苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷在制备防治骨病药物中的应用

摘要

本发明公开了苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷及含苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷的大麻药总皂苷在制备防治骨病药物中的用途。药效学实验表明，苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷和含苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷的大麻药总皂苷均具有显著的改善骨病作用，可使维甲酸所致骨质疏松大鼠骨重系数、骨灰含量、骨密度、骨磷含量等明显增强。可与药学上可接受载体混合，用于制备防治骨病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种苜蓿酸-3-O-βD-葡萄糖苷及含苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷的大麻药总皂苷的新用途，尤 其是苜蓿酸-3-O-βD-葡萄糖苷在制备防治骨病药物中的用途。

背景技术

大麻药为豆科植物镰扁豆(Dolichos falcatus Kalcatus Klein)的根或叶，别名有麻里麻，麻三段、豆叶 百步还阳等。本品性辛、麻、温。在我国云南，四川，甘肃等地均有分布，尤其在云南有着丰富的植物资 源。具有祛风活血，止血止痛等功效。在云南民间主要用于骨折、跌打损伤、风湿疼痛，外用治疗外伤出 血，还具有抗癌，利尿的作用。目前有关大麻药的主要化学成分是三萜皂苷类与生物碱类化合物。现有技 术中这些化合物的提取工艺复杂，且提取物纯度不高。

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种由多种原因引起的全身性骨骼疾病，它以骨组织显微结构退化， 骨量减少为主要特征，导致骨的脆性增加而容易发生骨折。临床上主要表现为腰背疼痛，病理骨折，身体 畸形，或伴有原发病表现。随着人类寿命的增长和老年型社会的加快形成，骨质疏松已成为严重危害中老 年健康的一类疾病，本病的最大危害是骨折，不仅使国家和个人承担的医疗费用大大增加，而且会导致残 疾、终身丧失独立生活能力甚至死亡，给家庭和社会带来严重的危害。

由于本病复杂的病因病理以及其复杂的调节机制，目前对本病的治疗原则主要为抑制骨吸收，促进骨 形成。治疗药物主要有雌激素类药物、促骨形成药物、抗骨吸收药物和骨矿化药物几大类。虽然疗效确切， 但各种不可避免的副作用或是价格因素令其难以广泛推行。例如曾被认为是最有效治疗方法的雌激素替代 疗法，目前发现该疗法有导致乳房胀痛、阴道出血的副作用，而且有增加子宫内膜癌、乳腺癌及心脑血管 疾病的危险，因此限制了其在临床上的广泛使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是从中国特色民族药物中提取分离防治骨病的有效部位和/或有效成分，以便 制备疗效显著、毒副作用小、服用方便、可长期使用，且价格低廉的治疗骨病尤其是防治骨质疏松和/或促 进骨愈合的药物。

本发明提供苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷在制备防治骨病药物中的应用：所述苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷作 为活性成分与药学上可接受的载体或辅料制备成防治骨病药物或药物组合物。

优选地，所述防治骨病药物为防治骨质疏松和/促进骨损伤愈合药物。即，苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷 优选是用于制备防治骨质疏松和/促进骨损伤愈合药物。

本发明还提供大麻药总皂苷在制备防治骨病药物中的应用：所述大麻药总皂苷作为活性成分与药学上 可接受的载体或辅料制备成防治骨病药物或药物组合物。

优选地，防治骨病药物为防治骨质疏松和/促进骨损伤愈合药物。即，大麻总皂苷优选是用于制备防治 骨质疏松和/促进骨损伤愈合药物。

本发明还提供苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷和大麻药总皂苷的任意比混合物在制备防治骨病药物中的应 用：苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷和大麻药总皂苷的任意比混合物作为活性成分与药学上可接受的载体或辅料 制备成防治骨病的药物或药物组合物。

