基于荧光素酶标记工程菌的氟喹诺酮类药物残留检测方法

摘要

本发明属于兽药残留分析领域，具体涉及一种基于荧光素酶标记基因工程菌的氟喹诺酮类药物残留的检测方法和应用。本发明包含一种能同时检测11种氟喹诺酮类药物残留的荧光素酶标记基因工程菌的构建及应用。该工程菌为大肠杆菌(Escherichia coli)pK12，保藏号为CCTCC NO：M2013385，由含有recA启动子和荧光素酶报告基因luxCDABE的质粒pRecAlux3转化大肠杆菌K12所得。与现有技术相比，本发明构建的基因工程菌可以同时识别多种氟喹诺酮类药物，拓宽了现有技术的检测对象，具有简单、快速、灵敏、准确和半定量功能等突出优点。

说明书

技术领域

本方法属于兽药残留分析和基因工程技术领域。具体涉及能同时检测11种氟喹诺酮类药物的荧光素 酶标记基因工程菌的构建、同时检测11种氟喹诺酮类药物的检测方法的建立。

背景技术

氟喹诺酮类药物是一类重要的化学合成抗菌药。此类药物抗菌谱广、抗菌活性强，是兽医临床常用 药品。由于未按照休药期规定使用兽用氟喹诺酮类药物或者将人用氟喹诺酮类药物使用在动物上，导致其 在畜禽和水产品中残留严重。氟喹诺酮类药物在动物源性食品中的残留除了对人体有直接的危害作用外， 也影响了我国进出口贸易。我国农业部(2002)、世界卫生组织、欧盟及世界各国均规定了氟喹诺酮类药物 在动物源性食品中的最高残留限量(Maximum Residue Limit,MRL)。

目前用于检测氟喹诺酮类药物残留的方法有理化分析法、免疫分析法和微生物分析法等。理化分析法 主要用于确证，亦可用于筛选，但需要昂贵的仪器作为检测的保证，且其前处理程序较复杂并不适合大量 检测。免疫分析方法灵敏度高、特异性强，但它不能同时检测多种氟喹诺酮类药物，且抗体制备过程复杂。 传统的微生物分析法操作简便、样品前处理简单，可以实现氟喹诺酮类药物的多残留检测，但是该方法难 以定量且灵敏度低。荧光标记工程菌技术，又称作生物发光微生物传感器技术，是一种比传统的微生物学 方法灵敏度更高，且可以检测一类甚至多类物质，在生物检测领域有着极其广泛的应用，如环境污染物重 金属离子、氧化性应激性物质、硝酸盐、DNA损伤剂等。

目前已经有一些文献报道了荧光标记工程菌技术在抗菌药物残留检测中的应用，例如四环素类 [Korpela et al.,Anal.Chem.,1998,70(21),pp4457–4462;Pellinen et al.,J.Agric.Food Chem.,2002,50(17),pp 4812–4815]和β-内酰胺类抗生素(Valtonen et al.,J.Biomol.Screen,2002,7(2),pp127-134)等。该技术最近也 用于氯霉素和氟喹诺酮类的药物检测。Shapiro等[Shapiro et al.,J.Biotechnol.,2007,4(132),pp487-493]比较 两种融合蛋白cspA::lacZ和cspA::luc检测氯霉素的效果，结果显示萤火虫荧光素酶比β-半乳糖苷酶更快速 灵敏；SOS诱导型启动子sulA与lucR1融合蛋白检测氧氟沙星检的测限相当于其MIC的15%；他们将 cspA::lacZ和sulA::lucR1结合构建一种同时检测氯霉素和氧氟沙星的生物传感器。

