甲基亚砜与水混合体积比）为：85%-100%（V/V）。

步骤2）中TTF提取剂与细胞培养液体积比为1:1。

此方法包括但不局限于96孔板细胞培养板，亦适用于其他多孔培养板培养，例如384孔细胞培养板；本方法不局限于酵母细胞的筛选，同样适用于其他微生物、植物细胞、动物细胞等的活力筛选。

有益效果：本发明的基于TTC染色法及酶标仪和96孔板的高活力细胞高通量筛选方法，与常规检测方法相比具有以下优点：

1）准确性：由于生成的TTF在温度20-40℃，pH6-8， 24h内均能稳定存在，并且可以通过酶标仪准确、快速检测，筛选结果定量可靠地直接反应细胞活力，不仅能明显降低筛选时间，而且能降低操作过程中的视觉判断产生的人为错误；

2）高效性：基于96孔板，可以高通量快速检测，在细胞培养板中进行细胞培养后只需测定其OD值及TTF生成量，整个测定过程只需1-2h，无需耗费大量时间，并且该方法不仅仅局限于96孔板，亦可发展成为384孔等其他细胞培养板；

3）本方法操作条件并不严苛，操作过程中TTC浓度，pH控制，二甲基亚砜浓度，后续96孔板中细胞OD值等都有一定的操作范围，无需特别精确的配制，各步骤操作简单，对仪器，试剂等要求较低，便于后续推广使用于不同条件的实验室；

4）经济性：微孔板测量，所用试剂等较常规检测更为节省。本方法中使用的二甲基亚砜价格低廉，萃取效果好，节省了检测成本，本方法可以作为检测细胞活力的一种快速、有效、可靠、经济的手段。

本检测方法在检测酵母细胞活性强弱的同时可以进一步检测其产乙醇能力的强弱。

附图说明

图1：TTF标准曲线。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

实施例1

高活力酵母的高通量筛选

1．TTF标准曲线的绘制

分别取0.005，0.01，0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1%（W（g）/V(mL)）的TTC溶液1ml加入10ml离心管中，加2ml的Tris-HCl（pH8.4），最后加入10%（W（g）/V(mL)）的Na₂S₂O₄溶液1ml，37℃水浴震荡5min（以上步骤均在暗处操作），使得TTC完全还原为TTF，10000r/min离心10min弃上清，加入5ml浓度为85%（v/v）二甲基亚砜溶液充分混匀，于486nm处测吸光值，并以混合液于486nm处吸光值为纵坐标，以TTC浓度作为横坐标绘制标准曲线，绘制得到的标准曲线见图1：从标准曲线上可以看出：当TTC浓度在0.01-0.06%时，OD值在0.15-0.88范围，两者呈较好的线性关系，可以用于定量测定。标准曲线是为了在检测细胞生成的TTF值落在一个可信的区间内，不在这个区间的我们认为这个值不可信。 

2．待检测酵母细胞培养：取100μL待检测酵母细胞菌液（由江苏汤沟酒业有限公司提供）涂布于YPD固体平板培养基上，30℃培养48h，待其长出单菌落；其中YPD固体培养基配方：1%酵母粉 ，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂粉；

3. 细胞单菌落转移至96孔细胞培养板：将上述培养的单菌落接种于96孔细胞培养板各孔培养液中，各孔中培养液体积为150μL，培养液为YPD培养液，（YPD液体培养基配方：1%酵母粉 ，2%蛋白胨，2%葡萄糖），培养液中TTC浓度为0.4%（W（g）/V(mL)），培养液pH6-8，乙醇浓度分别设置为0%，10%，14%，添加不同浓度的乙醇，是为了看在不同乙醇浓度下菌株的细胞活力，乙醇对细胞有毒害，浓度越高，活性就越小,根据浓度设置，既可以用TTC这个方法检测同一株菌在有无乙醇及乙醇浓度高或者低的情况下的细胞活力，还可以检测并比较不同菌株在同一乙醇浓度下的活力，方便选择耐乙醇的菌株，培养条件：30℃,200r/min培养4h，测定其细胞OD值，使细胞OD值在1-3之间，细胞OD值在1-3之间此时的TTF浓度在0.15-0.88之间，测定TTF的吸光值与其浓度呈较好的线性关系，定量较准确，4000r/min离心5min后弃上清；然后在96孔细胞培养板各孔中加入150μL浓度为85%（v/v）的二甲基亚砜溶液，震荡15s后4000r/min离心5min；

4.用排枪将上述细胞培养板中震荡离心后的上清液吸取100μL到96孔酶标板中，在486nm下测定TTF吸收值，根据TTF标准曲线及步骤3中测定的细胞OD值，计算细胞TTF含量=实验测得TTF吸收值*（1/细胞OD₆₀₀吸收值），以所得到的在标曲范围内的TTF值确定细胞呼吸力即细胞活力大小。TTF含量越高，表明细胞呼吸活力越强。同时测定各株菌株的乙醇产量（乙醇产量的测定采用气相内标法，气相色谱条件为，柱子型号：SGE 30QC2/AC20-0.25毛细管柱；柱箱温度：60℃；进样器温度：190℃；检测器温度：240℃。内标物：正丙醇。检测液配置方法：（0.5ml 6%正丙醇溶液+0.5ml被测样品）定容至10ml。进样量：2ul），观察TTF值与乙醇产量的关系，最后筛选出具有较强活力的6株菌株，按细胞活力强弱依次排列为#5，#1，#8，OY-11，#7，#6，实验结果见表1。

表1

从表1中可以看出：在乙醇浓度为0%，10%，14%时，菌株5#TTF吸收值均为最高，可见其活性在测试的所有菌株中最强，其他菌株按活性强弱依次为1#，8#，OY-11，7#，6#。同时在测定菌株乙醇产量，菌株5#的乙醇产量也为最高，其他菌株按乙醇产量高低依次为8#，1#，OY-11，7#，6#，可以看出，菌株的细胞活力与乙醇产量在一定程度上是成正相关的。

本方法操作条件并不严苛，操作过程中TTC浓度在0.3%-0.5%（W（g）/V(mL)），二甲基亚砜浓度为85%-100%（V/V）都可以，无需特别精确的配制，各步骤操作简单，对仪器，试剂等要求较低。

此方法包括但不局限于96孔板细胞培养板，亦适用于其他多孔培养板培养，例如384孔细胞培养板；本方法不局限于酵母细胞的筛选，同样适用于其他微生物、植物细胞、动物细胞等的活力筛选。