液相色谱串联质谱法测定香精香料中芝麻酚的方法

摘要

本发明涉及一种香精香料中芝麻酚的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法测定，采用外标法定量。该检测方法具有检测时间短、操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好等优点，该方法色谱条件使得芝麻酚的色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的线性范围，检测限为0.002μg/mL，回收率在90.8%～102.5%之间，相对标准偏差RSD<5%(n=6)。

说明书

技术领域

本发明属于化学检测技术领域，涉及芝麻酚的测定方法，具体地说 是一种通过液相色谱-串联质谱法快速测定香精香料中芝麻酚的方法。

背景技术

当今食品安全问题日益受到社会关注。烟用添加剂，尤其是香精香 料的添加剂安全性问题也越来越受到关注。

芝麻酚，又名3,4-亚甲二氧基苯酚，具有非常强的抗氧化能力，是 常用于食品、医药和香精香料领域的抗氧化剂。然而随着科技的进步， 芝麻酚的致癌活性逐步被认知，毒理学试验发现，芝麻酚对动物腺胃有 毒性，会引起腺胃刺瘤或癌变。2006年日本已将芝麻酚列为食品禁用添 加剂。

目前，对芝麻酚的检测方法主要有显色法、紫外分光光度法、薄层 色谱法(TLC)、气质联用法(GC-MS)及高效液相色谱法(HPLC)等。但这 些方法均存在前处理步骤繁琐，检测时间较长等问题。例如，用气质联 用法(GC-MS)存在检测时间较长的问题，检测一个样品的时间要40分 钟以上，用高效液相色谱法(HPLC)灵敏度较差，检出限（LOD）≥80 ng/mL，且需要的样品量较大（≥1g）。

近年来，随着液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）技术的发展， LC-MS/MS技术在化合物分析中得到广泛的应用。液相色谱串联质谱法 （LC-MS/MS）分析技术无论在灵敏度上还是选择性上都具有明显的优 势，且分析时间较短。为了在工业生产中，对大量香精香料样品的安全 性指标进行有效的监控，急需一种能够快速、简单、灵敏、高效的液相 色谱质谱方法检测香精香料中的芝麻酚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟用香精香料中芝麻酚含量的测定方 法，以实现对烟用香精香料中芝麻酚含量的快速、准确测定。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种香精香料中芝麻酚的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱 法测定，采用外标法定量。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法包括以下步骤：

（1）标准溶液的配制；称取芝麻酚标准品，用甲醇配制成具有浓 度梯度的芝麻酚标准工作溶液；

（2）样品溶液的制备：使用甲醇萃取样品，然后过滤后制备样品 溶液；

（3）液相色谱-串联质谱分析：利用液相色谱-串联质谱仪分别对标 准溶液和样品溶液进行检测分析；

（4）烟用香精香料中芝麻酚含量的计算。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中所述的香精香料为烟用香精香料，优选地，所述的香精香料样 品使用甲醇萃取样品中的芝麻酚；优选地，萃取用的甲醇为浓度为8～ 12％（v/v）甲醇水溶液，更优选地，萃取用的甲醇为浓度为10％（v/v） 甲醇水溶液。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中萃取的方式为超声萃取。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中所述的香精香料样品的制备过程如下：称取适量待测香精香料 样品，加入适量甲醇水溶液,室温下超声萃取,过滤后，得到样品溶液。 优选的过滤方式采用微孔滤膜过滤，例如0.22μm有机滤膜或0.45μm有 机滤膜。

在一个具体的实施方案中，所述香精香料样品的制备方法具体为： 称取0.1g左右试样,置于25mL锥形瓶中;加入10%甲醇水溶液10 mL,室温下超声30min,用0.22μm有机滤膜过滤后直接进样。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中色谱分析条件为以下（i）至（v）中的一项或多项：

（i）采用C18色谱柱，

优选地，所述的色谱柱的规格为50mm×2.1mm i.d.,2.6μm粒径。

（ii）色谱柱温度为28～32℃，优选为30℃，

（iii）进样量为8～12μL，优选为10μL，

（iv）流动相：乙腈-乙酸铵-乙酸-水溶液，

优选的流动相：A为乙腈，B为5mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1%乙酸)， 采用等度洗脱程序，体积比50：50，

（v）流速为0.1～0.3ml/min，优选为0.2ml/min，

（vi）洗脱时间约6min。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中质谱分析条件为以下（i）至（iii）中的一项或多项：

（i）用电喷雾离子阱串联质谱测定芝麻酚，

（ii）离子源：电喷雾电离源（ESI）；

（iii）以选择离子对定性，优选的离子对为：子离子109.0(m/z)， 母离子139.1(m/z)。

在一个具体的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中色谱分析条件为：色谱柱采用菲罗门C₁₈液相色谱柱，色谱 柱温度为30℃，进样量为10μL，流速为0.2ml/min；流动相：A为乙 腈，B为5mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1%乙酸)，采用等度洗脱程序，体 积比50：50，洗脱时间总共约6min。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中质谱分析条件为：扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应 监测（MRM）；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；辅助气 Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰 撞能(CE):20V。

