硫化氢及其供体在改善精子质量及功能中的应用

摘要

硫化氢及其供体在改善精子质量及功能中的应用，涉及在生殖领域。硫化氢能够通过在体外直接添加到精液中，短时间内即可以显著提高临床弱精子症患者精子的活力。硫化氢还可以为体外培养的精子抵抗氧化应激，减轻因为人为操作和离体培养对精子造成的应激损伤，维持精子的活力水平。硫化氢还能够改善感染所造成生精障碍，保护睾丸的生精结构，维持血睾屏障的完整性，以及雄激素的合成，减轻睾丸组织中的炎性水平，和生精细胞的氧化应激，减少感染所引起的生精细胞的凋亡，从而维护正常的生精过程，保持精子的质量，维持雄性正常的生育能力。本发明开拓了硫化氢一个新的应用领域，对于解决人类生殖障碍，改善辅助生殖技术提供了有意义的参考。

说明书

技术领域

本发明涉及一种气体分子硫化氢（Hydrogen sulfide，H₂S）及其供体的用途，尤其涉及在 生殖领域内的应用。

背景技术

据世界卫生组织报道，在世界范围内，已婚夫妇中约有5%-30%不能生育，不孕不育的 比例在发展中国家更为突出，在我国发病率约10％，且有逐渐上升趋势。其中男性不育是造 成人类生殖障碍的重要因素，约占40%-60%。近年来，辅助生殖技术及的问世，如人工授精 (IUI)、体外受精—胚胎移植(IVF)和卵浆内单精子注射（ICSI）等，为解决人类生殖障碍提 供了有力的手段。但无论是正常生育功能的维持，还是辅助生殖技术的治疗均涉及到精子的 质量，维持甚至提高精子的质量对于解决人类生殖障碍，提高辅助生殖的成功率都有着重要 的作用。

不育男性中超过85%均能够产生精子，但是大多质量低下，临床上通常表现为少精子症、 弱精子症及少弱精子症，即精子数目过少，或者运动能力低下，这是导致男性不育的重要原 因。精子发生是一个极其复杂的过程，是精原细胞生长分化与成熟的一个连续动态的过程。 同时在精子发育的过程中有很多的细胞因子和局部的调节起了重要作用，生精细胞、支持细 胞以及间质细胞的共同作用维持了精子发生的特殊环境。精子发生过程中的任何一个环节发 生障碍，均会影响精子的质量，造成男性不育。除了基因突变和染色体异常等遗传因素，环 境因素和感染等疾病因素均是导致精子发生障碍的重要原因。这其中氧化应激与炎症反应是 最关键的损伤机制。

目前为止，男性生精障碍的治疗大都收效甚微。从激素治疗，到补充相应营养成分（抗 氧化作用），很多种疗法都已经被尝试。虽然有些研究表明某些疗法有一定的效果，但是没 有任何一种疗法能够对所有患者都起效，同时又无法预测该疗法能够适用于哪类患者。尽管 目前辅助生殖技术已经大大取代了生精障碍的传统医疗方法，但是能够找到一种解决男性生 精障碍的药物，不仅能够大大提高辅助生殖的成功率，也有助于提高人类自然受孕的概率， 避免辅助生殖技术带来的伦理风险和潜在生育缺陷。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对上述技术空白，提供一种硫化氢及其供体在改善和提高人 类生育能力中的应用。

技术方案：硫化氢及其供体在体外改善精子质量及功能的应用。硫化氢及其供体在体外 培养液中改善和维护精子质量及功能的应用。硫化氢及其供体在制备治疗不孕不育药物中的 应用。

有益效果：在本发明中，硫化氢（H₂S）及其供体能够通过在体外直接添加到精液中，短 时间内即可以显著提高临床弱精子症患者精子的活力。

在本发明中，硫化氢（H₂S）及其供体可以为体外培养的精子抵抗氧化应激，减轻因为人 为操作和离体培养对精子造成的应激损伤，维持精子的活力水平。

在本发明中，硫化氢（H₂S）及其供体能够改善感染所造成生精障碍，保护睾丸的生精结 构，维持血睾屏障的完整性，以及雄激素的合成，减轻睾丸组织中的炎性水平，和生精细胞 的氧化应激，减少感染所引起的生精细胞的凋亡，从而维护正常的生精过程，保持精子的质 量，维持雄性正常的生育能力。

本发明对硫化氢（H₂S）及其供体发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，对于 解决人类生殖障碍，改善辅助生殖技术提供了有意义的参考。