本申请人所在的华中农业大学国家兽药残留基准实验室前期研究了荧光标记工程菌技术在氟喹诺酮 类药物检测中的应用(黄明威，华中农业大学硕士学位论文，2010，华中农业大学图书馆，中国知网)，将 质粒pRecAlux3(recA’::luxCDABE)[该质粒由Vollmer等人构建用来检测丝裂霉素等DNA损伤剂(Vollmer et  al.,Appl.Environ.Microbiol.,1997,63(7),pp2566-2571)]转化至大肠杆菌ATCC128中，构建了一株敏感性 和特异性较好的荧光素酶标记基因工程菌大肠杆菌pR128，建立了猪肝脏、肾脏、肌肉和牛奶这四种组织 中氟喹诺酮类药物残留的检测方法，其最低检测限(Limit of Detection,LOD)为50μg/kg，低于欧盟和我国 的MRL。然而，该研究所构建工程菌株在稳定性方面存在缺陷，组织样品检测范围不够广，在实际应用 中还有待进一步完善。本发明的目的是筛选并构建一株对氟喹诺酮类药物敏感、特异性好、且在传代过程 中可以稳定检测氟喹诺酮类药物的荧光素酶标记基因工程菌，并建立能适用于多种可食性动物产品中氟喹 诺酮类药物的多残留检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，筛选并构建出一株对氟喹诺酮类药物敏感、特异性好、且在 传代过程中可以稳定检测的荧光素酶标记基因工程菌。

本发明的第二个目的是利用该基因工程菌，建立一种能用于组织样品中多种氟喹诺酮类药物残留检测 的分析方法。该方法的组织样品前处理过程简单、涵盖的组织样品范围广(包括牛奶、鱼肉、鸡肉、牛肉、 猪肉、鸡肝脏、鸡肾脏、牛肝脏、牛肾脏、猪肝脏和猪肾脏)、操作简便快捷。

本发明的第三个目的是在组织样品中的氟喹诺酮类药物种类已知时，可以对其进行半定量分析。

为了实现本发明的任务，发明人构建了能特异、敏感、稳定识别氟喹诺酮类药物的荧光素酶标记基因 工程菌大肠杆菌(Escherichia coli)pK12，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)pK12，该菌株为重组大肠 杆菌，含有质粒pRecAlux3，该菌株于2013年8月28日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心 保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2013385（它是由含有recA启动子和荧光素酶报告基因的质粒pRecAlux3 转化大肠杆菌K12所得的；质粒pRecAlux3由美国斯沃斯莫尔学院生物学系Amy Cheng Vollmer教授赠送于 华中农业大学国家兽药残留基准实验室并保存；大肠杆菌K12购自中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏 中心，其保藏编号为CCTCC NO：AB200068）。

本发明提供了一种同时检测11种氟喹诺酮类药物残留的基于荧光素酶标记基因工程菌的检测方法， 该方法包括荧光素酶标记基因工程菌的构建、工程菌的培养和样品前处理等步骤，具体如下：

(1)用质粒pRecAlux3转化大肠杆菌K12，得到重组的大肠杆菌(Esherichia coli)pK12，其保藏号为 CCTCC NO：M2013385；

(2)组织样品处理：将待测样品动物肝脏、肾脏和肌肉用磷酸盐缓冲液提取，牛奶样品可以直接上样 检测；

(3)将步骤(1)得到的重组的大肠杆菌(Esherichia coli)pK12在含25μg/mL卡那霉素的LB肉汤培养基 中于26℃，250rpm恒温摇床中培养至OD₆₀₀=1；

(4)将步骤(3)得到的新鲜菌液与步骤(2)得到的待测样品在26℃静置孵育60min，用多功能酶标仪检测 荧光量；

(5)计算诱导系数值IC，其公式为：IC=Li/Lb-1

式中IC：诱导系数；Li：样品的荧光强度；Lb：空白组织的荧光强度。

其中：

步骤(2)中的磷酸盐缓冲液按如下步骤制得：称取0.523g KH₂PO₄和16.73g K₂HPO₄溶解于800mL蒸 馏水中，调节pH值至8.0，定容至1L，121℃高压蒸汽下灭菌20min，备用。

本方法的主要优点是：

1、本发明构建的基因工程菌大肠杆菌pK12能够同时识别11种氟喹诺酮类药物，而现有的文献和专 利报道尚不能识别如此多种氟喹诺酮类药物；

2、本发明建立的检测方法可以检测11种氟喹诺酮类药物的残留情况，检测限均在欧盟规定的MRL 以下，且在氟喹诺酮类药物种类已知时，可以对其进行半定量分析，而现有微生物学方法检测限高，识别 的药物种类有限，无法定量；