优选地，所述防治骨病药物为防治骨质疏松和/促进骨损伤愈合药物。即，大麻总皂苷和大麻药总皂苷优选 是用于制备防治骨质疏松和/促进骨损伤愈合药物。

上述药学上可接受的载体包括口服制剂辅料、胃肠外途径给药或外用给药的辅料。给药途径可以是口 服、注射、外用局部给药等。根据本发明的技术方案，该组合物是口服制剂或外用制剂，其中口服制剂包 括胶囊剂、颗粒剂、口服液、片剂、滴丸等。所用辅料包括：淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、环糊精、微晶纤 维素钠、丙二醇、甘油、异丙醇、吐温-80、维生素C、乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、硬脂酸镁、柠檬酸和明 胶等常规辅料。外用制剂可为巴布贴等。制剂的后期制备工艺及设备均属制药领域的常规技术，本发明对 此不作限定，故不予详述。

与现有技术比较本发明具有有益效果：本发明首次提出了以苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷为主要活性成分 的大麻药提取物，药效试验表明，含苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷的大麻药总皂苷(无特殊提示，后面均简称 为大麻药总皂苷)及苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷具有显著的防治骨病作用，特别是在制备防治骨质疏松和/ 促进骨损伤愈合药物中的应用，且毒副作用小，疗效确切，安全可控，价格低廉。

图面说明

图1苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷质谱图

图2苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷氢谱图

图3苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷碳谱图

图4苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷结构式

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以 实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

大麻药总皂苷、苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷的制备

大麻药总皂苷的制备：取大麻药颗粒250g，置于5L的圆底烧瓶中，加入大麻药颗粒10倍重量的体积浓度 60％的乙醇，浸泡2小时后，水浴回流提取，共提取三次，提取时间分别为2、1.5、1小时，合并滤液。 滤液减压回收乙醇至无醇味后，经60℃减压干燥至干，得大麻药总皂苷约55克(HPLC法测定，苜蓿酸 -3-O-β-D-葡萄糖苷的含量≥52％)。

苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷制备方法：取大麻药颗粒250g，置于5L的圆底烧瓶中，加入大麻药颗粒10 倍重量的体积浓度60％的乙醇，浸泡2小时后，水浴回流提取，共提取三次，提取时间分别为2、1.5、1 小时，合并滤液。滤液减压回收乙醇至无醇味后，配置成含0.05g生药材/mL的药液；药液用盐酸调PH 为5；将配好的药液上已处理好的HPD500型大孔吸附树脂柱，柱的径高比为1∶5，上样量以药材量计与树 脂重量比为3∶5(上样药液的量以其对应的大麻药颗粒的重量限定，即为从与树脂重量比为3∶5的大麻药颗 粒得到药液)，上样流速为1BV/h。上样后，用8倍柱体积的浓度为30％乙醇或甲醇冲洗除杂，流速为2.5 BV/h，再用6倍柱体积的浓度为60％乙醇或甲醇洗脱，流速为2BV/h，收集浓度为60％洗脱液，浓缩、 干燥，即得苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷(HPLC法测定纯度≥90％)。

实施例2

对实施例1提取得到的苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷结构鉴定。

苜蓿酸-3-O-βD-葡萄糖苷，该化合物分子式为C₃₆H₅₆O₁₁，白色无定型粉末，易溶于甲醇、乙醇与水； 熔点：m.p.249-251℃；UV：在紫外190-400nm下进行全波段扫描，发现在192nm下有最大吸收；质谱数 据：EI-MS(70eV)m/z，[M]-663.5(100)(图1)；IR：3400、2930、1695、1445、1260、1165cm^-1，表明 有酚羟基、羰基、酮基与双键；再结合核磁氢谱与碳谱(图2与图3)鉴定化合物为苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄 糖苷(图4)。

实施例3

大鼠维甲酸骨质疏松模型

苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷(简称MD，含MD质量百分比等于92％)和大麻药总皂苷(简称DZ，含 MD质量百分比等于65％)的体内抗骨病(具体为抗骨质疏松)实验。

1.受试药物

给药样品：自制的大麻药总皂苷样品与苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷样品(特征同上)；对照药物：依膦 片剂(连云港正大天晴制药有限公司生产；批号：H12562112)；维甲酸(上海第六制药厂生产；批号：110315)。