附图说明

图1在离体精液中添加H₂S对弱精子症病人精子活力的影响。*与相应时间为未给予硫 化氢的实验组相比p<0.05。

图2在离体的精子培养液中加入不同浓度的过氧化氢（H₂O₂），同时添加H₂S，观察其 对精子活力的影响。*与未加H₂O₂处理的对照组相比p<0.05，#与相同浓度H₂O₂处理但未给 予硫化氢供体GYY4137预处理的实验组相比#<0.05。

图3在离体的精子培养液中加入不同浓度的过氧化氢（H₂O₂），同时添加H₂S，观察其 对精子前向运动能力的影响。*与未加H₂O₂处理的对照组相比p<0.05，#与相同浓度H₂O₂处 理但未给予硫化氢供体GYY4137预处理的实验组相比#<0.05

图4注射细菌脂多糖（LPS）后，H₂S供体GYY4137对小鼠附睾尾部精子密度的影响。 *与生理盐水组（saline）相比*<0.05，***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。

图5注射细菌脂多糖（LPS）后，H₂S供体GYY4137对小鼠附睾尾部精子活率的影响。 *与生理盐水组（saline）相比***<0.001，#与LPS实验组相比###<0.001。

图6注射细菌脂多糖（LPS）后，H₂S供体GYY4137对小鼠附睾尾部精子前向运动能力 的影响。*与生理盐水组（saline）相比***<0.001，#与LPS实验组相比##<0.01。

图7注射细菌脂多糖（LPS）后，H₂S供体NaHS对小鼠附睾尾部精子密度的影响。*与 生理盐水组（saline）相比**<0.01，***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。

图8注射细菌脂多糖（LPS）后，H₂S供体NaHS对小鼠附睾尾部精子活率的影响。*与 生理盐水组（saline）相比*<0.05，***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。

图9注射细菌脂多糖（LPS）后，H₂S供体NaHS对小鼠附睾尾部精子前向运动能力的 影响。*与生理盐水组（saline）相比**<0.01，***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。

图10注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中生精结构的影响，苏木素-伊红染色×200。

图11注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中促炎因子IL-1β的影响。*与生理盐水组（saline） 相比***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。

图12注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中促炎因子IL-6的影响。*与生理盐水组（saline） 相比***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。

图13注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中促炎因子TNF-α的影响。*与生理盐水组（saline） 相比***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。

图14注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中促炎因子iNOS的影响。*与生理盐水组（saline） 相比**<0.01，***<0.001，#与LPS实验组相比###<0.001。

图15注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中抗炎因子IL-10的影响。*与生理盐水组（saline） 相比**<0.01，#与LPS实验组相比#<0.05。

图16注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中氧化应激水平的影响，DHE染色×200

图17注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中生精细胞凋亡情况的影响，TUNEL染色×200

图18注射LPS后，H₂S对小鼠睾丸中血睾屏障完整性的影响，免疫荧光染色×400。

图19注射LPS后，H2S对小鼠血清睾酮水平的影响。*与生理盐水组（saline）相比 ***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明 精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例 中所使用的试剂和材料均为市售产品。实例中所用硫化氢供体GYY4137由新加坡国立大学 Phillip Moor教授赠送，另一硫化氢供体NaHS为市售产品，购买于Adamas Reagent Co.， Ltd.

本发明所述化合物可以制成注射液，用于静脉滴注、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、 皮下注射。亦可以制成口服的胶囊，片剂等。

实施例1：硫化氢（H₂S）对弱精子症病人离体精液中精子活力的改善。

选择弱精子症患者的精液样本进行实验。手淫法排精，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天 的精子样本。将样品水浴保持22-37℃，液化后的精液，根据WHO《人类精液检查与处理实 验室手册》第5版(《WHO5》)标准评价，使用电脑辅助精液分析仪CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research，Inc.Beverly，MA，USA），对精子参数（体积，精子计数，活力 和运动特性的百分比）进行评估。

硫化氢供体GYY4137溶于生理盐水，加入精液中的终浓度为2.5μM。精液置于37℃，5% CO₂的培养箱中培养2小时，分别在15分钟、30分钟、60分钟、120分钟使用计算机辅助精液 分析仪CASA，对精子活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的精子数目不 小于500个。