3、本发明适用的组织包括猪、鸡、牛的肝脏、肾脏和肌肉、鱼肉、牛奶等11种组织，适用范围广；

4、本发明涉及的样品处理方法简便，易操作，准确度和精密度好。

附图说明

图1：为本发明的总体技术路线图。

图2：为本发明构建的质粒pRecAlux3的图谱。

图3：为大肠杆菌pK12与恩诺沙星孵育不同时间的敏感性，其中X轴为恩诺沙星标准品溶液浓度的 对数值，Y轴为对恩诺沙星标准品溶液的诱导系数值。

图4：为恩诺沙星对大肠杆菌pK12的诱导标准曲线，其中X轴为恩诺沙星标准品溶液浓度的对数值， Y轴为对恩诺沙星标准品溶液的诱导系数值。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1 荧光素酶标记基因工程菌的构建

挑取少量大肠杆菌K12(购自中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO： AB200068)冻干粉，接种至10mL的LB肉汤培养基中，37℃，250rpm恒温摇床中震摇培养过夜。挑少量 菌液划线接种于LB琼脂平板，37℃过夜。将大肠杆菌K12制备成感受态细胞[细菌感受态细胞的方法为 常用方法，参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指 南(第三版)，北京，科学出版社，2002版]，-70℃冻存。

将质粒pRecAlux3(由美国斯沃斯莫尔学院生物学系Amy Cheng Vollmer教授赠送于华中农业大学国 家兽药残留基准实验室并保存)转化大肠杆菌K12感受态细胞，得到重组的荧光素酶标记基因工程菌大肠 杆菌pK12。挑取大肠杆菌pK12单菌落接种至10mL的LB肉汤培养基中(含25μg/mL卡那霉素)，26℃， 250rpm恒温摇床中震摇培养，约7小时OD₆₀₀值可达到1，取200-500μL菌液传代，约5～6小时，OD₆₀₀值可达到1（用于传代的菌液可于4℃保存一周左右）。

实施例2 氟喹诺酮类药物检测方法的建立

2.1菌液最佳工作浓度的确定

大肠杆菌pK12在LB液体培养基中(含25μg/mL卡那霉素)，26℃，250rpm条件下进行培养，培养至 OD₆₀₀ 0.7和1时，检测大肠杆菌pK12对恩诺沙星的敏感性，孵育时间为45min；结果表明对数生长期内 菌液浓度越高，敏感性越高，因此采用OD₆₀₀=1时的菌液为工作菌液。

2.2菌液与药物最佳孵育时间的确定

大肠杆菌pK12在10mL LB液体培养基中(含25μg/mL卡那霉素)进行培养至OD₆₀₀=1，分别添加一 系列浓度梯度的恩诺沙星(0.025μg/mL、0.050μg/mL、0.100μg/mL、0.200μg/mL、0.400μg/mL、0.800μg/mL)， 药物与菌液各50μL共孵育一定时间，分别在30min、45min、60min进行荧光检测，根据公式1计算诱 导系数。

公式1：诱导系数(IC)=样品的荧光强度(Li)/空白组织的荧光强度(Lb)-1

虽然三个时间点(30min、45min、60min)的诱导系数值和添加浓度对数都有良好的线性相关性，但是 30min的诱导系数值过低，60min诱导系数值最高，因此选择60min作为药物与菌液孵育的时间。

2.3标准曲线的建立

将恩诺沙星标准储备液用LB肉汤稀释配制成0μg/L、6.75μg/L、12.5μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、 200μg/L和400μg/L这8个浓度梯度，按照优化后的条件测定，以恩诺沙星浓度对数为横坐标，诱导系数 值为纵坐标，绘制标准曲线。检测方法的回归方程和相关系数为：y=1.4004x-0.6813，r=0.9983，线性范 围为6.75-200μg/L。

2.4交叉反应率试验

将11种氟喹诺酮类药物的标准储备液用LB肉汤稀释成一系列浓度，按照上述优化的条件进行检测， 计算诱导系数为1时对应的药物浓度值，并将其与恩诺沙星的进行比较，根据公式2计算交叉反应率，如 表1所示。

公式2：交叉反应率(%)=C_(IC=1)(恩诺沙星)/C_(IC=1)(其他药物)×100%

表1大肠杆菌pK12对氟喹诺酮类药物的交叉反应率

结果表明，大肠杆菌pK12对11种氟喹诺酮类均有较高的交叉反应率，可用于动物组织中氟喹诺酮 类药物残留检测方法的建立。

实施例3本发明建立的方法的实施程序

3.1试剂的配制

磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取0.523g KH₂PO₄和16.73g K₂HPO₄溶解于800mL蒸馏水中，调节 pH值至8.0，定容至1L，121℃高压蒸汽下灭菌20min，备用。