2.实验动物

实验动物为SPF级SD大鼠，体重200±20克，雄雌各半，由华中科技大学同济医学院提供，许可证 号SCXK(鄂)2004-0007，实验动物合格证号No00009567。动物于25℃、相对湿度为60-75％条件下饲养1 周后用于实验。

3.主要试剂与设备

碱性磷酸酶试剂盒(ALP)：南京建成生物工程研究所，批号：20120310；血清无机磷试剂盒：南京建 成生物工程研究所，批号：20120420；生理盐水：石家庄四药有限公司生产，批号：110628352；Sartorius 分析天平：北京赛多利斯天平有限公司。TGL-20M冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；高温电炉、晶 体管式自动恒温控制台(江苏省东台县电器厂)；LA204电子天平(常熟市恒器厂)；721分光光度计(上海第 三分析仪器厂)；岛津AA-670火焰原子吸收光谱仪。

4.实验方法

按体重随机分为7组，一组作为正常对照组，给予0.3％CMC-Na液，其余6组大鼠均给予维甲酸70 mg/kg，以制备骨质疏松模型，在这6组大鼠中，1组作为模型对照组给予0.3％CMC-Na液，1组给予依瞵 片剂40mg/kg作为阳性对照组，其余4组分别给予苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷高剂量(50mg/kg)、低剂量 (25mg/kg)及大麻药总皂苷高剂量(100mg/kg)、低剂量(50mg/kg)。动物同时灌胃维甲酸及药物2周 后，停服维甲酸，继续给药2周，每天给药一次，均于每天上午8:00-10:00给药，于给药过程中，每天 称一次体重，根据体重调整给药量。末次给药后禁食24小时(不禁水)后，给大鼠股静脉放血，用碱性 磷酸酶试剂盒测定血清碱性磷酸酶含量；股静脉放血后处死大鼠，分离双侧股骨，取右侧股骨测定以下指 标：①.称重并计算骨重系数(g/100g体重)；②.用直尺测量股骨长度，用千分卡尺测量股骨头直径；③. 测完上述指标后将标本用10％甲醛溶液固定，用双能X射线骨密度测定仪测定股骨骨密度；④.将测完骨 密度之后的右侧股骨干燥并碳化后置于800℃马福炉中灰化8小时制成骨灰，测定骨灰含量(mg/g骨)； ⑤.称取一定量骨灰溶于6N HCl，用血清无机磷测定试剂盒测定骨磷；另取一定量的骨灰用岛津AA-670火 焰原子吸收光谱测定骨钙含量，将所测结果折算成每克骨重所含骨钙或骨磷的量。将所得数据进行组间t 检验。

5实验结果及分析

5.1苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷对维甲酸骨质疏松大鼠血清碱性磷酸酶的影响

血中50％ALP由成骨细胞分泌，成骨活动增强时，可出现ALP活性升高，被认为是成骨细胞分化的 早期标志物。本实验中ALP各组间比较，模型组比正常组显著升高，表明对维甲酸的大量应用，影响了钙 磷代谢和成骨、破骨过程，造成骨盐丢失，骨负重能力下降。而在服用阳性药(依瞵片剂)和高、低两个 剂量的苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷后，ALP水平较模型组均有回落，且苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄 糖苷与大麻药总皂苷分别二个剂量组的作用与阳性药相当(表1)。

表1苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷对维甲酸骨质疏松大鼠血清碱性磷酸酶的影响(n＝8)

*P＜0.05，**P＜0.01vs模型组.^#P＜0.05，^##P＜0.01vs空白组.

