菊芋Na+/H+逆向转运蛋白基因HtNHX1和HtNHX2及其应用

摘要

本发明公开了菊芋Na+/H+逆向转运蛋白基因HtNHX1和HtNHX2及其应用。本发明首次从极度耐盐、耐贫瘠的南菊芋1号中克隆了2个菊芋Na+/H+逆向转运蛋白基因HtNHX1和HtNHX2，其cDNA序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示，通过转基因手段获得了HtNHX1和HtNHX2超表达水稻材料，且与对照野生型相比，HtNHX2转基因水稻材料在长期和短期NaCl胁迫后都具有更大的生物量。同时HtNHX2转基因水稻还具有更强的耐贫瘠能力，表现为在低K+土壤中具有更大的生物量，并能提高水稻单株产量50%以上。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1和HtNHX2及其应用。

背景技术

菊芋(Helianthus tuberosus L.)俗称洋姜，鬼子姜，属于菊科(Compositae family)向日葵属(Helianthus L.)的一种多年生草本植物(Kays and Nottingham,2007)。菊芋是一种集耐贫瘠、耐干旱、抗病虫于一体的能源植物，有着极高的推广应用价值和研究价值除此之外，在滨海及盐渍土地上种植菊芋还能带走土壤中的盐分从而起到一定的脱盐和洗盐的作用，达到改良盐渍土壤的目的(赵耕毛等，2005)。

盐渍化危害是现代农业生产最常见的主要限制因子之一。全世界总共大约2.3亿公顷的灌溉农地中约20%在不同程度上受到灌溉和施肥造成的盐渍化危害(Flowers,1977;Zhu,2002;Flowers,2004)。盐渍化抑制植物生长主要是由Na⁺和Cl-所引起的，而Na⁺是对植物造成离子特异伤害的最初原因(Flowers,1997;Tester and Daven_port,2003;Kronzucker andBritto,2011)。K⁺在植物细胞内浓度可达80-150mM,在作物抗盐中具有非常重要的功能(Carden et al.,2003;Cuin et al.,2003)。在细胞质中，很多酶的活性能被K⁺激活而被Na⁺抑制(Flowers,1977；2004)。控制盐胁迫下作物K⁺/Na⁺离子平衡，尤其是维持地上部高K⁺/低Na⁺的离子平衡，可增加作物的耐盐性(Shabala and Cuin,2008)。植物对盐的适应性存在着明显的差异。除了耐盐的盐生植物，大多数农作物是盐敏感的甜土植物。不同作物和品种耐盐能力均存在非常大的差异，利用现代分子生物技术提高作物耐盐能力已成为现代植物育种工作急需解决的关键问题之一。

拟南芥AtNHX1是克隆出的第一批植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(Apse et al.,1999;Gaxiola et al.,1999)。随后，水稻(Fukuda et al.,1999)、牵牛花(Ohnishi et al.,2005)、葡萄(Hanana et al.,2007)、杨树(Ye et al.,2009)等很多高等植物的液泡Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因相继得到克隆(Rodríguez-Rosales et al.,2009;Jiang et al.,2010)。根据序列相似性和表达部位分析，拟南芥基因组的6个NHX成员分成两组：位于液泡膜的NHX1-4和位于内体(endosomal)的NHX5-6(Pardo et al.,2006;Rodriguez-Rosales et al.,2009;Bassil et al.,2011a,b)。最新研究表明在拟南芥中NHX1和NHX2两者协同通过控制液泡pH和K⁺浓度的稳态平衡调控细胞扩展和花器官发育(Bassil et al.,2011b），而NHX5和NHX6两者可能位于高尔基体(Golgi)和反面高尔基网(trans-Golgi network)，有功能冗余，在trafficking of endosomal cargo to the vacuole、细胞增生(proliferation)和生长、植物抗盐中起重要作用(Bassil et al.,2011a)