图1精子活率的变化曲线显示，硫化氢能够显著地维持和改善弱精子症病人精子的活力 水平。

实施例2：硫化氢（H₂S）对离体精子在精子培养液中受到氧化应激时精子活力的改善

选择健康男性的精子捐赠者的精子样本进行实验。手淫法排精，用特定的无菌容器收集 禁欲2-7天的精子样本。将样品水浴保持22-37℃，液化后的精液，根据WHO《人类精液检查 与处理实验室手册》第5版(《WHO5》)标准评价，使用电脑辅助精液分析仪CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research，Inc.Beverly，MA，USA），对精子参数（体积，精子计数，活力 和运动特性的百分比）进行评估。

密度梯度离心法从精液中分选精子，分离后的精子培养在商品化的精子培养液中，先给 与50μM的硫化氢供体GYY4137孵育30分钟，之后加入不同浓度的H₂O₂，，置于37℃，5%CO₂的培养箱中培养2小时，使用计算机辅助精液分析仪CASA，对精子活力进行评估。对于每个 标本，选取6-10个视野，计数到的精子数目不小于500个。

图2，图3精子活率及前向运动能力变化的结果显示，硫化氢能够帮助离体培养的精子抵 抗外来的氧化应激。

实施例3：硫化氢（H₂S）对LPS造成小鼠精子发生障碍的保护作用

选用SPF级雄性C57BL/6小鼠（购于南京大学模式动物所，下同），8-10周，随机分为 四组：溶剂对照组（Saline）、硫化氢对照组（GYY4137）、损伤组（LPS）、损伤+给药组 （LPS+GYY4137/NaHS），每组10只。LPS溶于生理盐水，以10mg/kg的剂量通过腹腔注射 造成小鼠的生精功能损伤模型，在给予LPS后1小时，将硫化氢供体GYY4137/NaHS溶于生 理盐水，以GYY4137（50mg/kg）/NaHS（(50μmol/kg)的剂量通过腹腔注射给药。给药24 小时后，牺牲小鼠，取小鼠附睾尾部的精子，睾丸组织和血清进行相关参数的测定。

图4，图5，图6显示小鼠附睾尾部的精子质量在给予硫化氢供体GYY4137前后的变化。 图7，图8，图9显示小鼠附睾尾部的精子质量在给予另外一种硫化氢供体NaHS前后的变化。 结果表明LPS造成小鼠附睾尾部精子的密度、活率和前向运动精子率出现了明显下降，而给 予硫化氢之后，这三项精子质量指标均出现了明显恢复。

图10对小鼠睾丸组织做石蜡切片，进行苏木素-伊红染色观察睾丸生精结构的情况。如 图显示，LPS刺激小鼠的睾丸生精结构紊乱，生精细胞出现脱落，生精小管结构也被破坏。 而给予硫化氢后，小鼠睾丸的组织结构基本正常，没有出现明显的脱落坏死区域。

图11，图12，图13和图14均显示小鼠睾丸组织促炎因子水平的变化情况。LPS刺激小 鼠的睾丸中促炎因子IL-1β，IL-6和TNF-α的mRNA水平和iNOS的蛋白表达水平出现了明 显的增高，硫化氢显著抑制了促炎因子水平的的增高。

图15显示小鼠睾丸组织抗炎因子水平的变化情况。结果表明H₂S不仅抑制了促炎因子水 平的增高，同时大大增加了抗炎的细胞因子IL-10的mRNA水平，提示硫化氢具有显著的抗 炎作用。

图16对小鼠睾丸组织做冰冻切片，进行DHE染色观察小鼠睾丸组织中的活性氧水平。 结果显示LPS引起小鼠睾丸组织中活性氧的水平大量增加，而硫化氢可以显著地抑制活性氧 的增加。

图17对小鼠睾丸组织做石蜡切片，用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）进行染色， 观察生精细胞的凋亡情况，如图所示LPS引起大量生精细胞凋亡，而硫化氢可以显著地抑制 生精细胞凋亡。

图18对小鼠睾丸组织做冰冻切片，利用睾丸组织中构成血睾屏障的主要蛋白occludin、 ZO-1和claudin11进行免疫荧光染色，观察睾丸组织血睾屏障的完整性，结果显示LPS使得 大部分曲细精管中，血睾屏障蛋白的表达强度变弱，环状结构变得不完整，而给予H₂S之后， 尽管血睾屏障的结构不十分清晰，但是基本维持了其完整的环状结构。

图19取小鼠血清，利用商品化的酶联免疫吸附试验（Elisa）试剂盒检测小鼠血清睾酮的 水平，结果显示硫化氢可以显著地抑制LPS引起的血清睾酮水平的降低。