3.2组织样品前处理

肌肉和内脏样品的前处理方法：分别取牛、鸡、猪的肌肉、肝脏、肾脏及鱼肉样品，去除筋膜，剪碎， 匀质5min。称取匀质组织1.0g于离心管中，加无菌的pH8.0的磷酸盐缓冲液2mL，涡旋混合5min，室 温静置30min，12000g离心10min，取上清液待测。

牛奶样品的前处理方法：新鲜牛奶样品可以直接上样检测。

3.3测定步骤

样品与菌液孵育:取处理好的样品上清液50μL加入96孔白板，加入菌液50μL于96孔白板中与样 品孵育，在26℃静置孵育温度60min；然后将96孔白板置于多功能酶标仪检测荧光强度，根据公式1计 算诱导系数。

3.4结果判断

以恩诺沙星浓度对数为横坐标，诱导系数值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，给出回归方程。

组织中氟喹诺酮类药物浓度的计算：

计算样品诱导系数并带入回归方程中，乘以稀释系数，计算出组织中恩诺沙星浓度(C_ENR)，并根据公 式3计算出组织中氟喹诺酮类药物浓度(C_FQNs)。

公式3：C_FQNs=C_ENR/交叉反应率

实施例4本发明建立的方法的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验

4.1本方法的灵敏度试验

最低检测限(LOD)为荧光强度明显增强的药物添加的最低浓度。本试验对每种药物重复五批，每个浓 度重复5次，即25次检测结果诱导系数值均大于0.5的最小浓度为最低检测限。用上述优化好的方法对氟 喹诺酮类药物进行检测，最低检测限如表2所示，该类药物的最低检测限均低于欧盟规定的最高残留限量 (MRL)。

表2大肠杆菌pK12对动物组织中氟喹诺酮类药物的最低检测限

4.2本方法的精密度试验

分别将12.5μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L恩诺沙星标准品浓度对应的诱导系数值代 入其标准曲线方程求出检测的测定值，以标准品浓度测定值计算标准曲线的板内和板间变异系数，结果如 表3所示。标准曲线的板内及板间变异系数均小于15%，说明本研究建立的检测方法具有较好精密度。

表3标准曲线的板内与板间变异系数

4.3本方法的准确度和重复性试验

将每种氟喹诺酮类药物分别添加到空白的牛奶、鱼肉(鲢鱼)、猪的肌肉、肾脏、肝脏、鸡的肌肉、肾 脏、肝脏和牛的肌肉、肾脏、肝脏样品中，每个浓度分别设置5个重复（1/2MRL、MRL、2MRL），重复测 定3次。按照公式4计算回收率，考核方法的准确度；计算批内和批间变异系数，考核方法的重复性。其添 加回收率及批内与批间变异系数测定结果见表4～表14。药物回收率在51.01～124.65%之间，大部分药物基 本符合农业部对回收率在60～120%的要求，说明准确度良好；批内和批间变异系数分别在25%和30%以内， 说明重复性良好。

公式4：回收率(%)=实测浓度/添加浓度×100%

表4氟喹诺酮类药物在牛奶中的添加回收率和变异系数

表5氟喹诺酮类药物在鱼肉中的添加回收率和变异系数

表6氟喹诺酮类药物在鸡肉中的添加回收率和变异系数

表7氟喹诺酮类药物在牛肉中的添加回收率和变异系数

表8氟喹诺酮类药物在猪肉中的添加回收率和变异系数

表9氟喹诺酮类药物在猪肝脏中的添加回收率和变异系数

表10氟喹诺酮类药物在猪肾脏中的添加回收率和变异系数

表11氟喹诺酮类药物在鸡肝脏中的添加回收率和变异系数

表12氟喹诺酮类药物在鸡肾脏中的添加回收率和变异系数

表13氟喹诺酮类药物在牛肝脏中的添加回收率和变异系数

表14氟喹诺酮类药物在牛肾脏中的添加回收率和变异系数