在多种生物中克隆的NHX同源基因绝大多数与推测在液泡膜表达的拟南芥AtNHX1基因具有很高的相似性，因此被认为通过Na⁺/H⁺交换在细胞内Na⁺的液泡区隔化方面具有重要功能(Rodríguez-Rosales et al.,2009;Jiang et al.,2010)。植物转基因分析证明这些来自拟南芥、烟草、水稻等不同植物但高度同源的NHX基因具有一定的抗盐效果。然而，也有报道单独过量表达AtNHX1并没有提高拟南芥的抗盐性(Yang et al.,2009)。因此，一方面，目前已克隆的淡土植物NHX基因存在活性不高(相对较低的Na⁺/H⁺转运速率)、耐盐性不强的问题(Xu et al.,2010)，加上植物本身均存在多个内源的NHX基因，因此在很大程度上限制了该基因的应用。另一方面，由于盐敏感植物主要通过质膜上的Na⁺外排，而耐盐植物则主要通过在液泡中积累大量的Na⁺来应对盐胁迫(Flowers,2004;Cuin et al.,2011)，因此有理由期待从高度耐盐植物南菊芋1号中克隆其转运Na⁺活性更高的同源NHX基因。

发明内容

本发明的目的是提供菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1和HtNHX2。

本发明还提供菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1和HtNHX2的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX2，cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，含有所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX2或所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1。

所述的重组表达载体，优选出发载体为pTCK303载体。

所述的重组表达载体，进一步优选是将所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX2或所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1插入到pTCK303载体Sac I和BamH I酶切位点所得。

含有所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX2或所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1的宿主细胞。

所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX2在增强植物耐盐能力，及提高植物在贫瘠土壤中的产量中的应用。

所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX2在培育耐盐且在贫瘠土壤中高产植物中的应用。

所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1在增强植物耐盐能力，及提高植物在贫瘠土壤中的产量中的应用。

所述的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1在培育耐盐且在贫瘠土壤中高产植物中的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明通过同源克隆的方法，首次提供了具有理想耐盐性以及在贫瘠土壤中能够提高作物产量的菊芋Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HtNHX1和HtNHX2。

2.通过荧光定量PCR发现HtNHX1和HtNHX2在叶片中的表达随着NaCl浓度的增加而增加（图1）；

3.对HtNHX1和HtNHX2的亚细胞定位情况进行分析，发现HtNHX1定位在液泡膜，而HtNHX2定位在内膜囊泡（图2）。

4.对HtNHX1和HtNHX2转基因材料进行表达情况（图3）及拷贝数及插入位点鉴定（图4），获得单拷贝且能稳定遗传的转基因水稻株系；HtNHX1和HtNHX2超表达后不但增强了转基因水稻的耐盐能力（图5），而且与对照野生型相比，HtNHX2转基因水稻材料在长期和短期NaCl胁迫后都具有更大的生物量。同时HtNHX2转基因水稻还具有更强的耐贫瘠能力，表现为在低K⁺土壤（1M中性醋酸铵提取的有效钾62mg/kg）中具有更大的生物量，并能提高水稻单株产量50%以上。

附图说明

图1为HtNHX1和HtNHX2在菊芋叶片的表达特征；

图2为HtNHX1和HtNHX2的亚细胞定位结果；

图3为HtNHX1和HtNHX2转基因材料的表达情况，

图4为转基因材料的southern拷贝数的鉴定；其中，WT：野生型，NHX1-1Ox、NHX1-2Ox、NHX1-3Ox和NHX1-4Ox为HtNHX1转基因水稻的不同株系；NHX2-1Ox、NHX2-Ox、NHX2-3Ox和NHX2-4Ox为HtNHX2转基因水稻的不同株系。

图5为HtNHX1和HtNHX2转基因材料与野生型相比耐盐能力显著提高；

图6为HtNHX2转基因材料比野生型水稻在贫瘠土壤中的产量显著提高。

图7pTCK303载体图

图8pSAT6A-EGFP-N1载体图

具体实施方式

实施例1HtNHX1和HtNHX2基因的克隆

⑴以南菊芋1号cDNA作为模板，根据GenBank上已经登录的植物液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因同源序列设计一对简并引物P1和P2；

⑵以200mM NaCl处理24h的菊芋叶片cDNA为模板，通过RT-PCR扩增出大约400bp的片段，

⑶根据测序结果以及Invitrogen公司Gene Racer Kit提供的引物，分别设计两对嵌套PCR引物：5’反向特异性引物P3，巢式引物P4以及3’正向特异性引物引物P5，巢式引物P6通过RLM-RACE法获得了约1190bp的5’端片段和约765bp的3’端片段。经序列拼接后获HtNHX1和HtNXH2cDNA全序列；