在一个具体的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中所述的质谱分析条件为离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描 方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压： 5000V；离子源温度：350℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2 压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):20V；离子对选择为： 定性离子对m/z139.1>109.0，139.1>81.1，定量离子对m/z139.1>109.0。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中外标法所用的标准溶液的配制步骤如下：称取0.1g芝麻酚， 精确至0.0001g，用甲醇溶解后转移至1000mL容量瓶中，并定容，定 为标准储备液；分别移取0.01mL，0.05mL，0.1mL，0.5mL，1.0mL 的标准储备液到100mL容量瓶中，用萃取剂定容，则芝麻酚的浓度为 0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方 法，其中芝麻酚含量的计算方法为：首先以标准溶液所检测出的目标物 的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；然后将样品 溶液检出的目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得到样品中的芝麻 酚浓度，由此即可计算出烟用香精香料中芝麻酚的含量。

本发明的检测方法对样品的处理方法和色谱条件进行了优化，达到 了以下效果：

（1）检测时间短：采用本发明测定烟用香精香料中芝麻酚含量周 期仅需要6分钟左右；每天可以检测220多个样品。

（2）本发明具有操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好的优 点：本发明方法的色谱条件使芝麻酚的色谱峰与杂质色谱峰分离较好， 并且具有较好的线性相关性，检测限为0.002μg/mL，平均回收率为 90.8%～102.5%，平均相对标准偏差RSD<5%(n=6)。

附图说明

图1为本发明的检测方法的流程图；

图2为实施例1中浓度为0.5μg/mL的标准溶液中芝麻酚的色谱图；

图3为实施例1中样品溶液的色谱图；

图4为芝麻酚的质谱图；

图5为实施例1获得的标准曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例对烟用香精香料中芝麻酚含量进行检测，检测方法如下所 述，所述检测方法的流程图如图1所示。

（1）称取0.1g芝麻酚(分析纯)，精确至0.0001g，用甲醇溶解后转 移至1000mL容量瓶中，并定容，定为标准储备液；分别移取0.01mL， 0.05mL，0.1mL，0.5mL，1.0mL的标准储备液到100mL容量瓶中， 用10%（v/v）甲醇水溶液定容，则芝麻酚的浓度为0.01μg/mL、0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL。标液避光4℃保存，取用 时放置于常温下，达到常温后方可使用。每周做一次标线；

（2）样品溶液的制备：称取0.1g左右的待测烟用香精香料样品,置 于25mL锥形瓶中;准确加入10%甲醇水溶液10mL,室温下超声30 min,用0.22μm有机滤膜过滤后，得到样品溶液，于4℃保存待分析；

（3）色谱分析条件为采用菲罗门C₁₈液相色谱柱，色谱柱温度为 30℃，进样量为10μL，流速为0.2ml/min；流动相：A为乙腈，B为 5mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1%(v/v)乙酸)，采用等度洗脱程序，体积比 50：50。洗脱时间总共6min。浓度为0.5μg/mL的标准溶液的色谱分析 结果见图2；样品溶液的色谱分析结果见图3；

（4）质谱分析条件为离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式： 正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5000V； 离子源温度：350℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi； 去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):20V。芝麻酚的质谱图见图4。依据 碎片丰度高、选择性高的原则顺序，确定离子对选择为：定性离子对m/z 139.1>109.0，139.1>81.1，定量离子对m/z139.1>109.0。

（4）烟用香精香料中芝麻酚含量的计算：首先以标准溶液所检测 出的目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线 （见图5）；与标准曲线相对应的回归方程、相关系数等数据如表1所示。

表1芝麻酚的标准曲线和检测限

然后将样品测得的检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得 到样品中的芝麻酚浓度，由此计算烟用香精香料中芝麻酚的含量，计算 公式如下

m=（A×S）/n

式中：

m—每克烟用香精香料中芝麻酚的含量，单位为微克每克（μg/g）；

A—样品中芝麻酚的浓度（μg/mL）；

S—溶液体积（mL）；

n—称取样品的质量（g）。

由表1和图4可知，所采用的色谱条件使芝麻酚的色谱峰与杂质色 谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.002μg/mL。本实施 例样品的芝麻酚的含量为5.1μg/g。

实施例2

本实施例对本发明方法的重复性和加标回收率进行检测，检测方法 如下所述。

采用标准加入法测定本发明的方法的回收率。称取待测烟用香精香 料样品（该样品与实施例1步骤（2）中所用的香精香料样品相同）0.1g， 各三份，向其中分别加入0.001mL、0.005mL、0.01mL实施例1步骤（1） 中配制的芝麻酚标准储备液，然后按照实施例1步骤（2）“样品溶液 的制备”中的配制方法制备加标样品溶液，每个样品分别测定6次，色 谱和质谱分析的条件同实施例1，根据分析结果计算本方法烟用香精香 料中芝麻酚的加标回收率，结果如表2所示；

表2烟用香精香料中芝麻酚的回收率和重复性（n=6）

由表2可以看出，在3个加标水平上，利用此方法检测烟用香精 香料中芝麻酚的回收率在90.8%～102.5%之间，样品测试结果的相对标 准偏差小于5%，说明本法的回收率较高，重复性较好。