5.2苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷对维甲酸骨质疏松大鼠骨重系数、股骨长度和股骨头直 径的影响

与模型组比较，苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷分别二个剂量组及依瞵片剂组对大鼠骨重系 数、股骨长度及股骨头直径均有显著性升高作用(表2)。

表2苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷对维甲酸骨质疏松大鼠骨重系数、股骨长度和股骨头直 径的影响(n＝8)

*P＜0.05，**P＜0.01vs模型组.^#P＜0.05，^##P＜0.01vs空白组

5.3苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷对维甲酸骨质疏松大鼠骨灰含量、骨钙和骨磷的影响

模型组大鼠骨组织微量元素钙、磷均显著降低，给予药物治疗后，各治疗组均有一定程度的改善，微 量元素钙、磷明显升高(表3)。

表3苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷对维甲酸骨质疏松大鼠骨灰含量、骨钙和骨磷的影响 (n＝8)

*P＜0.05，**P＜0.01vs模型组.^#P＜0.05，^##P＜0.01vs空白组

5.4苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷对维甲酸骨质疏松大鼠骨密度的影响

模型组大鼠骨组织的骨密度显著降低，给予药物治疗后，各治疗组均有一定程度的改善，骨密度明显 升高(表4)。

表4苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷与大麻药总皂苷对维甲酸骨质疏松大鼠骨密度的影响()(n＝8)

*P＜0.05，**P＜0.01vs模型组.^#P＜0.05，^##P＜0.01vs空白组

6小结

实验中发现使用维甲酸后各组大鼠均出现食量减少、倦卧等现象，但体重并未出现显著性降低。骨代 谢指标具有创伤小、快速灵敏等特点。对于评价骨状态及临床诊断治疗具有重要意义。血清中约50％ALP 源于骨，因此血清碱性磷酸酶可以部分地反应成骨细胞活性，常作为反映骨形成的生化指标。当成骨细胞 活跃时可以分泌大量的ALP，ALP一部分参与骨的钙化，一部分能够释放到血液中，使血中ALP含量升 高。本实验模型组大鼠ALP含量显著增加，这可能是由骨吸收亢进而代偿性引起骨形成增加引起的。骨钙 和骨磷对于骨矿代谢的研究有重要价值。骨钙和骨磷含量多少对于临床评价钙和磷平衡意义显著，其量基 本能够反映骨代谢的状态。骨钙和骨磷的含量可以说明，模型组动物骨量存在严重丢失的现象，而苜蓿酸 -3-O-β-D-葡萄糖苷和大麻药总皂苷可以促进其含量的增加，提示苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷和大麻药总皂苷 抑制维甲酸引起的大鼠骨丢失，促进骨钙沉积和/或抑制骨钙流失。且苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷组和大麻 药总皂苷组大鼠股骨密度提高，提示苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷和大麻药总皂苷能改善维甲酸引起的大鼠骨 的生物力学性能。

实施例4

按实施例1所述方法，制备获得的苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷样品，加入片剂常用辅料，按常规制备工 艺制备成片剂。

按实施例1所述方法，制备获得的大麻药总皂苷样品，加入片剂常用辅料，按常规制备工艺制备成片 剂。

也可将按实施例1所述方法制备获得的大麻药总皂苷样品与苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷样品按任意比例 混合加入片剂常用辅料，按常规制备工艺制备成片剂。

实施例5

按实施例1所述方法，制备获得的苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷样品，加入胶囊剂常用辅料，按常规制备 工艺制备成胶囊剂。

按实施例1所述方法，制备获得的大麻药总皂苷样品，加入胶囊剂常用辅料，按常规制备工艺制备成 胶囊剂。

也可将按实施例1所述方法制备获得的大麻药总皂苷样品与苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷样品按任意比例 混合加入胶囊剂常用辅料，按常规制备工艺制备成胶囊剂。

实施例6

按实施例1所述方法，制备获得的苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷样品，加入巴布剂常用辅料，按常规制备 工艺制备成巴布剂。

按实施例1所述方法，制备获得的大麻药总皂苷样品，加入巴布剂常用辅料，按常规制备工艺制备成 巴布剂。

也可将按实施例1所述方法制备获得的大麻药总皂苷样品与苜蓿酸-3-O-β-D-葡萄糖苷样品按任意比例 混合加入巴布剂常用辅料，按常规制备工艺制备成巴布剂。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术 领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围 以权利要求书为准。