⑷通过设计全长序列引物P7及P8，以南菊芋1号cDNA作为模板，PCR分别获得了2129bp（SEQ IDNO.2）和1787bp（SEQ IDNO.1）的片段，序列分析后分别命名为HtNHX1和HtNHX2。基因的引物序列设计如下表：

实施例2HtNHX1和HtNHX2基因在菊芋叶片中表达特征

⑴总RNA的提取；用1/2的Hoagland营养液培养一周后用含不同NaCl浓度的营养液处理24h后，分别取0.1g左右叶片样品提取其RNA；

⑵用反转录试剂盒合成cDNA；

⑶RT-PCR及qRT-PCR；通过对HtNHX1和HtNHX2在菊芋叶片中进行表达分析发现这两个基因在叶片中的表达量均随着NaCl浓度的增加而增大(图1)。

基因的引物序列设计如下表：

实施例3HtNHX1和HtNHX2亚细胞定位情况的分析：

⑴根据HtNHX1和HtNHX2的序列我们设计分别含有相应的酶切位点引物（N-HtNHX F:

5’-ATATAAGCTTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGC-3’（SEQ ID NO.21）；N-HtNHX R:

5’-TTATCCCGGGGTTTCCGGTGGTTTCTTCATC-3’（SEQ ID NO.22）），以含HNHX1或HNHX2基因的

cDNA克隆为模板用高保真酶KOD-Plus进行PCR扩增不含终止密码子的HNHX1或HNHX2的片段。

PCR产物琼脂糖凝胶电泳分别回收纯化后克隆到pEasy-Blunt载体，阳性克隆分别经HindⅢ和

SmaⅠ双酶切后连接到相同酶切的中间载体pSAT6A-EGFP-N1(图8)，分别得到含HtNHX1-GFP和

HtNHX2-GFP基因的pSAT6A-EGFP-N1载体。分别以含HtNHX1-GFP和HtNHX2-GFP基因的

pSAT6A-EGFP-N1载体为模板GFP-HtNHX-F/GFP-HtNHX-R为引物进行PCR扩增，扩增产物

HtNHX1-GFP及HtNHX2-GFP克隆到克隆载体后分别经HindⅢ和SacⅠ双酶切后连接到表达载体pYES2（Invitrigen公司）中，获得重组载体pYES2-HtNHX1-GFP及pYES2-HtNHX2-GFP。同样以pSAT6A-EGFP-N1载体为模板，以GFP-F和GFP-R为引物扩增，扩增产物GFP经HindⅢ和SacⅠ双酶切后连接到表达载体pYES2（Invitrigen公司）中，获得重组载体pYES2-GFP。所用引物序列为

GFP-HtNHX-F:5’-ATATAAGCTTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGC-3’（SEQ ID NO.27）

GFP-HtNHX-R:5’-TTATCCCGGGGTTTCCGGTGGTTTCTTCATC-3’（SEQ ID NO.28）

GFP-F:5’-AGGAGCTCATGAGTAAAGGAGA-3’（SEQ ID NO.29）

GFP-R:5’-CGCCTAGGTTTGTATAGTTCAT-3’（SEQ ID NO.30）。

⑵过乙酸锂转化法将上述构建好的重组载体pYES2-GFP和pYES2-HtNHX1-GFP及pYES2-HtNHX2-GFP分别转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，涂布在不含Ura的SC选择平板上鉴定阳性克隆。

酵母转化方法

①吸取过夜培养的酿酒酵母菌液(不要太浓，处于对数生长期)1mL，于1.5mL离心管中离心，12000rpm，1min，彻底去上清，再用ddH₂O清洗一次；

②加入5uL质粒DNA，用枪头吸打，混匀；

③加入500uL PEG mixture，5uL DTT(1M)，漩涡仪上混匀；

④室温放置15min，45℃热击15min，冰中放置15min；

⑤吸取底部沉淀涂于相应的YNB培养基上，28-30℃培养。

⑶酵母阳性转化子的培养及染色：

①取1mL对数生长期的酵母转化子细胞(OD₆₀₀:0.5～0.8)至1.5mL离心管中；

②②5000g室温离心5min除去上清，后用500μL YPD+1μL FM4-64(保存浓度为8mM)重悬沉淀；

③30℃水浴培养30min后，加入1mL YPD，5000g室温离心5min；

④去除上清，用1mL YPD重悬细胞沉淀，转移至试管中；

⑤加入4mL YPD，30℃震荡培养1.5h～2h；

⑥5000g室温离心5min收集菌体，去上清，用1mL无菌水重悬细胞沉淀；

⑦转移至1.5mL离心管中，5000g室温离心5min；

⑧去除所有的上清，用25uL YNB重悬细胞沉淀；

⑨滴7uL到载玻片上(盖玻片用1:1的刀豆球蛋白/多聚赖氨酸混合液[用移液头部均匀地涂抹并晾干])涂抹，该混合液可以有效地固定酵母细胞)，盖上18mm×18mm的盖玻片(避免气泡产生)后激光共聚焦观察。对HtNHX1和HtNHX2的亚细胞定位情况进行分析，发现HtNHX1定位在液泡膜，而HtNHX2定位在内膜囊泡（图2）。

实施例4HtNHX1和HtNHX2转基因水稻材料的构建。

⑴总RNA的提取，同实施例1；

⑵HtNHX1和HtNHX2总cDNA的合成，同实施例1；

⑶HtNHX1和HtNHX2基因全长的获得及超表达载体的构建：根据HtNHX1和HtNHX2的序列设计分别含有相应的酶切位点引物（overHtNHX1/2-F：5’-GACGGAT CCATGGTGTTTGATATGGGATTAATG-3’，（SEQ ID NO.23）反义链为overHtNHX1/2-R：5’-ATCGAGC TCCTAGTTTCCGGTGGTTTCTTCA-3’（SEQ ID NO.24）），以含HtNHX1和HtNHX2基因的cDNA克隆为模板进行PCR扩增。PCR产物经克隆到pBlunt-Easy克隆载体后分别经Sac I和BamH I双酶切后连接到表达载体连入pTCK303载体（图7），得到Ubi::HtNHX1和Ubi::HtNHX2表达载体pTCK303-HtNHX1和pTCK303-HtNHX2。

⑷HtNHX1和HtNHX2转基因水稻材料的获得：将以上获得的转有pTCK303-HtNHX1和pTCK303-HtNHX2质粒的农杆菌，侵染日本晴水稻愈伤组织，共培养60天，经过选择培养、分化、生根、炼苗得到T₀代转基因植株。

①试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的英文所写缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；Car(羧苄青霉素)；

NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；L-pro(L-脯氨酸)；L-Glu(L-谷氨酰胺)；MES(2-吗啉乙磺酸)；N6(N6大量元素成份溶液);B5(B5微量元素成份溶液);AA(AA大量元素成份);Agar(琼脂)。

②溶液与培养基配方

激素配制方法

水稻组培中激素及抗生素的浓度

水稻组培培养基母液配方

粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(1L用量)

粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基(1L用量)

粳稻共培养培养基(1L用量)

粳稻分化培养基(1L用量)

粳稻生根培养基(1L用量)

悬浮农杆菌侵染愈伤组织的培养基(AAM感菌液，1L用量)

③农杆菌介导的水稻转化

Ⅰ水稻成熟胚愈伤组织的诱导：去皮的水稻种子(一盘14粒)入三角瓶，用体积比70％乙醇浸泡1min(淹没种子)，倒掉体积比70％乙醇，用体积比30％次氯酸钠浸泡30min，然后用灭菌水清洗5-6次直至清亮。用镊子把种子拨到灭菌的滤纸上，吸干水分，最后把日本晴种子置于诱导培养基上，在30℃光照培养箱培养20-30d。

Ⅱ农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌(EHA105)菌液100μL于4mL YEP(含50mg/L Kan和50mg/L Str)培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD₆₀₀为0.8～1.0。

Ⅲ感菌共培养：取培养好的菌液500μL于1.5mL离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200μmol/L As的30mL AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD₆₀₀的终浓度为0.01-0.05；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5min；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30～40min；将愈伤组织置于共培养基上，25℃暗培养2.5d；

Ⅳ选择：将愈伤组织取出，用无菌水清洗5～6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/L羧苄青霉素(Car)的无菌水清洗1～2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2h；将晾干的愈伤转入含500mg/L羧苄青霉素和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃光照培养14d；将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/L羧苄青霉素和80mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到长出颗粒性的抗性愈伤组织。

Ⅴ抗性愈伤组织的诱导分化和生根：在超净台上挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中(每瓶放置5～7颗)，用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗(25～30d)。待苗长至2～3cm左右，放入生根培养基中壮苗。

Ⅵ转基因苗移栽：转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出(苗长至试管顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3d～7d左右，然后洗去琼脂，移栽到水稻全营养液中生长，检测。

④转基因苗的检测：

Ⅰ潮霉素筛选：准备生根后经过清洗的水稻苗，取完好的转基因水稻叶片(叶片颜色正常)0.8～1.5cm放到含有筛选培养基的培养皿中。同时将没有转基因的叶片做为阴性对照，将经过鉴定的阳性苗叶片作为阳性对照。在光照培养箱内倒置培养48h后观察处理情况：叶片变黄、枯萎的是假阳性植株；而颜色不变的叶片是阳性苗。

ⅡPCR扩增潮霉素筛选方法：采用微量DNA提取(TPS法)方法，提取DNA。以所提DNA为模板，进行PCR检测。潮霉素引物为HYG-F:5’-ATCTTAGCCAGACGAGCG GG-3’，（SEQ ID NO.25）HYG-R:5’-ACACAGCCATCGGTCCAGAC-3’（SEQ ID NO.26）。提取转基因植株DNA(GUS已经检测为阳性的苗)，以DNA为模板进行PCR扩增。产物大小为589bp。

ⅢGUS检测：含有将准备好的材料浸泡在染液里，37℃保温过夜，染出蓝色的即为阳性苗。

⑤转基因苗的分子鉴定：

提取转基因材料不同株系叶片的总RNA，反转录总cDNA，进行RT-PCR鉴定(总RNA的提取，总cDNA的合成，RT-PCR方法同实施例1)，得到转HtNHX1基因阳性株系NHX1-1Ox、NHX1-2Ox、NHX1-3Ox、NHX1-4Ox及转HtNHX2基因阳性株系NHX2-1Ox、NHX2-2Ox、NHX2-3Ox、NHX2-4Ox。(图3)。对T₂代几个表型明显株系进行了Southern拷贝数鉴定，结果见图4，可见获得单拷贝且能稳定遗传的转基因水稻株系。

⑥转基因苗的生理鉴定：

分别将HtNHX1和HtNHX2转基因水稻株系种子和野生型日本晴水稻种子消毒后，放置添0mMNaCl或200mM NaCl的1/2MS固体培养基中，黑暗培养至种子萌发后移至光下生长，观察转基因水稻株系及野生型水稻的生长情况，结果显示HtNHX1和HtNHX2超表达后不但增强了转基因水稻的耐盐能力（图5）。

实施例6产量数据的获得

实验地点为海南乐东县，田间土壤的测定数据为：有机质6.8g/kg；全氮0.52g/kg；全磷0.29g/kg；速效钾62mg/kg，属于贫瘠土壤。水稻种植时间为2012年12月～2013年5月，实验材料为日本晴水稻野生型和HtNHX1和HtNHX2T₂代转基因材料，具体实验实施过程如下：

⑴催芽：白天水泡，清水冲洗后，晚上风晾干；第二天再水泡，清水冲洗后，晚上包起来保暖。⑵播种：催芽1天后种子部分露白后播种。不能淹水，发芽后也不能淹水，直到1叶1心期(播种10天)。

⑶育秧肥料施用

注释：种植小区与密度

10株乘以6行，株距15cm，行距20cm，4月30日收获，单株收获，晒干后称重计算单株产量，结果见图6和表1。

从表1可以看出HtNHX2超表达材料比野生型产量提高50％以上。

表1.HtNHX2转基因水稻与野生型水稻单株产量差异